CC BY
152
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 612.112.91.015.1.083
Н. В. Воробьева1, В. В. Муругин2, В. В. Кулаков2, Б. В. Пинегин2
ингибиторный анализ активности nadph-оксидазы в хемоаттрактант-индуцированной дегрануляции нейтрофилов человека
1Биологический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова (119992, г. Москва, Ленинские горы, д. 1/12); 2ФГБУ гНЦ Институт иммунологии ФМБА России (117478, г Москва, Каширское ш., д. 24, к. 2)
Цель настоящего исследования - охарактеризовать эффекты дифенилениодония и апоцинина, ингибиторов «дыхательного взрыва», на дегрануляцию нейтрофилов здоровых доноров. Дыхательный взрыв измеряли методом люминолзависимой хемилюминесценции. Дифенилениодоний и селективный ингибитор NADPH-оксидазы, апоцинин приводили практически к полному подавлению N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин (ФМЛФ)-индуцированного дыхательного взрыва в исследуемом диапазоне концентраций. Те же реагенты дозозависимо подавляли экзоцитоз азурофильных и специфических гранул, стимулированный агонистом ФМЛФ. Полученные данные обсуждаются с точки зрения электрогенной активности ферментного комплекса NADPH-оксидазы, способного деполяризовать мембраны нейтрофилов и тем самым влиять на многие провоспалительные функции, включая экзоцитоз гранул.
Ключевые слова: нейтрофил, дегрануляция, NADPH-оксидаза, активные формы кислорода, деполяризация
Vorobjeva N.V., Murugin V.V., Kulakov V.V., Pinegin B.V
INHIBITORY ANALYSIS OF NADPH OXIDASE IN THE MODEL OF CHEMOATTRACTANT-INDUCED DEGRANULATION OF HUMAN NEUTROPHILS
The objective of the present study was to characterize the influence of diphenylene iodonium and apocynin, “oxidative burst” inhibitors, on degranulation of neutrophils obtained from the healthy donors. The oxidative burst was measured by the luminal-dependent chemiluminescence technique. Diphenylene iodonium and apocynin, a selective inhibitor of NADPH-oxidase, practically completely down-regulated the oxidative burst induced by N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (FMLP) within the range of concentration used in the study. The same reactants caused a dose-dependent reduction of exocytosis of the azurophilic and specific granules stimulated by a FMLP agonist. The results of the study are discussed in the context of the electrogenic activity of the NADPH-oxidase enzymatic complex capable of depolarizing the neutrophil plasma membrane and thereby affecting various proinflammatory functions including exocytosis of the granules.
Key words: neutrophil, degranulation, NADPH-oxidase, active oxygen species, depolarization
Введение. Известно, что мембраны всех живых клеток поляризованы. Поляризация мембраны обусловлена различием ионного состава на ее внутренней и внешней сторонах. Когда клетка находится в состоянии покоя, ионы по разные стороны мембраны образуют относительно стабильную разность потенциалов, называемую потенциалом покоя. Величина этого потенциала для гранулоцитов была измерена и составляет -100 мВ [9]. Мембранный потенциал клеток может изменяться под действием различных стимулов как в отрицательную (гиперполяризация), так и в положительную (деполяризация) сторону.
Ранее было показано, что электрогенный транспорт электронов, производимый NADPH-оксидазой, ведет к значительной деполяризации мембран, а именно к резкому изменению отрицательного потенциала в положительную сторону и достигает +58 мВ [9]. Вместе с тем обнаружено, что нейтрофилы пациентов с хронической грануломатозной болезнью (ХГБ) не подвергаются деполяризации при активации известными агонистами, а добавление к активированным нейтрофилам здоровых доноров такого ингибитора NADPH-оксидазы, как
Воробьева Нина Викторовна - канд. биол. наук, ст. науч. сотр., тел. 8(495)939-42-23, e-mail: nvvorobjeva@mail.ru
дифенилениодоний, вызывает подавление деполяризации [8].
Одной из интенсивно исследуемых провоспалительных функций нейтрофилов является дегрануляция. В этом процессе участвует множество сигнальных молекул, регулирующих перенос гранул к цитоплазматической мембране или к фагосомам и их последующее слияние и высвобождение содержимого матрикса [6, 12].
Влияние ферментного комплекса NADPH-окси-дазы на дегрануляцию гранулоцитов не было исследовано до настоящего времени. Мы предположили, что состояние мембранного потенциала клетки, который подвергается модуляции при активации фермента, может оказывать существенное влияние на экзоцитоз гранул нейтрофилов здоровых доноров. В настоящей работе мы изучали вещества, способные ингибировать работу ферментного комплекса NADPH-оксидазы, ответственного за деполяризацию мембран, дифени-лениодоний и апоцинин, и оценивали их роль в дегрануляции нейтрофилов. В работе приводятся доказательства того, что ингибирование NADPH-оксидазы в условиях хемоаттрактант-индуцированной активации и как следствие подавление деполяризации мембран нейтрофилов, ведет к снижению экзоцитоза азуро-фильных и специфических гранул.
- 11 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2012
Материалы и методы
Материалы. Дифенилениодоний (ДФИ), апоцинин, N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин, цитохалазин-В (ЦБ), люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) предоставлены «Sigma-Aldrich Corp.». Среды 199 и RPMI-1640, HEPES, Ficoll/Hypaque, фосфатно-солевой буфер (ФСБ), параформальдегид получены от «ПанЭко» (Россия). Все моноклональные антитела предоставлены «Beckman Coulter», а 96-луночные планшеты - компанией «Nunc» (Дания).
Выделение нейтрофилов. Кровь здоровых доноров в возрасте от 20 до 35 лет забирали в утренние часы натощак в полипропиленовые пробирки, предварительно добавив в них гепарин (20 ME мл-1 крови). Цельную кровь разводили средой 199 в 2 раза и наслаивали на одноступенчатый градиент Ficoll/Hypaque (плотность 1,077 г/мл), как описано ранее [2]. Центрифугирование проводили при 400 g в течение 20 мин. Удаляли верхний слой жидкости, промежуточный слой (мононуклеары) и нижний слой (Ficoll/Hypaque), а осадок, обогащенный нейтрофилами, суспендировали в среде 199. К полученной суспензии добавляли 6% раствор декстра-на до конечной концентрации 1,3%, мягко перемешивали и оставляли на 20 мин при температуре 37oC для седиментации эритроцитов. Далее отбирали верхний светлый слой жидкости и осаждали гранулоциты центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5 мин. Полученный осадок клеток промывали в ФСБ, а примесные эритроциты лизировали в растворе, содержащем NH4Cl, в течение 2 мин при комнатной температуре (КТ). Клетки осаждали центрифугированием, промывали 1 раз в ФСБ и суспендировали в полной культуральной среде (ПКС), включающей RpMI-1640, 10 мМ HEPES, 2 мМ а-глутамина, 40 мкг/мл гентамицина с добавлением 1% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки. Доводили концентрацию нейтрофилов до 51 • 106 мл-1 и оставляли их при температуре тающего льда на один час для получения клеток в покоющемся состоянии. Жизнеспособность клеток составляла не менее 97%, что определяли при окрашивании 0,1% раствором трипанового синего.
Экзоцитоз гранул. Экзоцитоз азурофильных и специфических гранул оценивали по изменению экспрессии на цитоплазматической мембране маркеров CD63 и CD66b соответственно, используя метод проточной цитофлюори-метрии. Покоющиеся нейтрофилы в ПКС раскапывали на 96-луночный планшет в объеме 45 мкл. В качестве стимулятора экзоцитоза использовали N-формил-метионин-лейцил-фенилаланин (ФМЛФ) в концентрации 100 нМ. Стимуляцию проводили в течение 10 мин при 37oC. Для индукции экзо-цитоза азурофильных гранул клетки предварительно инкубировали с 10-5 М цитохалазина В в течение 5 мин при 37oC. Там, где необходимо, осуществляли прединкубацию с ингибиторами NADPH-оксидазы, дифенилениодонием в течение 10 мин при КТ или апоцинином в течение 30 мин и при 37oC. По окончании стимуляции клетки фиксировали 2% раствором параформальдегида в течение 15 мин при КТ. После седиментации и промывания клеток в ФСБ к ним добавляли моноклональные антитела, специфичные к маркерам CD66b (ФИТЦ-меченные) и CD63 (ФЭ-меченные), разведенные в 100 раз в растворе ФСБ/0,5% БСА. Инкубацию проводили в течение 30 мин при КТ в темноте. Реакцию останавливали добавлением равного объема холодного ФСБ/0,5% БСА. Клетки осаждали в планшете, промывали в ФСБ и ресуспендирова-ли в 100 мкл того же буфера. Суспензию клеток переносили в цитометрические пробирки и доводили объем буфера до 400 мкл. Анализ проводили на проточном цитофлюориметре Cytomics FC500 («Beckman Coulter») с использованием FL1-детектора (488 нм аргоновый лазер, флюоресценция при 520 нм) и FL2-детектора (флюоресценция при 570 нм). Во всех экспериментах анализировали по 5000 клеток на пробу, а результат выражали как среднюю геометрическую флюоресценции клеток («GeoMean») ± стандартная ошибка среднего пяти независимых экспериментов.
Оценка выхода активных форм кислорода (АФК) методом люминолзависимой хемилюминесценции. Выход активных форм кислорода («дыхательный взрыв») оценивали методом люминолзависимой хемилюминесценции. Для этого использовали лейкоцитарную суспензию, которую получали, смешивая 2 мл гепаринизированной крови с 1 мл 3% желатины на ФСБ. После спонтанной седиментации эритроцитов при 37oC в течение 15 мин осторожно отбирали надосадок. Клетки осаждали при 200 g в течение 10 мин. Доводили концентрацию клеток до 2 • 106 мл-1 по сегментоядерным лейкоцитам.
На планшете смешивали 30 мкл клеток (2 • 106 мл-1), 30 мкл люминола в концентрации 560 мкМ (конечная концентрация 80 мкМ), 150 мкл ФСБ. Там, где необходимо, добавляли 10 мкл ФМЛФ (конечная концентрация 100 нМ). Перед стимуляцией клетки инкубировали с ДФИ (5, 10 мкМ) или с апоцинином в широком диапазоне концентраций (50-1500 мкМ). Объем жидкости во всех ячейках составлял 210 мкл. Хемилюминесценцию измеряли в течение 40 мин в люми-нометре LUCY («Anthos», Австрия). Оценивали следующие результаты (в относительных люминесцентных единицах): пик спонтанной хемилюминесценции, пик стимулированной хемилюминесценции, пики хемилюминесценции при добавлении ингибиторов NADPH-оксидазы, ДФИ и апоцинина. Степень подавления хемилюминесценции выражали в % относительно контроля (хемилюминесценция нейтрофилов в отсутствие ингибиторов NADPH-оксидазы).
Результаты
Влияние дифенилениодония на дегрануляцию нейтрофилов. Ранее показано, что активация NADPH-оксидазы нейтрофилов здоровых доноров хемоаттрактантом ФМЛФ ведет к образованию активных форм кислорода на внешней стороне мембраны или внутри фаголизосомы в результате транслокации электронов от NADPH на молекулярный кислород [9]. Этот электрогенный транспорт электронов приводит к значительной деполяризации мембранного потенциала [9, 19], обеспечивающего ограниченный вход внешнего Са+2 в цитозоль клеток [17].
Известно также, что при стимуляции в гранулоци-тах запускаются такие эффекторные механизмы, как хемотаксис, дегрануляция и др. [6, 12]. Мы предположили, что такая функция нейтрофилов, как дегрануляция, может быть напрямую связана с состоянием мембранного потенциала, который подвергается модуляции (деполяризации) при активации NADPH-оксидазного комплекса. Для того чтобы доказать участие NADPH-оксидазы и косвенно мембранного потенциала клеток в дегрануляции, необходимо исследовать действие ингибиторов фермента на экзоци-тоз гранул.
В качестве одного их таких ингибиторов выбран дифенилениодоний. ДФИ действует на NADPH-оксидазу неспецифически, ингибируя флавопротеи-ны электронотранспортной цепи: NADPH ^ флави-надениндинуклеотид ^ цитохром b ^ О2.
ДФИ добавляли в двух концентрациях (5 и 10 мкм) за 10 мин до стимуляции нейтрофилов. Дегрануляцию клеток оценивали по выходу на поверхность цитоплазматической мембраны маркеров азурофильных и специфических гранул (в % от контроля) - CD63 и CD66b соответственно, как описано в разделе «Материалы и методы».
На рис. 1, а, б видно, что добавление к нейтрофилам ДФИ на фоне стимуляции ЦБ/ФМЛФ приводит к дозозависимому ингибированию дегрануляции как
- 12 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
а
а
Стимуляция ЦВ/ФМЛФ
Рис. 1. Влияние дифенилениодония на дегрануляцию нейтрофилов, индуцированную ФМЛФ.
Условия тестирования дегрануляции описаны в "Материалах и методах". Дифенилениодоний добавляли, где указано, за 10 мин до стимуляции. CD63 и CD66b использовали в качестве маркеров дегрануляции азуро-фильных (а) и специфических (б) гранул соответственно. Результаты представляют средние значения ± стандартная ошибка среднего арифметического для трех независимых экспериментов (в % от контроля). Жизнеспособность клеток не изменялась в присутствии дифенилениодония в течение 1 ч, что определяли по отсутствию включения трипанового синего.
1 - контроль; 2 и 3: дифенилениоддоний - 5 и 10 мкМ соответственно
азурофильных, так и специфических гранул. Степень ингибирования азурофильных гранул была выражена сильнее по сравнению с таковой специфических гранул, а следовательно, они обладали большей чувствительностью к последствиям функционального подавления NADPH-оксидазы.
Влияние апоцинина на дегрануляцию нейтрофилов. Поскольку ДФИ, будучи ингибитором всех фла-винзависимых оксидаз, не является специфическим по отношению к NADPH-оксидазе, нам было важно выяснить, подтвердятся ли полученные выше результаты, если использовать специфический ингибитор фермента апоцинин.
Апоцинин используется в качестве сильного ингибитора NADPH-оксидазы во многих эксперимен-
К
О
а
н
X
е
о
п
СО
со
о
о
ОС
ц
о
а
н
X
8
О
п
со
со
о
о
Рис. 2. Влияние апоцинина на дегрануляцию нейтрофилов человека, индуцированную ФМЛФ.
Нейтрофилы человека стимулировали ФМЛФ, как описано в "Материалах и методах". ЦВ добавляли, где следовало, для определения выхода маркера азурофильных гранул CD63. Апоцинин добавляли за 30 мин до стимуляции. Результаты представляют средние значения ± стандартная ошибка среднего арифметического для пяти независимых экспериментов (в % от контроля). Жизнеспособность клеток не изменялась при добавлении апоцинина по крайней мере в течение 2 ч, что определяли по отсутствию включения трипанового синего.
1 - контроль; 2—6: апоцинин - 50, 100, 250, 500, 1000 мкМ соответственно.
тальных моделях как фагоцитов, так и не фагоцитирующих клеток [13, 22]. И, хотя механизм действия апоцинина до конца не выяснен, известно, что он ингибирует перенос на мембрану цитозольного компонента p47phox [1, 16].
В наших экспериментах использовали широкий диапазон концентраций апоцинина - от 50 до 1500 мкМ. Инкубацию с апоцинином проводили в течение 30 мин перед стимуляцией нейтрофилов при температуре 37oC. Столь длительная инкубация обусловлена тем, что апоцинин является предшественником более активного вещества димера, в которое он трансформируется при окислении пероксидом водорода при участии пероксидазы клетки [10].
Мы показали, что добавление апоцинина в широком диапазоне концентраций приводило к дозозависимому ингибированию дегрануляции нейтрофилов
- 13 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2012
а
Дифенилениодоний
б
Рис. 3. Эффект дифенилениодония и апоцинина на люминолзависи-мую хемилюминесценцию нейтрофилов здоровых доноров, стимулированных ФМЛФ.
Результаты, полученные в отсутствие ДФИ и апоцинина, служат контролем (100%). Каждая колонка представляет собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего арифметического для трех независимых экспериментов.
а: 1 - 0 мкМ; 2 и 3 - 5 и 10 мкМ соответственно; б: 1 - 0 мкМ; 2-7 - 50, 100, 250, 500, 1000, 1500 мкМ соответственно.
(рис. 2, а, б). И так же, как и в случае с ДФИ, азуро-фильные гранулы оказались более чувствительны к ингибированию апоцинином по сравнению со специфическими гранулами.
Влияние ДФИ и апоцинина на люминолзависимую хемилюминесценцию активированных нейтрофилов. Полученные данные, безусловно, затрагивали вопрос о том, действительно ли ДФИ и апоцинин ингибировали NADPH-оксидазу. А поскольку следствием функциональной активности фермента является образование АФК, то в следующей серии экспериментов мы попытались оценить изменение степени «дыхательного взрыва» или снижение АФК методом люминолзависимой хемилюминесценции. Этот метод отражает уровень синтеза гипохлорита (HCl/OCl-), гидроксильных радикалов (ОН) и 1O2, образующихся при трансформации супероксид-анион радикалов [4]. Добавление к нейтрофилам ФМЛФ приводило к 7-кратному усилению хемилюминесценции по сравнению с таковым в контроле (не показано). Предин-
кубация клеток с ДФИ в двух концентрациях (5 и 10 мкМ) в течение 10 мин (рис. 3, а), а также с апоцинином в диапазоне концентраций 50-1500 мкМ (рис. 3, б) полностью подавляла хемилюминесценцию активированных клеток. Таким образом, наши результаты подтвердили, что ДФИ и апоцинин в исследуемых диапазонах концентраций полностью снижали синтез АФК NADPH-оксидазой и, следовательно, ингибировали активность ферментного комплекса, а подавление дегрануляции прямо или косвенно связано с этим процессом.
Обсуждение. В 1980-е годы были представлены первые доказательства того, что стимуляция нейтрофилов рядом агонистов приводила к деполяризации мембран [20]. Примечательно, что этот ответ мембранного потенциала отсутствовал у нейтрофилов пациентов с ХГБ. Идея об электрогенных свойствах оксидазы впервые была представлена в работах L. Henderson и соавт. [3, 8], в которых авторы показали, что степень деполяризации после стимуляции ФМА снижалась при добавления ДФИ, ингибитора NADPH-оксидазы. Этот факт, а также данные об отсутствии деполяризации у нейтрофилов ХГБ позволили предположить, что именно образование супероксидного радикала (О2-) косвенным образом связано с изменением мембранного потенциала. Вследствие этого ряд исследователей признали, что NADPH-оксидаза является электрогенным ферментом благодаря его способности переносить электроны из клетки во внеклеточное пространство или в фагосомы при отсутствии компенсирующего транспорта протонов [5, 7, 15].
Следует отметить, что первые прямые доказательства электрогенной активности NADPH-оксидазы были получены в работе J. Schrenzel и соавт. [19], где методом локальной фиксации потенциала (patch-clamp) был показан прямой ток электронов, образованный NADPH-оксидазой. И, хотя авторы работали на эозинофилах человека, им удалось показать наличие внутреннего тока, который ингибировался ДФИ и отсутствовал у пациентов с ХГБ. Они также описали активацию тока при стимуляции клеток ФМЛФ, хорошо известного стимулятора NADPH-оксидазы. В своей работе авторы показали, что ток был внутренним и преодолевал напряжение, составляющее -100-60 мВ, что указывало на чрезвычайно сильную способность фермента разделять заряженные ионы на мембране [19].
При использовании традиционной флюоресцентной техники показано, что активированные грануло-циты деполяризуются с образованием положительного мембранного потенциала, составляющего 25-30 мВ [19]. А в работе A. Jankowski и соавт. [9] был измерен потенциал ФМА-стимулированных нейтрофилов, который достигал 58 мВ.
Каково же может быть значение деполяризации для нейтрофилов при их активации? В нашей работе, а также в ряде других [6, 12] продемонстрировано, что активированные нейтрофилы, находящиеся в высокодеполяризованном состоянии, обладают способностью к экзоцитозу азурофильных и специфических гранул. Реполяризация/подавление деполяризации клеток, вызванная такими ингибиторами NADPH-оксидазы, как ДФИ и апоцинин, приводит к снижению дегрануляции. Вполне вероятно, что изменение
- 14 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
заряда на внутренней стороне плазмалеммы с отрицательного на положительный при активации может способствовать лучшему взаимодействию белков, обеспечивающих слияние мембран (SNAP/SNARE гипотеза) [14].
Помимо возможного влияния мембранного потенциала на слияние мембран при дегрануляции, мы не исключаем его опосредованного воздействия, например, через выход Са+2 или цитоскелет. Известно, что стимуляция нейтрофилов рядом рецепторных агонистов приводит к повышению концентрации внутриклеточного Са+2. Такое повышение играет важную роль в передаче сигналов в клетках, стимулируя различные эффекторные ответы (например, дегрануляцию, образование АФК) [18]. Как уже было упомянуто выше, ферментный комплекс NADPH-оксидаза провоцирует деполяризацию мембран нейтрофилов благодаря трансмембранному току электронов изнутри во внеклеточное пространство или внутрь фаголизосомы [20]. Вместе с тем давно известно, что деполяризация ингибирует вход внешнего Са+2 во многих типах клеток. В своей работе на нейтрофилах человека M. Geiszt и соавт. [7] показали, что во-первых существует связь между ингибированием входа Са+2 в клетки и деполяризацией, во-вторых, у пациентов с ХГБ агонистопосредованное ингибирование входа внешнего Са+2 отсутствует. Вследствие такого регуляторного дефекта нейтрофилы ХГБ начинают накапливать внешний Са+2 раньше, чем у здоровых доноров. Патофизиологическое значение этого явления неизвестно, однако роль внешнего Са+2 в регуляции синтеза цитокинов у нейтрофилов [11], а также провоспалительных ответов, в том числе дегрануляции [21], не вызывает сомнения.
Таким образом, мы рассмотрели только несколько случаев оказания влияния деполяризации клетки или ее ингибирования на провоспалительные эффекты нейтрофилов, к которым относится и дегрануляция. Изучение связи мембранного потенциала и эффектор-ных механизмов нейтрофилов представляет одно из перспективных направлений дальнейших исследований.
Авторы выражают признательность сотруднику кафедры иммунологии биологического факультета МГУ канд. биол. наук Д. Б. Киселевскому за предоставление апоцинина.
ЛИТЕРАТУРА
1. Barbieri S. S., Cavalca V, Eligini S. et al. Apocynin prevents cyclooxygenase 2 expression in human monocytes through NA-DPH oxidase and glutathione redox-dependent mechanisms // Free Radic. Biol. Med. - 2004. - Vol. 37, N 2. - P. 156-165.
2. Boyum A. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages // Scand. J. Immunol. - 1976. - Suppl. 5. - P. 9-15.
3. Chappell J. В., Henderson L. M. The activation of the electrogenic NADPH oxidase // Biochem. Soc. Trans. - 1991. - Vol. 19, N 1. - P. 67-70.
4. DeChatelet L. R., Long G. D., Shirley P. S. et al. Mechanism of the luminol-dependent chemiluminescence of human neutrophils // J. Immunol. - 1982. - Vol. 129, N 4. - P. 1589-1593.
5. Demaurex N., El Chemaly A. Physiological roles of voltage-gat-
ed proton channels in leukocytes // J. Physiol. (Lond.). - 2010.
- Vol. 588, N 23. - P. 4659-4665.
6. Faurschou M., Borregaard N. Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation // Microbes Infect. - 2003. - Vol. 5, N 14. - P. 1317-1327.
7. Geiszt M., Kapus A., Nemet K. et al. Regulation of capacitative Ca2+ influx in human neutrophil granulocytes. Alterations in chronic granulomatous disease // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272, N 42. - P. 26 471-26 478.
8. Henderson L. M., Chappell J. В., Jones O. T. The superoxidegenerating NADPH oxidase of human neutrophils is electrogenic and associated with an H+ channel // Biochem. J. - 1987. - Vol. 246, N 2. - P. 325-329.
9. Jankowski A., Grinstein S. A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils // J. Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274, N 37. - P. 26 098-26 104.
10. Johnson D. K., Schillinger K. J., Kwait D. M. et al. Inhibition of NADPH oxidase activation in endothelial cells by ortho-meth-oxy-substituted catechols // Endothelium. - 2002. - Vol. 9, N 3.
- P. 191-203.
11. Kuhns D. B., Young H. A., Gallin E. K. et al. Ca2+-dependent production and release of IL-8 in human neutrophils // J. Immunol. - 1998. - Vol. 161, N 8. - P. 4332-4339.
12. Lacy P., Eitzen G. Control of granule exocytosis in neutrophils // Front. Biosci. - 2008. - Vol. 13. - P. 5559-5570.
13. LafeberF. P., Beukelman C. J., van den Worm E. et al. Apocynin, a plant-derived, cartilage-saving drug, might be useful in the treatment of rheumatoid arthritis // Rheumatology. - 1999. - Vol. 38, N 11. - P. 1088-1093.
14. Mollinedo F., Martin-Martin В., Calafat J. et al. Role of vesicle-associated membrane protein-2, through Q-soluble N-ethylma-leimide-sensitive factor attachment protein receptor/R-soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor interaction, in the exocytosis of specific and tertiary granules of human neutrophils // J. Immunol. - 2003. - Vol. 170, N 2. - P. 1034-1042.
15. Murphy R., DeCoursey Т. Е. Charge compensation during the phagocyte respiratory burst // Biochim. Biophys. Acta. - 2006. -Vol. 1757, N 8. - P. 996-1011.
16. Peters E. A., Hiltermann J. T., Stolk J. Effect of apocynin on ozone-induced airway hyperresponsiveness to methacholine in asthmatics // Free Radic. Biol. Med. - 2001. - Vol. 31, N 11. - P. 1442-1447.
17. Rada B. K., GeisztM., Hably C. et al. Consequences of the electrogenic function of the phagocytic NADPH oxidase // Philos. Trans. Roy. Soc. Lond. B. Biol. Sci. - 2005. - Vol. 360, N 1464.
- P. 2293-2300.
18. Scharff O., Foder B. Regulation of cytosolic calcium in blood cells // Physiol. Rev. - 1993. - Vol. 73, N 3. - P. 547-582.
19. Schrenzel J., Serrander L., Banfi B. et al. Electron currents generated by the human phagocyte NADPH oxidase // Nature. - 1998.
- Vol. 392, N 6677. - P. 734-737.
20. Seligmann B. E., Gallin J. I. Use of lipophilic probes of membrane potential to assess human neutrophil activation. Abnormality in chronic granulomatous disease // J. Clin. Invest. - 1980.
- Vol. 66, N 3. - P. 493-503.
21. Wolf M. J., Wang J., Turk J. et al. Depletion of intracellular calcium stores activates smooth muscle cell calcium-independent phospholipase A2. A novel mechanism underlying arachidonic acid mobilization // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272, N 3. - P. 1522-1526.
22. Zhang Y., Chan M. M., Andrews M. C. et al. Apocynin but not allopurinol prevents and reverses adrenocorticotropic hormone-induced hypertension in the rat // Am. J. Hypertens. - 2005. -Vol. 18, N 7. - P. 910-916.
Поступила 30.09.11
- 15 -
