CC BY
289
УДК 637.1.068
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЕНАТУРИРУЮЩЕГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАЧЕСТВА ПИТЬЕВОГО МОЛОКА*
А.Ю. ПРОСЕКОВ, доктор технических наук, профессор,
О.О. БАБИЧ, кандидат технических наук, руководитель научно-образовательного центра
О.В. МУДРИКОВА, аспирант
Кемеровский технологический институт пищевой промышленности
E-mail: mudrikovaov@mail.ru
Резюме. Изучена возможность применения денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле для определения качества пастеризованного цельного молока. Установлено, что в пастеризованном молоке содержание казеинов уменьшается на 3,23. ..19,05 %, сывороточных белков - на 10,87.23,60 %, в восстановленном снижается число фракций казеина, в частности отсутствует к-ка-зеин, а также количество сывороточных белков молока, большинство фракций которых отсутствует.
Ключевые слова. молоко, пастеризованное цельное молоко, электрофорез, восстановленное молоко.
Производство и реализация фальсифицированной и контрафактной продукции наряду с намеренным введением потребителя в заблуждение относительно свойств и происхождения продуктов может наносить прямой ущерб здоровью людей и способствует недобросовестной конкуренции на продовольственном рынке. Кроме того, в последние годы становится все более актуальной проблема ложной или вводящей в заблуждение маркировки пищевых продуктов. Неправильные и необоснованные заявления изготовителей при этикетировании продукции могут касаться существенных композиционных характеристик, пищевой ценности или экономических показателей продовольствия, то есть непосредственно затрагивать сферу безопасности и законных прав потребителей [1].
Основные положения по процедуре установления подлинности и выявлению фальсификации молока и продуктов его переработки приведены в Федеральном законе от 12.06.2008 г. № 88-ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию» (статьи 24-26, 36), в котором также представлены основные понятия, определяющие различия между питьевым молоком и молочным напитком [2].
Для контроля качества молока специалисты Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека согласно [1] используют метод эксклюзионной жидкостной хроматографии высокого давления белков его водорастворимой фракции [3], основанный на различиях составов сывороточных белков в сыром и сухом термообработанном молоке. Однако этот метод трудоемок и требует дорогостоящего оборудования, что сказывается на конечной стоимости анализа. Поэтому разработка новых методов определения содержания восстановленного молока в молочных напитках -актуальная проблема.
Цель нашей работы - доказательство целесообразности использования денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле при определении содержания восстановленного молока в цельном пастеризованном.
*Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы»
Для ее достижения решались следующие задачи: выбор условий для наилучшего разделения белков молока при проведении денатурирующего электрофореза; качественное и количественное определение фракционного состава белков различных видов молока.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили в лаборатории Научно-образовательного центра, созданного при ГОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности».
Объект исследования - сырое цельное, пастеризованное цельное и пастеризованное восстановленное молоко, а также смесь цельного и востановленного пастеризованного молока (1:1). Пастеризацию молока проводили в лабораторных условиях на экспериментальной установке при температуре 85±1°С в течение 10±1 с.
Молекулярно-массовое распределение белков оценивали с помощью белкового электрофореза методом Лэм-ли [3]. В ходе исследования использовали ячейку для электрофореза PROTEAN II xi. Разделение белков осуществляли в денатурирующем полиакриламидном геле (12 % разделяющий и 4 % фокусирующий) с 0,1 % SDS-Na. Форез проводили на однократном электродном буфере с добавлением 0,1 % SDS-Na при 15 мА. Гель окрашивали 0,2 % красителем Кумасси R250 (приготовленным на ледяной уксусной кислоте) при повышенной температуре в течение 7...10 мин, затем трижды отмывали дистиллированной водой.
Просмотр и фотографирование гелей проводили на УФ-трансиллюминаторе TCP-20M. Сохранение и обработку данных осуществляли с помощью гель-документирующей системы «Doc-It LS» (версия 6).
Перед началом электрофореза молоко инкубировали в присутствии додецилсульфата натрия, который образует отрицательно заряженные комплексы с белками. Дополнительная обработка белков мекаптаном, восстанавливающим дисульфидные связи, приводит к полному разрушению белок-белковых комплексов. В этом случае единственный фактор, который может повлиять на подвижность белка в полиакриламидном геле, - его молекулярная масса [3].
Калибровку геля проводили, используя набор белковых маркеров производства SibEnzyme, содержащий 12 высокоочищенных рекомбинантных белков с молекулярной массой от 10 до 250 кДа, которые после проведения электрофореза в полиакриламидном геле и фиксации Coomasie Brilliant Blue R-250, образуют дискретные полосы. Для количественной оценки содержания фракций сывороточных белков проводили калибровку по белкам сывороточного альбумина человека с известными концентрациями. Аппроксимацию калибровочной зависимости выполняли полиномом третьего порядка при коэффициенте корреляции равном 1,0.
Определение общего белка проводили по методу Дюма, основанному на измерении теплопроводности молекулярного азота, образующегося после сжигания анализируемого образца при температуре около 1000 °С в атмосфере кислорода и последующего восстановления всех образующихся оксидов азота при помощи восстанавливающего агента, с использованием анализатора белкового азота RAPID N Cube.
Полученные данные подвергали стандартной статистической обработке на персональном компьютере INTEL __ Достижения науки и техники АПК, №02-2010
25 кДа
20 кДа
15 кДа
м а б в г
Рис. 1. Электрофорез в полиакриламидном геле (12 % разделяющий и 4 % фокусирующий): м - маркер; а - цельное молоко; б - пастеризованное цельное молоко; в - посте-ризованное восстановленное молоко; г - постеризованное цельное и восстановленное молоко в соотношении 1:1.
PENTIUM 4 с использованием программных продуктов «Doc-It LS» (версия 6), «Rapid N».
Результаты и обсуждение. Содержание общего белка в цельном молоке составляет 4,16 г/100 мл, в восстановленном - 3,56 г/
100 мл, в смеси пастеризованного цельного и восстановленного молока - 3,85 г/
100 мл. В соответствии с [4], так как все эти значения превышают 2,6 г/100 мл, изучаемые продукты можно отнести к питьевым.
Результаты денатурирующего электрофореза (см. рисунок) показывают, что число фракций белков в восстановленном молоке меньше, чем в сыром и пастеризованном цельном.
Проведение денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле с меркаптаном позволяет разделять казеиновую фракцию на as1-, as2-, /5- и к-казеины. Усовершенствование методики дало возможность разделять а-лакталь-булин и в-лактоглобулин, а также другие сывороточные белки. Изучение фракционного состава казеинов и сывороточных белков различных видов молока показало незначительное снижение содержания всех фракций белков после пастеризации. Наибольшим изменениям при этом подвергались сывороточные белки. Так, количество лак-тоферрина уменьшилось на 12,5 %, сывороточного альбумина - на 13,43, в-лактоглобулина - на 10,87, а-лакталь-
булина - на 23,6 % (см. табл.). В тоже время содержание а^-казеина снизилось на 3,23 %, ^-казеина - на 3,48, а2-казеина - на 4,65 и только к-казеина - на 19,05 %.
Такая ситуация связана с тем, что казеин достаточно термоустойчивый белок. Для его коагуляции необходима выдержка молока при температуре 130°С в течение 2...88 мин. Однако неоднократная тепловая обработка при сушке молока изменяет состав и структуру казеинаткальций-фосфатного комплекса. От него отщепляются защитные гликомакропептиды, органический фосфор и кальций; на поверхности мицелл казеина осаждаются денатурированный у8-лактоглобулин, коллоидный фосфат кальция и др. Перечисленные изменения вызывают как дезагрегацию, так и агрегацию мицелл казеина, что в итоге приводит к уменьшению количества его фракций. Например, согласно результатам наших исследований в восстановленном молоке и в его смеси с пастеризованным цельным (1:1) отсутствует к-казеин.
Денатурация большинства сывороточных белков молока начинается при сравнительно низких температурах нагревания - в интервале 62...78°С.
Потери сывороточных белков молока происходят в разной степени на каждой стадии термообработки молока. При увеличении температуры они резко возрастают, что снижает биологическую ценность продукта.
В пастеризованном восстановленном молоке наблюдается общее уменьшение содержания всех фракций сывороточных белков. В молоке, прошедшем неоднократную тепловую обработку, - отсутствуют иммуноглобулины, сывороточный альбумин и минорные белки (лактофер-рин, церулоплазмин).
Содержание сывороточных белков от общего количества белков в питьевом молоке составляет 16,85 %, в пастеризованном восстановленном - 5,57 %, в пастеризованной смеси цельного и восстановленного (1:1) - 8,31 %.
Таким образом, анализируя результаты денатураци-
онного электрофореза по фракционному составу и содержанию сывороточных белков относительно общего количества белков можно судить о добавлении восстановленного молока в цельное.
Выводы. Полученные результаты свидетельствуют о том, что денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле дает возможность определять наличие восстановленного молока в цельном. Представленный метод имеет такие преимущества как простая про-боподготовка и отсутствие потребности в дорогостоящем оборудовании. В перспективе он позволит количественно определять содержание восстановленного молока в цельном.
Таблица. Массовое распределение белков молока в различных образцах
Название белка Концентрация белка, г/ 1GG г молока
цель- ное пасте- ризо- ванное смесь пастеризованного и восстановленного (1:1) пастеризованное восстановленное
Лактоферрин 0,096 0,084 не обнаружен не обнаружен
Сывороточный альбумин 0,067 0,058 не обнаружен не обнаружен
а^-казеин 1,24 1 ,20 1,92 1,99
в-казеин 1,15 1,11 1,27 1,08
as2 казеин 0,43 0,41 0,34 0,32
К казеин 0,42 0,34 не обнаружен не обнаружен
в-лактоглобулин 0,46 0,41 0,32 0,30
a-лактальбулин 0,089 0,068 не обнаружен не обнаружен
Литература.
1. МУ4.1.4.2.2484-09. Методические указания по оценке подлинности и выявлению фальсификации молочной продукции. Методические указания - Введ. 2009-02-11.- М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. - С. 28
2. Российская Федерация. Законы. № 88-ФЗ Технический регламент на молоко и молочную продукцию. Федеральный закон -Введ. 2008-06-12.- Правовая система «КонсультантПлюс», 2009. - С. 105
3. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. Практическое пособие.- М.: Наука, 1981. - С. 288
4. ГОСТР 52090-2003. Молоко питьевое. Технические условия.- Введ. 2003-06-30.- М. : Стандартинформ, 2008. - С. 11
5. Бышевский А.Ш., Терсенов О.А. Биохимия для врача. - Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994. - С. 384
THE USE OF DENATURING ELECTROPHORESIS FOR DEFINITION THE QUALITY OF DRINKING MILK A.Yu. Prosekov, O.O. Babich, O.V. Mudrikova
Summary. The possibility of application of denaturing polyacrylamide gel electrophoresis for definition the quality of the pasteurised whole milk was investigated.
Key words: milk, pasteurised whole milk, electrophoresis, reconditioned milk.
ИНФОРМАЦИЯ «ОБ ОСТАНОВКЕ ПРОИЗВОДСТВА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ТЕХНИКИ В 2010 ГОДУ»
Пресс-конференция на эту тему состоялась 2 февраля 2010 г в агентстве «Интерфакс». В ходе ее проведения президент Российской ассоциации производителей сельхозтехники «Росагромаш» Константин Бабкин, генеральный директор ЗАО «Евротехника» Людмила Орлова, генеральный директор Российской ассоциации производителей сельхозтехники «Росагромаш» Евгений Корчевой и другие руководители ведущих заводов сельскохозяйственного машиностроения рассказали о ситуации, складывающейся в отрасли в текущем году.
Константин Бабкин в своем выступлении сообщил, что в 2009 г. продажи сельхозмашин в стране сократились в 3,5 раза, а российское производство сельхозтехники уменьшилось в 1,5 раза. В связи с этим положение в отрасли складывается непростое, хотя, например, в Германии и Северной Америке рынок сельхозмашин растет. Причем потенциал для производства качественной техники мирового уровня в России есть. Так, в 2009 г на испытательные станции было представлено 180 типов новых машин.
Беспокойство вызывает высказывание министра сельского хозяйства в декабре 2009 г. о том, что средств на субсидирование процентных ставок на приобретение сельхозтехники в 2010 г выделено не будет. Хотя такая система действовала много лет и была гораздо эффективнее других инструментов господдержки. Несмотря на то, что сумма, заложенная в бюджете на субсидирование процентных ставок, увеличена с 60 до почти 80 млрд руб., решением Мин-сельхоза техника оказалась вычеркнутой из программы. Благодаря этому планируется сэкономить 3 млрд руб., которые могли бы привлечь порядка 60.70 млрд руб. коммерческих кредитов, в том числе из «Россельхозбанка».
Людмила Орлова отметила не эффективность работы компании «Росагролизинг», результатом которой стала дискредитация отечественного сельхозмашиностроения. ЗАО «Евротехника» производит машины мирового уровня, но они не востребованы. В основном это связано с тем, что государство начало защищать интересы отечественных сельхозмашиностроителей только в период кризиса. Причем мер по стимулированию производства нет до сих пор, а теперь еще планируется отмена субсидий по кредитам на приобретение сельхозтехники. Это подорвет не только сельхозмашиностроение, что приведет к остановке и закрытию заводов по всей стране, но и аграрный сектор экономики в целом.
Отменять субсидирование нельзя, поскольку без него сегодня невозможно осваивать новые технологии, выстраивать аграрную технологическую политику и проводить модернизацию. Более того, развитие сельхозмашиностроения необходимо включить отдельным разделом в Доктрину продовольственной безопасности Российской Федерации, поскольку наращивать производство сельскохозяйственной продукции, используя импортную технику, практически то же самое, что и закупать продукты питания.
По данным Российской ассоциации производителей сельхозтехники, озвученным Евгением Корчевым, на 1 февраля 2010 г портфель заказов техники российских компаний составляет 51 млрд руб. На такую сумму сельхозпроизводители готовы приобретать ее на условиях кредита и лизинга. Если эти механизмы работать не будут, указанная цифра уменьшится минимум в 2 раза, максимум - в 10 раз.
На 1 февраля 2010 г. на предприятиях, входящих в ассоциацию, скопилась продукция на сумму 7,5 млрд руб. и финансовые учреждения, в частности «Россельхозбанк», готовы выдавать кредиты для ее приобретения. Однако эта схема работает, так как нет субсидий.В результате с 1 декабря было остановлено производство на 6 заводах, входящих в ассоциацию. Остальные, в том числе Ростсельмаш, работают 2.3 дня в неделю. Если заказы, размещенные на предприятиях, не будут профинансированы потребителями, то можно говорить об остановке большей части российских заводов сельхозмашиностроения на неопределенное время.
В сложившейся ситуации производители сельхозтехники обратились с коллективным письмом к первому заместителю Председателя Правительства Российской Федерации В.А. Зубкову и заместителю Председателя Правительства Российской Федерации И.И. Сечину, в котором в частности сказано, что «при отмене субсидирования кредитов на приобретение сельхозтехники в 2010 п будет полностью остановлено производство более чем на 100 заводах отрасли. Без работы останутся от 50 до 100 тыс. граждан, будут заморожены миллиардные вложения инвесторов, резко обострится дефицит техники на селе, что негативно отразится на продовольственной безопасности страны.
В этой связи, просим Вас дать поручение Минсельхозу России обеспечить выполнение ранее принятых решений Правительства России о субсидировании кредитов на приобретение отечественной сельхозтехники в 2010 году. А также прояснить объемы и порядок компенсации для последующего аргументированного разъяснения сельхозпроизводителям, поставщикам комплектующих, партнерам и трудовым коллективам наших заводов».
Обращение подписали президент Российской ассоциации производителей сельхозтехники К.А. Бабкин, директор Российской ассоциации производителей сельхозтехники Е.А. Корчевой, генеральный директор ЗАО «Евротехника» Л.В. Орлова, президент Ассоциации дилеров сельскохозяйственной техники «Асход» П.Н. Репников, академик Российской академии сельскохозяйственных наук Н.В. Краснощеков и др. (всего более 40 человек).
