CC BY
7«ШУУШШШИМ-ЛШИГМаУ» #И24)), ЖШ / BIOLOGICAL SCIENCES
9
BIOLOGICAL SCIENCES
УДК: 579.61:577.15
Никитина З. К., Гордонова И. К., Насибов Э. М.
ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР), Москва DOI: 10.24412/2520-6990-2022-1124-9-12 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОДИФИЦИРОВАННЫХ БЕЛКОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГРИБОВ
Nikitina Z. K., Gordonova I. K., Nasibov E. M.
All-Russian research Institute of medicinal and aromatic plants, Moscow
THE USE OF MODIFIED PROTEINS TO EVALUATE THE COLLAGENOLYTIC ACTIVITY OF
FUNGI
Аннотация.
Целью настоящей работы являлся поиск новых продуцентов коллагеназ с использованием модифицированного и немодифицированного коллагена. Показано, что все изученные микромицеты росли на среде Чапека с заменой сахарозы на нативный и модифицированный коллаген. Однако в последнем случае скорости роста всех культур были ниже. Кроме того, на модифицированном белке не на всех этапах культивирования и не у всех культур образовывались зоны лизиса, с соответствующими снижениями индексов лизиса. Полученные результаты позволили выбрать культуры с наибольшей гидролитической активностью.
Abstract.
The purpose of this work was to search for new collagenase producers using modified and nonmodified collagen. It was shown that all the studied micromycetes grew on the medium of Chapek with the replacement of sucrose with native and modified collagen. However, in the latter case, the growth rates of all crops were lower. In addition, lysis zones were not formed on the modified protein not at all stages of cultivation and not in all cultures, with corresponding decreases in lysis indices. The results obtained made it possible to select the culture with the highest hydrolytic activity.
Ключевые слова мицелиальные грибы, коллаген, коллагенолитическая активность, поверхностное культивирование
Keywords: mycelia fungi, collagen, collagenolytic activity, surface cultivation
Поиск продуцентов коллагеназ представляет несомненный интерес для различных областей жизнедеятельности человека. Указанные ферменты могут использоваться в медицинской практике, косметологии, пищевой промышленности [1-4]. Ранее нами были разработаны подходы, позволяющие осуществлять поиск продуцентов коллагеназ и разработать методы их выделения[5]. Использование при скрининге модифицированных субстратов, обладающих повышенной устойчивостью к протео-лизу, является дополнительным критерием при отборе потенциальных продуцентов [6,7]. Целью работы являлся поиск новых продуцентов коллагеназ с использованием модифицированного и немоди-фицированного коллагена.
Культуры Penicillium brevicompactum F 37 и 49, P. camemberti F 45, P. martensii F 63 выращивали на скошенной поверхности агаризованной среды Чапека следующего состава (%): NaNO3 - 0,2; KH2PO4 - 0,1; MgSO4 x 7H2O - 0,05; KCl - 0,05;
FeSO4X 7H2O - 0,001; CaCOs - 0,3; сахароза - 2; агар
- 2, (рН 6,8) в течение 7-ми суток в термостате при 260С. Для проведения поверхностного культивирования использовали агаризованные среды, содержащие солевой фон среды Чапека с заменой сахарозы на 2% нативный и модифицированный коллаген, полученный так, как это было описано нами ранее [6]. Протеолитическую способность микроорганизма оценивали по их скорости роста на соответствующих субстратах. Активность биосинтеза ферментов оценивали по индексу лизиса (Илиз): Илиз = Д^л /Д^к, где Дл - диаметр зоны лизиса, Дк
- диаметр колонии.
Статистическую обработку результатов проводили на персональном компьютере с помощью пакета статистических программ Microsoft Office Excel 2010. Данные на рисунках представлены в виде средних значений и стандартных ошибок среднего по 12 измерениям.
10
ВЮЬОвГСАЬ 8С1Б1ЧСБ8 / «ШУШШШМ-ЛШдамак» 2022
Рис. 1. Скорость радиального роста микромицетов на среде с нативным (А) и модифицированным (Б) коллагеном
Известно, что рост микроорганизмов на субстратах, содержащих нерастворимые белки в качестве единственного энергетического источника, позволяет судить об их потенциальной протеолити-ческой активности. Появление зон лизиса белков вокруг колоний является показателем секреции ферментов в окружающую среду. В связи с этим на первом этапе исследования фиксировались диаметры колоний и диаметры зон лизиса при культивировании микромицетов на средах с заменой сахарозы на коллаген или модифицированный коллаген.
Можно видеть, что грибы хорошо росли на средах с коллагеном, при этом скорости роста
обычно не менялась в процессе культивирования (рис. 1А). Исключение составлял один из штаммов Р. Ьгвугсвтрас^т Б 49, у которого наблюдалось некоторое снижение указанного показателя на 23% к концу культивирования.
При введении в среды модифицированного формальдегидом коллагена, обладающего повышенной устойчивостью к протеолизу [7], скорость роста всех культур снижалась (рис. 1Б). При этом у двух штаммов Р. ЬгвугсвтраСит минимальные скорости отмечались на начальном этапе культивирования, затем они повышались, свидетельствуя о постепенной адаптации культур к росту на трудно гидролизуемом субстрате.
«ШУШМУМ-ЛШИГМаУ» #И24)), 2022 / BIOLOGICAL SCIENCES
11
Рис. 2 Средние скорости роста микромицетов на средах с нативнът (нк) и модифицированным (мк) коллагеном
Средние за время культивирования скорости роста (рис. 2) на нативном коллагене не отличались у двух штаммов P. brevicompactum F 37 и F 49. У двух других представителей рода Pénicillium указанный показатель был ниже на 23%. При росте на модифицированном коллагене средние скорости роста снижались. Величина снижения составляла от 50 до 16%, изменяясь в следующем ряду: F 49 > F 37 > F 45= F 63.
Индекс лизиса является интегральным показателем, который характеризует способность куль-
туры секретировать ферменты, гидролизующие соответствующий субстрат. Указанный показатель определяется соотношением площади колонии и площади зоны лизиса и пропорционален удельной протеолитической активности культуры, так как площадь колонии пропорциональна ее биомассе, а площадь зоны лизиса - активности секретируемых протеиназ. В связи с этим на следующем этапе исследования были рассчитаны индексы лизиса мик-ромицетов при росте на средах, содержащих натив-ный и модифицированный коллаген (рис. 3).
37
49 45
№ штамма
63
7 суток культивирования
Рис. 3. Индексы лизиса микромицетов в процессе культивирования на средах с нативным (А)
и модифицированным (Б) коллагеном
12
BIOLOGICAL SCIENCES / «ШУУШШШМ-ЛШдамаИ» ЖШ
В процессе проведенного исследования выявлено, что у всех микромицетов индексы лизиса были существенно ниже при росте на модифицированном белке. При этом у P. brevicompactum Б 49 отсутствовали видимые зоны лизиса на модифицированном коллагене, и индексы лизиса на нативном субстрате были очень небольшими. Следует отметить, что индексы лизиса менялись в относительно небольшом интервале от 1,0 до 3,3. Сравнительно
Средние индексы лизиса, рассчитанные за все время культивирования, на нативном коллагене менялись в следующем ряду: P. martensii Б 63 = P. brevicompactum Б 37 > P. camemberti > P. brevicom-pactum Б 49. Средний индекс лизиса P. martensii Б 63 был статистически значимо выше (р > 0,95) этого же показателя у трех других культур. Таким образом, микромицет P. martensii Б 63 обладал более высокой гидролитической активностью при росте на модифицированном коллагене и может рассматриваться в качестве потенциального продуцента коллагеназ.
Выводы
Комплексное изучение диаметров колоний, зон лизиса и индексов лизиса при поверхностном культивировании четырёх микромицетов, относящихся к роду PeniciШum, на средах с нативным и модифицированным коллагеном показало, что наибольшим протеолитическим потенциалом обладает культура P. martensii Б 63. Указанная культура перспективна для дальнейшего изучения в качестве продуцентов коллагеназ.
Список литературы
1. Можина Н.В., Руденская Г.Н. Коллагеноли-тические ферменты патогенных микроорганизмов // Биомедицинская химия. 2004. Т. 50. №6. С. 539553.
2. Антипова Л.В., Подвигина Ю.Н., Косенко И.С. Применение ферментных препаратов в техно-
высокий индекс лизиса отмечался у P. martensii и P. brevicompactum Б 37. При росте на средах с натив-ным коллагеном индекс лизиса превышал указанный показатель у двух других микромицетов на 7 сутки культивирования в 1,8 - 3,0 раза. При росте на модифицированном белке индекс лизиса менялся в значительно более узком интервале от 1,0 до 1,9.
логии производства мясных изделий // Современные проблемы науки и образования. - 2008. - № 6. - С. 134-135.
3. Иванкова Ю.О., Абисалова И.Л., Локарев А.В. Морфологическая оценка эффективности мазей, содержащих фермент коллагеназу, на термический ожог в эксперименте. // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 8 (часть 2) - С. 466-469.
4. Hamzeh Alipour, Abbasali Raz, Sedigheh Zakeri, Navid Dinparast Djadid Therapeutic applications of collagenase (metalloproteases): A review. // Asian Pac. J. Trop. Biomed. - 2016. - V - №.11. - P. 975-981.
5. Сухосырова Е.А., Никитина З.К., Яковлева М.Б., Быков В.А. Секреция коллагенолитических ферментов некоторыми видами дейтеромицетов// Технология живых систем. 2003. №4. С. 29-33.
6.Яковлева М.Б., Зон Х.Ч., Никитина З.К., Быков В.А. Рост и синтез внеклеточных ферментов некоторыми видами дейтеромицетов, культивируемых на различных белковых субстратах // Вопросы биол., медиц. и фармацевтич. химии. - 2009. №1. С. 6-10.
7. Gordonova I.K., Nikitina Z.K. Search of proteinases secreting deuteromyces. Materials of the X International research and practice conference "Science, Technology and Higher Education", Canada, April 2829. 2016. P.111-118.
