CC BY
29
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА И КЛИНИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
Кандидат мед. наук А.А. Вотинцев, доцент Е.В. Новичков ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГИСТОСПЕКТРОФОТОМЕТРИИ ПРИ УСТАНОВЛЕНИИ ПРОГНОЗА СЕРОЗНОГО
ОВАРИАЛЬНОГО РАКА У ПАЦИЕНТОК РАЗНОГО ВОЗРАСТА Кировская государственная медицинская академия
Занимая по рангу заболеваемости 3-е место среди онкогинекологической патологии, рак яичников считается одной из самых фатальных локализаций гинекологического рака [11]. Ежегодно в мире регистрируется 166 тысяч злокачественных новообразований яичников и 101 тысяча смертей от них, в России
- 11,7 тыс. и 7,3 тыс. соответственно [4].
М.Е РаШа11а [10] полагает, что в течение жизни рак яичников разовьется у одной из 70 новорожденных девочек, причем каждая двадцатая погибнет в течение первого года с момента установления диагноза. По частоте выявления новых случаев карцином придатков матки доминируют Скандинавские страны
- 2%, промежуточное место занимает США и самый низкий уровень заболеваемости в Японии. Главное в том, что заболеваемость и смертность от рака яичников в разных странах мира имеют тенденцию к увеличению. По сведениям Министерства здравоохранения РФ (2001), показатель заболеваемости злокачественными неоплазмами женских гонад за последнее десятилетие возрос в России на 8,5%. Рак яичников является очень коварным заболеванием. К сожалению, на современном уровне развития медицинской науки у нас далеко не всегда есть возможность диагностировать рак яичников на I и II стадии заболевания, когда лечебные мероприятия были бы наиболее эффективны. Это касается не только нашей страны, но и всех развитых в экономическом отношении стран, где только у четверти женщин подобное заболевание выявляется на I и II стадиях. В 70% вновь выявленных случаев диагностируется распространённая стадия онкологического заболевания [15]. По данным долгосрочного прогнозирования, в двухтысячные годы подобная карциноматозная тревожная обстановка будет сохраняться, причём одновременно будут возрастать и показатели смертности, поэтому указанная проблема приобретает также большое социальное значение [8].
По мнению большинства исследователей, к благоприятным факторам прогноза рака яичников следует относить следующие клинические и морфологические показатели: возраст до 45 лет; снижение генеративной функции (отсутствие беременностей или малое количество родов); отсутствие в анамнезе сопутствующих гинекологических заболеваний - таких как лейомиома матки и железистая дисгормональная
гиперплазия эндометрия; Ia или Ib стадия рака, серозный, муцинозный или эндометриоидный гистологический тип высокой степени дифференцировки; размер опухоли до 20 см с сохранением целостности капсулы (целостность капсулы играет большую прогностическую роль, чем размер опухоли); отсутствие асцита; низкая митотическая активность карцинома-тозных клеток; преобладание в опухолевом узле клеточного элемента над стромальным [6, 5, 2, 7].
По мнению зарубежных исследователей, морфологические особенности карциномы у женщин разного возраста не имеют большого значения при прогнозе овариального рака. Среди значимых критериев признаются только стадия заболевания, количество курсов проведённой химиотерапии и гистологический тип новообразования [14]. Исходя из этого очевиден высокий процент прогрессирования опухолевого роста в отдельных возрастных группах даже на фоне проводимой противораковой медикаментозной терапии. Так, N.F. Hacker и соавт. и T.J. Herzog объясняют этот факт резистентностью неоплазмы, обусловленной отсутствием детализированного патологогистологического описания опухоли, в том числе наличия клеточных рецепторов, через которые осуществляется взаимодействие химиопрепарата с клеткой-мишеньюю. Ясно, что недостаток сведений о биологических особенностях опухоли, в свою очередь, не позволяет выбрать правильную схему лечения [12, 13].
Целью проведённого исследования явилось установление прогностического значения содержания нуклеиновых кислот в клетках серозного рака яичников у женщин с сохранённой и утраченной генеративной функцией.
Материалы и методы
Материалом настоящего исследования послужили гистологические препараты операционно-биопсийного материала 222 больных серозными злокачественными новообразованиями яичника Ic-IV клинических стадий (FIGO, 1976). Использовались амбулаторные карты, операционные журналы, клинические истории болезни и парафиновые блоки патоморфологических лабораторий.
Все женщины с первичными карциномами женских гонад подвергались хирургическому лечению (экстирпация матки с придатками и резекцией сальника). У всех пациенток отсутствовала противораковая предоперационная терапия. Послеоперационное лечение представляло собой химиотерапию в сочетании с гормонотерапией по известной онкологической схеме. В нашей работе методы лечения первичного рака яичника не учитывались.
Клиническая стадия опухоли у больных определялась по Международным классификациям TNM (1997) и FIGO (1976). Степень гистологической дифференцировки опухоли устанавливалась по критериям A.C.Broders (1926) [9].
Для анализа количества нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) в ядрах и цитоплазме клеток первич-
ных серозных неоплазм яичника ставилась реакция Браше. Микрофотометрическое изучение гистологических срезов, окрашенных метиловым зелёным - пи-ронином G, проводилось с использованием системы фотометрического анализа MpvBio (Leica GmbH, 1998), совмещённой с микроскопом Leica Leitz DMRX со спектральным анализатором Leica MPV-SP. Строго учитывали требования к сравнительной гистоспек-трофотометрии: стандартная толщина гистологических срезов (5 мкм), предметных и покровных стёкол; одновременная окраска всех сравниваемых срезов; одинаковые для всех измерений условия освещения и пороги яркости измеряемых объектов [4].
Фотометрирование ДНК и РНК осуществлялось в 1000 опухолевых клеток при увеличении гистологического препарата в 900 раз. Содержание нуклеиновых кислот высчитывалось в условных единицах оптической плотности (у.е.) и равнялось коэффициенту поглощения длины волны 500 нм для РНК и 650 нм для ДНК. Подразделение рибонуклеиновой кислоты на виды нами не учитывалось.
Плоидометрию опухолевых клеток рака женских гонад осуществляли при окраске микропрепаратов по методу Фельгена посредством компьютерного анализатора изображений Quantimet 500 C+ QWin (Leica Cambridge Ltd., 1998), совмещённого с микроскопом Leica REICHERT POLIVAR 2 с план-объективом FI APO 40х/0,30 на монохроматичном светофильтре длиной волны 570 нм. При стандартизованной окраске по методу Фельгена содержание ДНК в ядрах клеток точно соответствует количеству энергии монохроматического луча (570 нм), поглощённой красителем, связавшимся с молекулами ДНК. Для получения "тканевого стандарта плоидности" [3] в тех же гистологических срезах определяли среднюю интегральную яркость ядер малых лимфоцитов, которая соответствует параплоидному набору хромосом (2с). Вычисляя плоидность ядер исследуемых эпителиальных клеток рака яичников в единицах "с", средние показатели интегральной яркости ядер делили на половину указанного тканевого стандарта [1].
Полученные в ходе исследования результаты подвергнуты автоматизированной обработке с помощью специализированных статистических пакетов SPSS 10.0 с функциональными приложениями. Зависимость между признаками оценивали по коэффициенту корреляции (r), его ошибке (m) и уровню значимости (p), которые высчитывались с помощью метода непараметрической корреляции Спирмена. Применялись непараметрические методы изучения достоверности разницы величин Крускала-Уоллиса и Манна-Уитни.
Результаты исследования и их обсуждение
Согласно проведённому исследованию серозную злокачественную неоплазму яичника достоверно отличают такие фотометрические параметры: уровень оптической плотности ядра - 0,16±0,052 у.е.; количество РНК - 0,13±0,032 у.е.; отношение инд. РНК/инд. ДНК - 0,89±0,346.
Для уточнения диагностического и дифференциально-диагностического значения спектрофотометрических характеристик опухолевой клетки, ядра и их взаимоотношения указанные параметры определялись с учётом возрастной группы заболевших. Полученные результаты представлены на рисунке 1.
Данные рисунка 1 свидетельствуют о том, что карциномы яичников, развивающиеся у женщин в климактерическом периоде или постменопаузе, отличаются достоверно большим содержанием ДНК в ядрах опухолевых клеток в сравнении с неоплазмами, поражающими фертильных женщин (0,17±0,012 у.е. против 0,14±0,029 у.е., р = 0,045). Также констатиру-
ется более высокое содержание рибонуклеиновой кислоты при одновременном снижении индекса отношения РНК/ДНК, однако эти отличия не имеют статистической значимости. Следует отметить, что нарастание количества РНК при одновременно высокой оптической плотности ядра раковых клеток может свидетельствовать о более агрессивных свойствах такого опухолевого эпителия и обусловливать худший прогноз у старых женщин.
Для более детальной характеристики фотометрических особенностей овариального рака указанные параметры определялись с учётом степени гистологической дифференцировки серозной карциномы (табл. 1).
Таблица 1
)ЛО080±02Й Дифференцировки (М±ш)
Таблица 2
Содержание нуклеиновых кислот в клетках серозного рака яичников при прогнозе рецидивирования
у женщин разных возрастных групп
Минимальное среднее значение оптической плотности ядер клеток опухолей исследуемой группы регистрировалось при низкой степени гистологической дифференцировки овариального рака, демонстрируя при этом максимальную вариабельность содержания ДНК (табл. 1), что обусловлено резко выфаженныш ядерным атипизмом. Наибольшее количество нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) установлено в клетках умереннодифференцированных серозных неоплазм женских гонад, тем самым указывая на преобладание в опухолевом узле эпителия в синтетическую (8) фазу клеточного цикла. Особого внимания заслуживает динамика изменений соотношения нуклеиновых кислот (РНК/ДНК). Отмечается статистически значимое (р = 0,047) нарастание этого показателя по мере увеличения степени гистологической злокачественности, объясняя инвазивные свойства раковых клеток.
Оценивая значение гисто-спектрофотометричес-ких параметров опухоли в прогнозе возможного ре-цидивирования серозной овариальной карциномы, получили сведения, приведённые в таблице 2.
Из таблицы 2 явствует, что риск развития рецидива серозного рака яичников во всех возрастных группах повышается при нарастании содержания в раковом эпителии нуклеиновых кислот. В то же время у молодых женщин с сохранённой фертильностью прогностически достоверно значимым показателем в плане рецидивирования следует рассматривать пока-
затель содержания РНК, который значимо выше в группе рецидивирующих неоплазм (0,14±0,021 у.е. против 0,11±0,023 у.е., р = 0,040). Напротив, у женщин в климактерическом периоде и постменопаузе статистическую достоверность в прогнозе возобновления опухолевого роста показывает оптическая плотность ядра, которая составила 0,16±0,022 у.е. в раке, не склонном к рецидивированию против 0,19±0,033 у.е. в рецидивирующих карциномах (р = 0,045). Примечательно, что в старшей возрастной группе пик повторного роста приходится на возраст 64,3 г., в то время как у более старших женщин риск возобновления неопластического процесса снижается.
На рисунке 2 представлено содержание нуклеиновых кислот, отражающее взаимосвязь между их количеством и возрастом пациенток, поражённых серозным раком яичников. При изучении коэффициентов корреляции нами установлено, что у заболевших более старшего возраста в раковом эпителии констатируется большее количество как ДНК, так и РНК.
Нами выявлена прямая умеренная зависимость количества ДНК в опухолевой клетке от возраста больных (коэффициент корреляции г = 0,575, р = 0,046). Вместе с тем регистрировалась положительная слабая корреляция между индексом рибонуклеиновой кислоты и возрастной группой пациенток (г = 0,304, р = 0,05).
В последнее время одним из доступных и информативных способов оценки уровня клеточного ати-пизма и степени злокачественности неоплазмы считается морфометрический метод определения плоид-ности ядер эпителиальных опухолевых клеток. Он основан на гистоспектрофотометрическом анализе содержания ДНК в их ядрах с использованием гистологических препаратов, окрашенных по методу Фель-гена. Интерфазное ядро клетки (в фазе покоя) содержит двойной набор хромосом (плоидность равна 2с). В синтетической фазе клеточного цикла количество ДНК удваивается (плоидность равна 4с), и лишь за-
тем клетка вступает в фазу митоза. Таким образом, превышение средних показателей плоидности опухолевых клеток выше значений 2с отражает пролиферативную активность и степень клеточного атипизма в исследуемой ткани [1].
На основании проведённого исследования установлено, что серозная злокачественная неоплазма яичника характеризуется плоидностью ядер раковых клеток в пределах 4,69±1,351 с.
Результаты компьютерной плоидометрии ядер клеток рака яичников в исследуемых группах представлены на рисунке 3.
Рис. 3. Средние значения плоидности ядер эпителиальных клеток рака яичников у молодых женщин и пациенток в постменопаузе
4,5
]до 55 лет
□ старше 55 лет
Плоидность, с
4,93
4,32
5
4
Выявлено, что средняя плоидность ядер клеток карциномы яичника у молодых пациенток достоверно (р = 0,042) отличается от показателей, характеризующих рак женских гонад, возникающий у женщин, утративших репродуктивную функцию (рис. 3). Так, в первой группе показатель плоидности составил 4,5±0,12 с, что было значимо выше, чем в группе пожилых пациенток (4,1±0,09 с). Полученные сведения убеждают, что для злокачественных эпителиальных неоплазм яичника специфичны значения плоидности, превышающие паратетраплоидный набор (более 4с).
Для уточнения значения плоидности опухолевых клеток при серозном раке женских гонад мы оценили изменение Чнй^енййЭГоГЬ йоказмеяй к °ависимости плотности ядра в сравнении с плоидностью овариального рака у
пациенто кСоэффшкиевт втовдасаш ядер карцино
от возраста пострадавших женщин. Результаты представлены в таблице 3.
Из таблицы 3 явствует, что клетки неоплазм, диагностированных у пожилых больных, показывают меньшие значения плоидности в сравнении с новообразованиями у фертильных женщин. Этот факт позволяет сделать заключение о закономерном снижении уровня пролиферативной активности и анэупло-идии в более старших возрастных группах пострадавших. В то же время следует заметить, что показатель плоидности в возрастной группе 51-55 лет был наименьшим и составил 4,0 с. Нами установлена отрицательная корреляционная зависимость между возрастом пациенток и плоидностью ядер раковых клеток, при этом коэффициент корреляции составил -0,319 (р=0,035).
Таблица 3
м яичника у женщин разного возраста
5)61-65 лет
6) 66-70 лав о зпаст
И нд . Д Н К 7)У1адце 70 лет ^ ГГ тт и д н о с ть . с
Достоверность, р =
4,5±0,26
5,1±0,31
4,1±0,16
4,2±0,11
0,05
Анализ рисунка 4 показывает, что у более старых пациенток на фоне увеличения оптической плотности ядра происходит снижение плоидности неопластических клеток. Этот феномен можно объяснить накоплением в ядрах клеток ракового эпителия неактивной (балластной) ДНК, которая не играет роли в пролиферации опухоли.
Заключение
Таким образом, показатель оптической плотности ядра и цитоплазмы раковой клетки является ценным критерием при изучении биологического поведения злокачественной серозной неоплазмы и определении индивидуального прогноза для больных первичным раком женских гонад. Плоидность ядер опухолевых клеток следует рассматривать как важный прогностический параметр, который можно использовать как изолированно, так и в комплексе с другими морфологическими характеристиками новообразования.
Список литературы
1. Автандилов Г.Г. Методика плоидометрии в диагностике стадий новообразований. Методические рекомендации. - М.: РМАПО, 2005 - 12 с.
2. Бахидзе Е.В. Сохранение фертильности у больных начальным раком яичников // Материалы научно-практической конференции "Новые подходы к скринингу, диагностике и лечению опухолей яичников". - Великий Новгород - Санкт-Петербург. - 2001. -С. 79.
3. Гундорова Л.В., Автандилов Г.Г., Саниев К.Б., Зайратьянц О.В. Морфометрическая диагностика предрака и рака предстательной железы по данным исследования плоидности // Архив патологии. - 2003.
- №4. - С.46-50.
4. Злокачественные новообразования в России и странах СНГ в 2001 г./ Под. ред. М.И. Давыдова, Е.М. Аксель. - Медицинское информативное агентство,
2003. - С. 293.
5. Карселадзе А.И. Некоторые проблемы клинической морфологии эпителиальных опухолей яичников // Практическая онкология. - 2000. - №4. - С. 1418.
6. Орлова Р.В. Современное стандартное лечение больных раком яичников // Практическая онкология.
- 2000. - №4. - С. 42-44.
7. Урманчеева А.Ф. Современная химиотерапия рака яичника // Практическая онкология - 2002. - Том 3, №4. - С.295-304.
8. Awada A., Klastersky J. Ovarian cancer: state of the art and future directions // Eur. J. Gynaecol. Oncol. -
2004. - Vol. 25 (6). - P. 673-676.
9. Broders A.C. Carcinoma: Grading and practical application // Arch. Pathol. - 1926. - Vol.2 (1). - P. 376380.
10. Fathalla M.F. Contraception and women's health // Br. Med. Bull. - 1993. - Vol.49 (1). - P. 245-251.
11. Greenlu R.T., Murray T. et al. // Cancer statistics
- 2000. - Vol. 4 (2). - P. 108.
12. Hacker N.F., Friedlander M. Treatment of recurrent ovarian cancer // Chang. Gung. Med. J. - 2004.
- Vol. 27 (8). - P.570-577.
13. Herzog T.J. Recurrent ovarian cancer: how important is it to treat to disease progression, // Clin. Cancer. Res. - 2004. - Vol. 10 (22), №15. - P. 7439-7448.
14. Hoskins P. Factors predictive of survival after first relapse or progression in advanced epithelial ovarian carcinoma: a prediction tree analysis-derived model with test and validation groups / P. Hoskins, D. Tu, K. James et al. // Gynecol. Oncol. - 1998. - Vol. 70 (2). - P. 224230.
15. Kurian A.W. Histologic types of epithelial ovarian cancer: have they differ risk factors? / A.W. Kurian, R.R. Balise, V. McGuire, A.S. Whittemore // Gynecol. Oncol.
- 2005. - Vol. 96, №2. - P. 520-530.
Summary A.A. Votintsev, E.V Novichkov THE USE OF HISTOSPECTROPHOTOMETRY METHOD IN DEFINITION OF PROGNOSIS FOR OVARIAN CANCER AT DIFFERENT AGE PATIENTS Kirov state medical academy
The aim of current study was to detect morphological parameters as nucleic acids and tumor ploidy had significance in prognosis of serous form ovarian cancer at patients with saved reproductive function and in old women. The operative biopsy materials from 222 patients with serous ovarian cancer Ic-IV clinical stage (FIGO) were examined. Histospectrophotometrical measurements were performed with systems of analysis MpvBio (Leica GmbH, 1998) and Quantimet 500 C+ QWin (Leica Cambridge Ltd., 1998). Serous ovarian carcinoma in young women as compared with patients in menopause and postmenopausal periods differs by smaller values of both DNA and RNA content but higher tumor ploidy. The optical density of cell nuclei correlates with patient age. The obtained data can be used in definition and substantiation of individual prognosis at women with serous ovarian cancer in different age.
