Использование газожидкостной хроматографии при химическом анализе азалептина Текст научной статьи по специальности «Прочие медицинские науки»

© П.Ю.Лукьянчиков, 2004 УДК 340.6

П.Ю.Лукьянчиков ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ПРИХИМИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ АЗАЛЕПТИНА

Городское бюро судебно-медицинской экспертизы (нач. бюро - И.И. Вахрушев) г. Набережные Челны

Азалептин (лепонекс, клозапин) по химической структуре относится к производным дибензодиазепина, обладает сильной нейролептической активностью в сочетании с седативным действием [3]. Рассмотрим возможность использования газожидкостной хроматографии (ГЖХ) при химическом анализе данного лекарственного средства в органах трупа.

06.07.2002 года на судебно-химическую экспертизу были доставлены внутренние органы (желудок с содержимым, печень, почка, отрезок тонкого кишечника) от трупа А. 1980 г.р. с целью определения наличия нейролептиков. В обстоятельствах дела указано, что «труп обнаружен в лесу, рядом находились упаковки от таблеток «Азалептин», имеется предсмертная записка».

Химическое исследование проводилось по двум направлениям: нативному соединению и продуктам гидролиза. Нативное вещество извлекалось из 100г объекта водой, подкисленной 2 н раствором хлористоводородной кислоты (HCl) до рН 1,0 по универсальному индикатору, настаиванием дважды в течение 2 часов при соотношении экстрагент - объект (2:1) [2]. Объединённую раздельно для органов кислую вытяжку центрифугировали, прозрачную жидкость экстрагировали хлороформом 3 раза по 20 мл сначала из кислого раствора, затем после подщела-чивания до рН 9,0-10,0 25% раствором гидроксида аммония - из щелочного. После фильтрования через безводный сульфат натрия щелочное извлечение доводилось до 50 мл в мерной колбе. Гидролиз навесок органов (25г) проводился на глицериновой бане при 140°С с обратным холодильником в течение часа с двукратным количеством 6н раствора HCl [2]. После доведения рН среды до 8,0 с помощью 50% раствора гидроксида натрия гидролизаты извлекались смесью хлороформ - изоамиловый спирт (100:1) дважды порциями по 25 мл. Объединённые раздельно для органов извлечения фильтровались через безводный сернокислый натрий и доводились до 50 мл. Количественное определение азалептина и продуктов его гидролиза осуществлялось на газовом хроматографе «Кри-сталлюкс-4000» с пламенно-ионизационным детектором (программа NetChrom V1.5). Условия разделения: колонка капиллярная ВИТ0КАП-ЛЬ-0,2; материал колонки -кварц алюмини-рованный, фаза VS-1 (иммобилизованная SE-30); длина колонки 25 м, внутренний диаметр 0,23 мм, толщина пленки фазы 0,2мкм. Температура колонки +240°С, испарителя +250°С, детектора ПИД +250°С. Расход газа-носителя гелия: газ 1-20 см3/мин, газ 2-30 см3/мин, газ 3-30 см3/мин; водорода-25 см3/мин, воздуха-250 см3/мин. Перед введением пробы в колонку хроматографа экстракт подвергался очистке. Методика исследования: по 5,0 мл извлечений желудка, печени, почки и кишечника, полученных по двум направлениям исследования, разбавленных хлороформом до 10 мл, раздельно промывалось 10 мл буферного раствора с pH 9,0 (0,05 М калий фосфатный буфер) и подвергалось реэкстракции 6 мл 0,2 н раствора ацетата натрия с pH 1,0 (1-2 капли ледяной уксусной кисло-

ты). Водная фаза доводилась до pH 9,0 с помощью 3,5мл 0,75 М раствора карбоната натрия [1] и экстрагировалась 10мл смеси хлороформ-изоамиловый спирт (100:1). Органический слой переносился во флакон из стеклодрота ёмкостью 14 мл, выпаривался досуха в токе теплого воздуха. Остаток растворялся в 0,2 мл (200 мкл) 96° этанола. По 2 мкл спиртовых растворов объектов отбиралось микрошприцом и вводилось в испаритель хроматографа. В результате на хроматограммах всех исследуемых аликвот извлечений органов отмечался пик с абсолютным временем удерживания 28,76-28,83 мин. в зависимости от количества вещества в пробе (рис.1).

Детектор - ПИД

Рис 1. Хроматограмма: 2мкл спиртового раствора щелочного извлечения из печени после гидролиза (модельная смесь).

По аналогичной методике исследовались стандартные растворы азалептина с концентрацией 0,125; 0,3125; 0,5125; 1,25; 2,5 мг/мл с содержанием вещества в пробе (2 мкл) соответственно 0,25; 0,625; 1,25; 2,5; 5 мкг. По полученным площадям пиков (соответственно 1,269; 4,034; 10,468; 15,309; 31,838 мв*мин.) строился калибровочный график, по которому находили количество вещества (К) в мг в исследуемой пробе. Если площадь пика не укладывалась в полученный диапазон, использовалось разведение соответствующего спиртового раствора.

Расчёт содержания азалептина проводился по формуле:

К хГ XV х Р х100

Сп/ извл. спирт.

мг % =-----------------------

Аизвл. Х Аспирт. Х Аб/м

К - содержание азалептина в мг, Уизвл. - общий объём хлороформного извлечения, Успирт. - общий объём спиртового раствора, Р - его разведение, Аизвл., Аспирт., Аб/м -навески соответственно хлороформного извлечения, спир-

Таблица 1

Определение концентрации азалептина

по площади пика

Объект исследования объект после гидролиза Площадь пика, мв*мин Кмг Р С мг% Соотнош. 2-х извл. % выхода вещества

желудок 21,87 0,00345 2 6,90 0,12

22,75 0,00362 4 57,92

печень 12,12 0,00168 - 1,68 0,11

25,31 0,00400 - 16,0

почка 22,68 0,00360 - 3,6 0,16

17,42 0,00278 2 22,24

кишечник 22,71 0,00361 2 7,22 0,12 -

23,53 0,00372 4 59,52

печень (модельная смесь) 13,52 0,00204 - 2,04 0,135 4,1

23,69 0,00377 - 15,08 30,2

тового раствора и биоматериала. Параллельно проводились опыты с модельными смесями. Исследовалась печень с добавлением азалептина из расчёта 50 мг на 100 г объекта. Результаты исследований отражены в таблице 1.

Приведённые в таблице данные показывают, что при извлечении азалептина подкисленной водой выход вещества составляет 11-16% от количественных значений, полученных при его анализе после гидролиза биоматериала с HCl. При исследовании модельной смеси данное соот-

ношение подтвердилось. Количество найденного после гидролиза азалептина (30,2% от добавленного в печень) даёт возможность сделать заключение о приемлемости использования ГЖХ для количественного определения данного лекарственного средства при анализе трупного материала на газовом хроматографе "Кристаллюкс-4000" с ПИД при достаточно большом его содержании в биоматериале. Чувствительность метода составляет 0,1 мг/мл. Предел обнаружения - 0,3 мг азалептина в 100 г печени.

Литература

1. Еремин С.К., Изотов Б.Н., Веселовская Н.В. Анализ наркотических средств. Руководство по химико-токсикологическому анализу наркотических и других одурманивающих средств. М., 1993. - С.148.

2. Изотов Б.Н. Химико-токсикологический анализ биологических объектов на транквилизаторы. Сборник научных трудов: Достижения в области фармацевтического и химико-токсикологического анализа. М: ММА, 1991. 111-125 с.

3. Машковский М.Д. Лекарственные средства. 10-е изд. М: "Медицина". 4.1. - 67 с.

© A.B. Кузнецова, В.А. Осьминкин, С.Г Пояркин, 2004 УДК 616-079.6+613.166.9+616-053.32

А.В. Кузнецова, В.А. Осьминкин, С.Г Пояркин К ВОПРОСУ СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ПЕРЕОХЛАЖДЕНИЯ У ДЕТЕЙ

ГУЗ «Бюро судебно-медицинской экспертизы» Удмуртской Республики (нач. бюро - В.И. Жихорев);

Одной из актуальных проблем судебно-медицинской науки и практики является диагностика летальных исходов от переохлаждения [10]. В структуре насильственной смерти переохлаждение составляет до 7,2% [3,11,12]. В РФ за 2002г. данный показатель 7,8% [8], в Удмуртской республике - 9,5% [9]. Общее переохлаждение новорожденных, детей грудного и раннего детского возраста судебно-медицинской практике встречается не часто. Это объясняется необходимостью постоянного ухода за ними [2,5].

Сообщение о 3 случаях смерти новорожденных от переохлаждения есть в работе А.И. Крюкова в 1911 году [4]. Диагностике смерти от переохлаждения новорожденных посвящена диссертация Н.А. Одесской [6]. В трудах М.И Авдеева имеются сведения о смерти новорожденных от охлаждения, как одной из причин детоубийства [1]. В этих работах дана характеристика отдельных диагностических критериев этого вида смерти.

Два летальных исхода детей раннего возраста от переохлаждения представлены в диссертационном исследовании В.А. Осьминкина [7]. Пострадавшие 1,5; 3 лет. При этом дана оценка имеющимся диагностическим тестам данной нозологии, наиболее полно рассмотрены гистомор-фологические изменения легких.

Процессы теплоотдачи у детей выше чем у взрослых, это связано с большей поверхностью тела на единицу массы, более высокой интенсивностью кожного кровотока, тонкостью подкожно-жирового слоя, повышенной отдачей тепла через легкие. Это приводит, в условиях неблагоприятного температурного окружения, к быстрому темпу переохлаждения. Отсутствие сократительной реакции гладких мышечных клеток сосудов и волосяных фолликулов кожи, быстрое истощение энергоресурсов мышц, участвующих в сократительном термогенезе на холодо-вое воздействие у детей раннего возраста [2, 5], морфо-фун-кциональная незрелость органов и систем, может так же оказать влияние на формирование диагностических тестов при переохлаждении ("гусиная кожа", бледность кожных покровов, поза зябнущего человека и др.).

Доступные литературные источники не имеют сведений об особенностях диагностики смерти от переохлаждения детей грудного возраста. В связи с чем, мы приводим практическое наблюдение.

Ребенок 4 месяцев, обнаружен мертвым, 1.06.2003 г. на земле, рядом с родителями, находящимися в состоянии алкогольного опьянения. Температура окружающей среды + 8о С. На нем была одежда: чепчик, 2 распашонки, ползунки из хлопчатобумажной ткани.

Судебно-медицинское исследование трупа (выписка из акта №1712 от 2.06.2003г) показало: кожные покровы физиологической окраски, трупные пятна бледно-розовые, расположены на заднебоковых поверхностях тела и конечностей, легкие выполняют плевральные полости, эмфизе-матозно вздуты, края их прикрывают область средостения. Ткань легких на разрезах с преобладанием розовых оттенков. С поверхности разрезов стекает небольшое количество розовой жидкости с пузырьками воздуха. Желудок сокращен, на вершинах складок единичные, точечные кровоизлияния темно-коричневого цвета, легко смываемые струей воды. Полнокровие внутренних органов.

При судебно-химическом исследовании (акт №5011 от

4.06.2003 г.) "_в крови от трупа этиловый алкоголь не

найден".

Выписка из акта вирусологического исследования №№1281 -1285 от3.06.2003 г. "....при исследовании мазков с мягкой мозговой оболочки, трахеи, главных бронхов, легких вирусов гриппа А1, А2, А3, В, парагриппа не обнаружено".

Судебно-гистологическое исследование (выписка из акта №3669 от 20.06.2003 г.): системный ангиоспазм, легкие - спазм бронхов, бронхиол не резко выражен, эпителиальный пласт преимущественно сохранен на базальной мембране, утолщен, секреторные клетки его и белково-слизистые железы подслизистой основы заполнены секретом умерено - транспортный блок, ядра вытянуты, формируются "фигуры колосьев", очаговая эмфизема, расстройство кровообращения на микроциркуляторном уровне, "калориферный эффект" капилляризации самых дистальных