CC BY
21
УДК 618.811-006.6-033.2-037
Е.В. Новичков, А.А. Вотинцев
ЗНАЧЕНИЕ ГИСТОСПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ
ОПУХОЛИ
В ПРОГНОЗЕ МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ СЕРОЗНОЙ ОВАРИАЛЬНОЙ
КАРЦИНОМЫ
Актуальность исследования
Вся сложность проблемы рака яичников заключается в особенностях этиологии и патогенеза опухолей этого органа, в уникальности самой эндокринной природы яичника и его роли в жизнедеятельности женского организма. Многокомпонентное строение гонад и сочетание структур самых разных функциональных направлений обусловливают широчайший спектр гистологических форм новообразований этого органа. Если же принять во внимание ещё и переходные формы, а также опухоли, в которых сочетаются два и более гистологических типа, то количество вариантов новообразований яичников возрастает в геометрической прогрессии.
Актуальны работы, посвященные проблеме оценки содержания ДНК в ядрах опухолевых клеток рака яичников [2, 4]. K. Sahni и соавт. (1989) [9], проанализировав 81 случай распространённой карциномы яичников, пришли к выводу, что нет зависимости между количеством ДНК и выживаемостью пациенток, однако, анэуплоид-ные клетки преобладают в низкодиффе-ренцированных новообразованиях женских гонад. Эти сведения противоречат сообщениям [11], в которых показана большая продолжительность жизни у больных с диплоидным набором хромосом в опухолевой ткани. I.V. Panichenko и со-авт. (2002) [7], оценив содержание ДНК и
плоидность эпителиальных клеток овари-альных карцином с использованием проточной цитометрии, выявили увеличение уровня анэуплоидии в неоплазмах с коротким безрецидивным периодом, в то время как диплоидные разновидности отличались хорошим прогнозом. К подобному заключению приходят [3], указывая на тот факт, что у больных с анэуплоидными опухолями выше частота рецидивирования и короче продолжительность клинической ремиссии.
Интересные данные получены E. Erba и coaвт. [5], которые применяли метод проточной цитфлоуриметрии при раке яичников. Они пришли к выводу, что стадия заболевания и плоидность связаны между собой: при III и IV стадиях опухоли чаще имели анэуплоидное содержание ДНК. Индекс ДНК также связан со степенью дифферен-цировки опухоли. К этому мнению присоединяются и другие авторы, подчёркивая то, что процентное содержание клеток в S-фазе цикла существенно выше в анэуплоидных опухолях, по сравнению с диплоидными [6, 10].
T.J. Yin и соавт. (2002) [12] определили прогностическое значение содержания ДНК в комплексе с площадью, периметром и форм-фактором ядра опухолевой клетки, исследуя паренхиматозную ткань в 110 резецированных неоплазмах яичников. Анализируемые параметры достоверно отличались у пациенток с доброкачественными, пограничными и злокачественными
новообразованиями. В то же время установлено, что больные с высоким содержанием ДНК и с анэуплоидными опухолями попадают в группу с весьма худшим прогнозом, чем с диплоидными. Статистическая обработка подтвердила, что содержание ДНК имеет существенное прогностическое значение при первичных карциномах яичников.
Изучение состава ДНК при помощи проточной цитометрии в сочетании с имму-ногистохимическими маркерами апоптоза в опухолевых клетках используется для предсказания развития рецидива овариального рака. Так, [11] указывают на возможность прогноза возобновления опухолевого роста при многофакторном анализе с учётом количества ДНК и стадии заболевания у 78 % женщин. Одновременно с этим содержание ДНК рассматривается как независимый фактор прогноза выживаемости больных.
В последнее время одним из доступных и информативных способов оценки уровня клеточного атипизма и степени злокачественности неоплазмы считается морфометрический метод определения плоидности ядер эпителиальных опухолевых клеток. Он основан на гистоспектро-фотометрическом анализе содержания ДНК в их ядрах с использованием гистологических препаратов, окрашенных по методу Фельгена. Интерфазное ядро клетки (в фазе покоя) содержит двойной набор хромосом (плоидность равна 2 с). В синтетической фазе клеточного цикла количество ДНК удваивается (плоидность равна 4 с), и лишь затем клетка вступает в фазу митоза. Таким образом, превышение средних показателей плоидности опухолевых клеток выше значений 2 с отражает пролиферативную активность и степень клеточного атипизма в исследуемой ткани [1].
Материалы и методы
Для анализа количества нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) в ядрах и цитоплазме клеток первичных серозных неоплазм яичника все гистологические срезы окрашивались метиловым зелёным - пиро-нином G. Использовалась система фотометрического анализа MpvBio (Leica GmbH, 1998) под управлением Windows 98 Second Edition на базе компьютера Intel Pentium III, совмещённая с микроскопом Leica Leitz DMRX со спектральным анализатором Leica MPV-SP. Строго учитывали требования к сравнительной гистоспектрофотометрии: стандартная толщина гистологических срезов (5 мкм), предметных и покровных стёкол; одновременная окраска всех сравниваемых срезов; одинаковые для всех измерений условия освещения и пороги яркости измеряемых объектов. Измерение осуществлялось в 1000 опухолевых клеток при увеличении гистологического препарата в 900 раз. Измерение проводилось в режиме «2-lambda method» для длины волны 500 и 650 нм видимого спектра с определением коэффициентов поглощения («Absorbance») и пропускания («Trans-mittance») монохроматичного света. Содержание нуклеиновых кислот высчиты-валось в условных единицах оптической плотности (у.е.) и равнялось коэффициенту поглощения длины волны 500 нм для РНК и 650 нм для ДНК. Подразделение рибонуклеиновой кислоты на виды нами не учитывалось. В последующем определялись взаимосвязи между содержанием хроматина в ядрах, количеством РНК в цитоплазме раковых клеток и развитием метастаза.
Плоидометрию опухолевых клеток рака женских гонад осуществляли при окраске микропрепаратов по методу Фельгена посредством компьютерного
анализатора изображений Quantimet 500 C+QWin (Leica Cambridge Ltd., 1998), совмещённого с микроскопом Leica REICHERT POLIVAR 2 с план-объективом FI APO 40 х/0,30 на моно-хроматичном светофильтре с длиной волны 570 нм. Для получения «тканевого стандарта плоидности» [1] в тех же гистологических срезах определяли среднюю интегральную яркость ядер малых лимфоцитов, которая соответствует парадип-лоидному набору хромосом (2 с). Вычисляя плоидность ядер исследуемых эпителиальных клеток рака яичников в единицах «с», средние показатели интегральной яркости ядер делили на половину указанного тканевого стандарта.
Полученные в ходе исследования результаты были подвергнуты автоматизированной обработке с использованием специализированного статистического пакета SPSS 10.0. Применяли непараметрические статистические методы. Для определения значимости различий между двумя группами использовали U-критерий Манна-Уитни, между несколькими группами - Н-критерий Крускала-Уоллиса.
Результаты исследования
Для установления фотометрических особенностей, характерных для новообразований, склонных к опухолевой прогрессии (метастазированию), все 222 случая карцином яичников были поделены на 2 группы:
1) неоплазмы без метастазов (74 случая);
2) рак яичника с наличием опухолевых депозитов в других органах и тканях (148 наблюдений).
В дальнейшем все гистологические препараты, окрашенные по методу Браше, были подвергнуты фотометрическому анализу. Полученные в ходе исследования результаты представлены в табл. 1. При анализе содержания дезоксирибонуклеи-новой кислоты в ядрах неопластических клеток наибольшие значения выявлены в условиях метастазирования карциномы в другие органы и ткани (0,16±0,053 у.е., р=0,562), а отношение индексов нуклеиновых кислот констатировалось статистически незначимо ниже (0,85±0,234, р=0,203).
Для более точного установления роли фотометрических критериев в прогнозе метастатического процесса мы уточнили значение индексов нуклеиновых кислот в раковом эпителии в соответствии со степенью гистологической дифференцировки серозной карциномы женских гонад. Результаты сведены в табл. 2, 3 и 4
Таблица 1
Гистоспектрофотометрические характеристики эпителиальных клеток овариального рака серозного гистологического типа с учётом наличия вторичных опухолевых очагов
Показатель Исследуемая группа Р
без метастазов с метастазами
Индекс РНК, у. е. 0,13±0,034 0,13±0,039 0,718
Индекс ДНК, у. е. 0,15±0,039 0,16±0,053 0,562
Инд.РНК/ 'Инд. ДНК 0,94±0,264 0,85±0,234 0,203
Таблица 2
Содержание ДНК и РНК в метастазирующих и неметастазирующих высокодифференцированных серозных карциномах яичника
Параметр Исследуемая группа Р
без метастазов с метастазами
Индекс РНК, у. е. 0,12±0,032 0,13±0,024 0,434
Индекс ДНК, у. е. 0,14±0,036 0,18±0,054 0,107
Инд.РНК/ 'Инд. ДНК 0,83±0,255 0,74±0,168 0,626
Таблица 3
Содержание ДНК и РНК в метастазирующих и неметастазирующих умеренно дифференцированных серозных карциномах яичника
Параметр Исследуемая группа Р
без метастазов с метастазами
Индекс РНК, у. е. 0,15±0,030 0,12±0,040 0,157
Индекс ДНК, у. е. 0,16±0,029 0,17±0,048 0,679
Инд.РНК 'Инд. ДНК 0,99±0,236 0,75±0,205 0,053
Таблица 4
Содержание ДНК и РНК в метастазирующих и неметастазирующих низкодифференцированных серозных карциномах яичника
Параметр Исследуемая группа Р
без метастазов с метастазами
Индекс РНК, у. е. 0,12±0,027 0,14±0,043 0,578
Индекс ДНК, у. е. 0,13±0,053 0,15±0,054 0,409
Инд.РНК 'Инд. ДНК 0,99±0,305 0,90±0,242 0,650
При анализе содержания дезоксири-бонуклеиновой и рибонуклеиновой кислот в неопластических клетках констатировались схожие тенденции вне зависимости от степени дифференцировки. Наибольшие значения ДНК и РНК выявлены в метастазирующих карциномах (исключением являлось снижение РНК в опухолях средней степени дифференцировки), а отношение индексов нуклеиновых кислот констатировалось статистически незначимо ниже.
Анализ гистоспектрофотометриче-ских характеристик злокачественных серозных новообразований яичников с учётом распространения на брюшину, большой сальник, плевру и печень представлен в табл. 5.
Анализируя данные табл. 5, можно отметить, что с переходом процесса метаста-зирования на следующий этап возрастают
как уровень ДНК, так и уровень ДНК, одновременно с этим соотношение нуклеиновых кислот снижается. Однако полученные результаты оказались статистически недостоверными.
При изучении плоидности ядер раковых клеток серозной овариальной карциномы установлен средний показатель 4,69±1,351 с. Для уточнения диагностического и дифференциально-диагностического значения плоидометрических характеристик опухолевого ядра указанные параметры определялись с учётом степени гистологической дифференцировки серозного рака (табл. 6).
Примечание : 1 ПЖ - продолжительность жизни, мес.
Таблица 5
Гистоспектрофотометрическая характеристика эпителия метастазирующих овариальных карцином в зависимости от локализации раковых депозитов
Локализация метастазов Индекс РНК, у. е. Индекс ДНК, у. е. Инд.РНК/ 'Инд.ДНК ПЖ1, мес.
Брюшина 0,12±0,035 0,11±0,035 1,10±0,034 24,0±11,31
Большой сальник 0,14±0,039 0,19±0,059 0,76±0,172 21,6±18,01
Плевра 0,14±0,030 0,18±0,058 0,80±0,140 13,7±9,61
Печень 0,14±0,048 0,18±0,093 0,87±0,251 16,8±10,75
Р1-4 0,713 0,253 0,234 0,627
Р1,2 0,425 0,089 0,037 0,768
Р1,3 0,155 0,121 0,053 0,180
Таблица 6
Средняя плоидность ядер опухолевых клеток злокачественных серозных новообразований яичника в зависимости от степени гистологической дифференцировки (М±т)
Исследуемый параметр Степень гистологической дифференцировки Р
высокая умеренная низкая
Плоидность, с 4,25±1,329 4,93±1,186 4,68±1,500 0,187
ПЖ, мес. 34,3±24,03 26,5±21,11 18,8±16,86 0,486
Примечание : ПЖ - продолжительность жизни, мес.
Наибольшее среднее значение показателя плоидности ядер клеток опухолей исследуемой группы регистрировалось при умеренной степени гистологической диф-ференцировки овариального рака. В то же время максимальную вариабельность указанного параметра демонстрировали неоплазмы высокой степени гистологической злокачественности (см. табл. 6), что обусловлено резко выраженным ядерным атипизмом в этой группе.
Выявлено, что средняя плоидность ядер клеток карциномы яичника с высоким риском развития метастазов достоверно (р=0,04) отличается от показателей, характеризующих неметастазирую-щий рак женских гонад (рисунок). Так, в
первой группе показатель плоидности составил 4,9±0,14 с, что значимо выше, чем при неметастазирующем раке (4,3±0,08 с). Полученные сведения убеждают, что для злокачественных эпителиальных неоплазм яичника специфичны значения плоидности, превышающие па-ратетраплоидный набор (более 4 с). Одновременно новообразования с раковыми депозитами показывают максимальные значения плоидности, что свидетельствует о выраженной пролиферативной активности и нарастании клеточного ати-пизма в них.
Рис. Среднее значение плоидности ядер эпителиальных клеток рака яичников в исследуемых группах
Выводы
Таким образом, увеличение количества нуклеиновых кислот в клетках серозного рака яичников может свидетельствовать о повышении риска развития опухолевых депозитов и закономерно возрастает с каждым дальнейшим этапом метастазирова-ния, с одновременным снижением индекса соотношения нуклеиновых кислот. Изолированная оценка фотометрических параметров опухолевых клеток при прогнозе возможного метастазирования, на наш взгляд, недопустима, но должна применяться в комплексе с клиническими, мор-фометрическими, гистохимическими и иммуногистохимическими маркерами заболевания.
Напротив, плоидометрия раковых клеток является современным, высокоинформативным, легковоспроизводимым и достоверным методом диагностики опухолевой прогрессии злокачественных новообразований женских гонад. Повышение значений показателя плоидности ядер клеток серозной овариальной карциномы свидетельствует о возрастании клеточного атипизма, уровня катаплазии неоплазмы и развитии метастазов.
Библиографический список
1. Автандилов Г.Г. Методика плоидо-метрии в диагностике стадий новообразо-
ваний: Метод. рекомендации. / Г.Г. Автандилов. - М.: РМАПО, 2005. - 12 с.
2. Колосов А.Е. Опухоли яичников и прогноз для больных: Руководство для врачей.
/ А.Е. Колосов.- Киров, 1996. - 240 с.
3. Проточная цитометрия в диагностике, оценке эффективности лучевой терапии и комбинированного лечения рака яичников и матки / О.Д. Буторина, В. Л. Винокуров, А. С. Ягунов и др. // Скрининг и новые подходы к лечению начального гинекологического рака. - СПб., 1994. - С. 30.
4. Effect of cellular DNA content on the prognosis of epithelial ovarian cancers / S. Ozalp, O.T. Yalcin, Z. Gulbas et al. // Gynecol. Obstet. Invest. - 2001. - Vol.52.- №2. - P. 9397.
5. Flow cytometric analysis of DNA content in human ovarian cancers / E. Erba, P. Uberzio, S. Pepe et al. // Br. J. Cancer. -1989. - Vol.60 (1). - P. 45-50.
6. Immunostaining and DNA flow cy-tometry as prognostic factors in epithelial ovarian cancers / R. Henriksen, P. Strang, F. Backstrom
et al. // Anticancer Res. - 1994. - Vol.14. -№28. - P. 603-608.
7. Zhordaniia K.I. Laser DNA flow cy-tometry in patients with ovarian epithelial tumors / I.V. Panichenko, V.N. Bogatyrev, V.P. Kozachenko // Klin. Lab. Diagn. - 2002. -№4. - P. 48-51.
8. Prognostic value of DNA quantification in early epithelial ovarian carcinoma / J.J. Val-
verde, M. Martin, J.A. Garcia-Asenjo et al. // Obstet. Gynecol. - 2001. - Vol.97.- №3. -P.409-416.
9. Sahni K. Flow cytometric measurement of ploidy and proliferation in effusions of ovarian carcinoma and their possible prognostic significance / K. Sahni, B. Tribukait, N. Einhorn // Gynecol. Oncol. - 1989. -Vol.35.- №2. - P.240-245.
10. Steroid hormone receptors and flow cytometric DNA ploidy in ovarian carcinoma / S.E. Grenman, P. Klenii, S. Foikkanen. et al. // Ann. Chir. Gynaecol. - 1994. - Vol.83 (208). - P. 15-19.
11. Volm M. Flow-cytometric prognostic factors for the survival of patients with ovarian carcinoma: a 5-year follow-up study / M. Volm, W. Kleine, A. Pfleider // Gynecol. Oncol. - 1989. - Vol.35.- №1. - P. 84-89.
12. Yin T.J. Diagnosis and prognosis of ovarian epithelial tumor with morphometry / T.J. Yin, M.J. Gu // Ai Zheng. - 2002. -Vol.21.- №7. - P. 781-784.
E.V. Novichkov, A.A. Votintsev
SIGNIFICANCE OF HISTOSPECTROPHOTOMETRIC PARAMETERS OF TUMOR IN PROGNOSIS OF SEROUS OVARIAL CARCINOMA
The aim of investigation was to reveal significance of nucleic acid content in the cells of ovarian serous carcinoma and their nuclear ploidy in prognosis of possible carcinoma metastasizing. Operative-biopsy material taken from 222 patients with serous carcinoma of female gonads was investigated. Photometric study of nucleic acid amount (DNA and RNA) was conducted with Brashe's methyl green-pyronin G staining of preparations by means of Mpv Bio system (Leica GmbH, 1998) and ploidometry of tumoral cells with Felgen's staining of micro-preparations by computer image analyzer Quantimet 500 C+QWin (Leica Cambridge Ltd., 1998). Increase in the amount of nucleic acids of ovarian serous cancer cells demonstrates growth of risk of metastases development. Ploidometry of carcinoma cells is a modern, highly informative, easily reproduced and reliable diagnostic method of tumoral progression of female gonad malignant neoplasms.
Keywords: female gonads, nucleic acid, ovarian serous carcinoma, nuclear ploidy.
Кировская государственная медицинская академия
Материал поступил в редакцию 06.04.2006
