CC BY
139
ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2014
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 612.112.91.083
Воробьева Н.В.1, Голубева Н.М.2, Пинегин Б.В.2
роль актинового цитоскелета в регуляции дегрануляции нейтрофилов человека, активированных опсонизированным зимозаном
1Кафедра иммунологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992, г Москва, Ленинские горы, 1/12; 2ФгБУ «ПНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, г Москва
Изучено действие вещества, вызывающего диссоциацию филаментного актина, цитохалазина В (ЦБ), на дегрануляцию нейтрофилов человека, индуцированную опсонизированным зимозаном. Впервые показано, что низкие дозы ЦБ усиливают экзоцитоз азурофильных и специфических гранул относительно стимуляции одним опсонизированным зимозаном на 26 и 33% соответственно. Высокие дозы ЦБ дозозависимо ингибируют дегрануляцию клеток. Предложена модель, описывающая экзоцитоз гранул у нейтрофилов человека в зависимости от динамического состояния филаментного актина.
Ключевые слова: нейтрофил; экзоцитоз гранул; актиновый цитоскелет; компартментализация мембраны; опсонизированный зимозан
Vorob’yova N.V., Golubeva N.M., Pinegin B.V.
ESSENTIAL ROLE OF ACTIN CYTOSKELETON IN REGULATION OF GRANULE EXOCYTOSIS IN HUMAN NEUTROPHILS ACTIVATED WITH OPSONIZED ZYMOSAN
Here, a comprehensive analysis of actin dissociating drug cytochalasin B (CB) on exocytosis of human neutrophils induced with opsonized zymosan have been performed. For the first time we showed that low doses of CB stimulated an exocytosis of azurophilic and specific granules, while high doses of CB decreased it in a dose-dependent manner. We conclude that in accordance with a model «fence» and «pickets» low doses of CB facilitated the clasterization of FcyR, while high doses of CB inhibited actin reorganization and prevented particle internalization and granule exocytosis. Based on our data, a model of degranulation in dependence on functional state of cortical actin is proposed.
Key words: neutrophil; granule exocytosis; actin cytoskeleton; membrane compartmentalization; opsonized zymosan
Нейтрофилы человека играют существенную роль в защите хозяина от патогенов, бактерий, грибов и вирусов [1]. Как только патоген инфицирует хозяина, нейтрофилы немедленно мигрируют в участки инфекции, привлекаемые хемоаттрактантами [2]. Здесь они распознают патогенассоциированые молекулярные паттерны при участии таких трансмембранных паттернраспознающих рецепторов, как TM-like-рецепторы. Далее нейтрофилы быстро фагоцитируют патогены, опсони-зированные антителами или комплементом. Процесс фагоцитоза сопровождается активацией нейтрофила, приводящей к синтезу активных форм кислорода (АФК), высвобождению протеолитических ферментов и антимикробных пептидов в результате экзоцитоза гранул [3].
Долгое время существовало каноническое представление, согласно которому поглощение мишеней фагоцитами происходит при взаимодействии рецепторов с лигандами, что напоминает “застежки молнии”. Такая модель была основана на предположении, согласно которому мономерные IgG-рецепторы равномерно распределены по клеточной поверхности фагоцита и свободно диффундируют в соответствии с броуновским движением, пока не столкнутся с подходящим лигандом [4]. Эта концепция соответствовала жидкомозаичной модели организации цитоплазматической мембраны, предложенной S. Singer и G. Nicolson [5].
Для корреспонденции: Воробьева Нина Викторовна, e-mail: nvvorobjeva@mail.ru
For correspondence: Vorob’yova Nina Viktorovna, e-mail: nvvorobjeva@mail.ru
Однако эта модель не могла объяснить некоторые процессы, происходящие в мембране; например, подвижность белков в цитоплазматической мембране была гораздо ниже, чем в искусственных бислоях со сходным липидным составом. В связи с этим A. Kusumi и соавт. [6, 7] выдвинули новую концепцию организации мембраны. Используя высокоскоростной метод отслеживания индивидуальных частиц SPT (high-speed single-particle tracking), авторы показали, что мембрана представляет собой не гомогенный жидкий слой, а состоит из компартментов (corrals). Внутри этих компар-тментов диффузия белков и липидов происходит свободно, однако возможно и их перескакивание в соседние компар-тменты. Экспериментально показано, что такая компартмен-тализация обусловлена актиновым цитоскелетом, выстилающим цитозольную поверхность плазматической мембраны. По данным A. Kusumi и соавт. [6-8], именно кортикальный актин образует решетчатую структуру, ограничивающую латеральное передвижение мембранных белков (модель fence). Кроме того, белковые молекулы, пронизывающие кортикальный цитоскелет и мембрану одновременно, действуют как “колья”, ограничивающие диффузию липидов и других белков между компартментами (модель pickets).
В связи с отказом от традиционной жидкомозаичной структуры мембраны в пользу компартментализованной (модель fence и pickets) появилась необходимость пересмотреть подвижность мембранных рецепторов, в частности FcyR, при фагоцитозе. Так, V. Jaumouille и S. Grinstein, используя метод SPT на модели FcyRIIA первичных макрофагов человека, показали, что рецепторы к иммуноглобулинам в покоящихся клетках существуют главным образом в виде мономеров.
- 124 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Однако при активации макрофагов появляются две различные субпопуляции FcyRIIA, отличающиеся по подвижности в плоскости мембраны. Одна из них представлена свободно диффундирующими мономерами, другая - рецепторами, ограниченными компартментами, которые образованы кортикальным актином [9].
Основываясь на новых представлениях об организации мембраны и данных V. Jaumouille и S. Grinstein [9], касающихся подвижности Fcy-рецепторов при фагоцитозе, мы предположили, что связывание рецепторов с лигандами будет усиливаться при мягком разрушении актинового цитоскелета благодаря повышению латеральной подвижности мономерных рецепторов. В соответствии с нашим предположением добавление низких доз препаратов, вызывающих диссоциацию филаментного актина, например цитохалазина B (ЦБ), должно активировать фагоцитоз и сопровождающий его экзоцитоз гранул. Однако более высокие концентрации ЦБ должны подавлять ремоделирование актина в фагоцитарной чаше, необходимое для интернализации мишени, и блокировать фагоцитоз и соответственно экзоцитоз нейтро-фильных гранул. Это предположение было проверено на модели дегрануляции нейтрофилов человека, активированных зимозаном, который опсонизирован пуловой сывороткой, и обработанных различными дозами ЦБ.
Материалы и методы. Трипептид N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин (ФМЛФ), ЦБ, зимозан, люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) были предоставлены Sigma-Aldrich Corp (США). Среды 199 и RPMI-1640, HEPES, Ficoll/Hypaque, фосфатно-солевой буфер (PBS), параформальдегид были получены от “ПанЭко” (Россия). Все моноклональные антитела были предоставлены Beckman coulter (США), а 96-луночные планшеты - компанией Nunc (Дания).
Зимозан, полученный из S. cerevisia, обработали сывороткой от 20 доноров (OZ). Суспензию зимозана в PBS (5 мг-мл"1) кипятили на водяной бане в течение 20 мин. Затем суспензию центрифугировали, супернатант отбрасывали, а осадок инкубировали с сывороткой (5 мг зимозана и 1 мл сыворотки) при 37оС в течение 30 мин. Зимозан отмывали в PBS и ресуспендировали до конечной концентрации 20 мг-мл"1. Аликвоты хранили при -70оС.
Выделение нейтрофилов. Периферическую кровь здоровых доноров забирали в утренние часы натощак в полипропиленовые пробирки, предварительно добавив в них гепарин (20 МЕ/мл крови). Нейтрофилы выделяли по методу A. Boyum [10] с модификациями. Для этого цельную кровь разводили средой 199 в 2 раза и наслаивали на одноступенчатый градиент Ficoll/Hypaque плотностью 1,077 г/мл. Центрифугирование проводили при 400 g течение 25 мин. Осадок, обогащенный нейтрофилами, ресуспендировали в среде 199 и добавляли декстран до конечной концентрации 1,3% для седиментации эритроцитов, которая продолжалась 30 мин при комнатной температуре (КТ). После этого отбирали верхний слой жидкости, гранулоциты осаждали центрифугированием при 1200 об/мин 10 мин. Полученный осадок клеток промывали в PBS, а примесные эритроциты лизировали в гипотоническом растворе (0,2% NaCl/1 мМ ЭДТА) 30 с при 4оС. Клетки осаждали центрифугированием, промывали в PBS и ресуспендировали в полной культуральной среде (ПКС), включающей RPMI-1640, 10 мМ HEpEs, 2 мМ а-глутамина, 40 мкг/мл гентамицина с добавлением 1% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки. Полученные клетки были представлены более чем на 97% нейтрофилами, их жизнеспособность составляла более 98%, что определяли по исключению трипанового синего. Концентрацию нейтрофилов доводили до 5-106 мл-1 в ПКС и оставляли при температуре тающего льда на 1 ч.
Экзоцитоз гранул. Экзоцитоз азурофильных и специфических гранул определяли по экспрессии на цитоплазматической мембране CD63 и CD66b соответственно, используя метод проточной цитофлюориметрии, как описано ранее [11]. Покоящиеся нейтрофилы инкубировали в присутствии ЦБ в
различной концентрации в течение 5 мин при 37оС. Далее клетки стимулировали зимозаном, опсонизированным пуловой сывороткой, который добавляли в концентрации 400 мкг/мл. Инкубация продолжалась 20 мин при 37оС, после чего клетки фиксировали 2% раствором параформальдегида 15 мин при КТ, промывали 1 раз в PBS и осаждали в планшете. Для определения экспрессии маркеров азурофильных и специфических гранул нейтрофилы инкубировали 30 мин с РЕ-конъюгированными моноклональными антителами к CD63 и FITC-конъюгированными моноклональными антителами к cD66b. По окончании инкубации клетки промывали PBS, переносили в цитометрические пробирки и доводили объем буфера до 400 мкл. Анализ проводили на проточном цитофлюориметре cytomics Fc500 (Beckman coulter, США) с использованием FL1-детектора (488 нм аргоновый лазер, возбуждение флюоресценции при 520 нм) и FL2-детектора (возбуждение флюоресценции при 570 нм).
Хемилюминесценция. Образование АФК (“дыхательный взрыв”) нейтрофилами человека оценивали с помощью люми-нолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) с помощью люмино-метра фирмы LKB (Швеция), как описано ранее [11].
Для оценки выхода АФК использовали лейкоцитарную суспензию, которую получали, смешивая 2 мл гепаринизированной крови с 1 мл 3% желатины на PBS. После спонтанной седиментации эритроцитов при 37оС в течение 15 мин отбирали верхний слой жидкости. Лейкоциты осаждали при 200 g в течение 10 мин и доводили концентрацию клеток до 2-106 мл-1 по сегментоядерным лейкоцитам.
На планшете смешивали 2-105 клеток в объеме 100 мкл, 100 мкл люминола (конечная концентрация 10 мкМ), 300 мкл PBS. Где указано, добавляли OZ или ФМЛФ (конечная концентрация 200 нМ), а также различные дозы ЦБ. Объем жидкости в ячейках составил 500 мкл. ХЛ определяли в течение 40 мин и оценивали следующие параметры (в относительных люминесцентных единицах): пики спонтанной и стимулированной ХЛ, пики ХЛ при добавлении различных доз ЦБ. Степень подавления (стимуляции) ХЛ выражали в % относительно контроля (ХЛ нейтрофилов в отсутствие ЦБ и стимуляторов).
Результаты. Влияние ингибиторов филаментного актина на OZ-стимулированный выход АФК. Известно, что OZ индуцирует образование АФК нейтрофилами человека. Для определения дозы oZ, вызывающей максимальный выход АФК, нейтрофилы инкубировали с опсонизированным зимо-заном в диапазоне концентраций 10-400 мкг/мл и измеряли люминолзависимую ХЛ. Полученные результаты показали, что oZ (10-400 мкг/мл) индуцировал четкое повышение образования АФК нейтрофилами. Эффект был дозозависимым с максимальным ответом, полученным в присутствии 400 мкг/мл OZ. Концентрация OZ 1 мкг/мл не индуцировала большего выхода АФК (данные не показаны).
Далее в присутствии 400 мкг/мл OZ к нейтрофилам добавляли ЦБ в концентрации 10-6-2-10-5 М и оценивали образование АФК с помощью люминолзависимой ХЛ. Полученные результаты показали, что ЦБ в дозе 10-6 М увеличивал ХЛ, полученную в присутствии одного лишь OZ, а в дозах ЦБ выше 10-6 и до 2-10-5 М ХЛ дозозависимо снижалась (рис. 1).
В следующей серии экспериментов определяли действие различных доз ЦБ при стимуляции нейтрофилов ФМЛФ. Концентрацию ФМЛФ, вызывающую максимальный выход АФК, подобрали в предварительной серии экспериментов, она составила 200 нМ. Дальнейшее повышение дозы ФМЛФ не влияло на образование АФК нейтрофилами (не показано). Добавление ЦБ в концентрации 10-6-10-5 М в присутствии 200 нМ ФМЛФ дозозависимо усиливало «дыхательный взрыв», а доза ЦБ, равная 2-10-5 М, снижала выход АФК (см. рис. 1).
Разрушение кортикального цитоскелета регулирует экзоцитоз азурофильных и специфических гранул при стимуляции OZ. Показано, что фагоцитоз, индуцированный такими нерастворимыми стимулами, как oZ, происходит с участием рецепторов и сопровождается интернализацией частиц и
- 125 -
ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2014
Добавлен опсонизированный зимозан Добавлен ФМЛФ
Рис. 1. Влияние ЦБ на люминолзависимую ХЛ, индуцированную OZ или ФМЛФ.
К нейтрофилам были добавлены различные концентрации ЦБ в присутствии 400 мкг/мл OZ или 200 нМ ФМЛФ в PBS, включающем 10 мкМ люминола, ХЛ определяли с помощью хемилюминометра. АФК регистрировали в течение 40-минутной инкубации и выражали в процентах от контроля (контроль - спонтанный выход АФК в отсутствие стимуляторов и ЦБ). Данные были статистически обработаны и представлены в виде средней ± стандартное отклонение от средней для трех независимых экспериментов.
По оси абсцисс здесь и на рис. 2, 3 - концентрация ЦБ (в М); по оси ординат - % стимуляции (подавления) относительно контроля.
фических гранул (рис. 2, б). Добавление ЦБ в дозе 10"6-2-10"6 М усиливало дегрануляцию (на 33% в максимальной точке - 10-6 М ЦБ), а в диапазоне концентраций 10-5-2-10-5 М ЦБ дозозависимо подавлял дегрануляцию, вызванную OZ. Надо отметить, что подавление специфических гранул составило 12-36%. Таким образом, можно сделать заключение о том, что специфические гранулы менее чувствительны к действию ЦБ, чем азурофильные.
Разрушение кортикального цитоскелета регулирует эк-зоцитоз азурофильных и специфических гранул при стимуляции ФМЛФ. Ранее показано, что актин выполняет как негативную, так и позитивную функцию в процессе экзоцитоза гранул. Так, известно, что кортикальная актиновая сеть создает физический барьер, препятствующий свободному выходу гранул из клетки [12], а фармакологическое разрушение F-актина ведет к усилению экзоцитоза нейтрофилов человека [11, 13].
В то же время известно, что добавление ряда фармакологических ингибиторов F-актина к некоторым типам клеток
ремоделированием актинового цитоскелета в фагоцитарной чаше [1]. В процессе фагоцитоза также активируется большое количество сигнальных молекул, в том числе тирозинкиназа, фосфоинозитид-3-киназа и МАР-киназы, участвующие в фосфорилировании субъединиц NADPH-оксидазы и экзо-цитозе гранул во внешнее окружение нейтрофила.
Мы предположили, что процессы реорганизации F-актина во время фагоцитоза должны отражаться на экзоцитозе гранул. Действительно ингибирование сборки филаментного актина такими веществами, как цитохалазины, должно подавлять фагоцитоз и дегрануляцию. Однако с учетом нового представления об организации мембранного цитоскелета и существования компартментов, ограничивающих свободное передвижение рецепторов, можно предположить, что низкие дозы актиндиссоциирующих веществ должны способствовать устранению барьеров и увеличивать латеральную подвижность рецепторов, усиливая тем самым фагоцитоз и экзоцитоз гранул. Эту гипотезу проверили на модели дегрануляции нейтрофилов человека, инкубированных с различными дозами ЦБ и стимулированных OZ.
Нейтрофилы здоровых доноров инкубировали с ЦБ в диапазоне концентраций от 10-6 до 2-10-5 М в течение 5 мин, после чего клетки стимулировали OZ. Полученные данные представлены на рис. 2, а, где можно видеть, что ЦБ в концентрации 10-6-2-10-6 усиливал OZ-индуцированный экзо-цитоз азурофильных гранул (на 26% в максимальной точке - 10-6 М ЦБ). В более высокой концентрации (10-5-2-10-5 М) ЦБ дозозависимо подавлял дегрануляцию (от 62 до 68%). Причем в присутствии 2-10-5 М ЦБ дегрануляция почти приближалась к уровню спонтанной (средняя интенсивность флюоресценции равна 7).
Аналогичным образом изменялась дегрануляция специ-
Цитохалазин Б(М)
• В присутствии OZ о Без добавления OZ
Рис. 2. Влияние ЦБ на экзоцитоз нейтрофилов, стимулированных OZ. Мягкое разрушение актинового цитоскелета ЦБ (доза 10'6-2М0'6 М) усиливает OZ-индуцированный экзоцитоз азурофильных (а) и специфических (б) гранул, а более высокая концентрация ЦБ (10'5-2М0'5 М) дозозависимо подавляет экзоцитоз обоих типов гранул. Нейтрофилы (5М06 кл/мл) инкубировали с указанными концентрациями ЦБ 5 мин, затем их стимулировали 400 мкг/мл OZ в течение 20 мин. Экзоцитоз азурофиль-ных и специфических гранул определяли с помощью проточной цитоф-люориметрии и оценивали среднюю интенсивность флюоресценции для CD63 и CD66b соответственно. Данные представлены в виде средней ± стандартное отклонение для пяти экспериментов.
Здесь и на рис. 3: по оси ординат - средняя интенсивность флюоресценции.
- 126 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
16-|
Цитохалазин Б(М)
• В присутствии ФМЛФ о Без ФМЛФ
Рис. 3. Влияние ЦБ на экзоцитоз нейтрофилов, стимулированных ФМЛФ.
Диссоциация актинового цитоскелета ЦБ вызывает значительное усиление экзоцитоза специфических гранул (а) и экзоцитоз азурофильных гранул (б). Нейтрофилы (5М06 кл/мл) инкубировали в присутствии или отсутствие указанных концентраций ЦБ в течение 5 мин и затем стимулировали 200 нМ ФМЛФ в течение 10 мин. Экзоцитоз азурофильных и специфических гранул определяли с помощью проточной цитофлюори-метрии по экспрессии маркеров cD63 и cD66b соответственно. Данные представлены в виде средней ± стандартное отклонение для 15 экспериментов.
[14, 15] приводит к подавлению экзоцитоза. По-видимому, в этих случаях реорганизация актина способствует экзоцитозу гранул, обеспечивая для них транспортную сеть через кортикальный слой [16].
Результаты экзоцитоза гранул под действием зимозана, опсонизированного сывороткой, и участия в этом процессе актиндиссоциирующего агента ЦБ сравнили с дегрануляцией, вызванной растворимым стимулятором, хемоаттрактантом ФМЛФ. Для этого нейтрофилы инкубировали с ЦБ в широком диапазоне концентраций, после чего стимулировали экзоцитоз с помощью ФМЛФ.
Предобработка клеток ЦБ в концентрации 2-10"6-10"5 М значительно повышала ФМЛФ-стимулированную экспрессию CD66b, однако в некоторых случаях концентрация ЦБ, равная или выше 2-10"5 М, подавляла дегрануляцию (рис. 3, а).
Напротив, стимуляция нейтрофилов хемоаттрактантом ФМЛФ в отсутствие актиндиссоциирующего вещества не индуцировала экзоцитоз азурофильных гранул (маркер CD63). Однако предобработка клеток ЦБ в концентрации 2-10"6-2-10"5 М приводила к значительному повышению экспрессии CD63 после стимуляции ФМЛФ, причем пик стимуляции наблюдали при концентрации ЦБ 10"5 М (рис. 3, б).
Обсуждение. На протяжении нескольких десятилетий накоплено большое количество противоречивых экспериментальных данных, касающихся связи фагоцитоза с актиновым цитоскелетом. Долгое время считалось [17], что связывание мишеней и образование сигнала при фагоцитозе никак не нарушаются при добавлении веществ, ингибирующих полимеризацию актина (например, ЦБ и цитохалазина D).
Напротив, в некоторых работах [18-20] обнаружено, что инкубирование макрофагов с цитохалазином D или латрункули-ном А приводит к одавлению связывания мишеней при фагоцитозе. В то же время B. Bentwood и соавт. [21] показали, что ЦБ в низкой концентрации стимулирует дегрануляцию нейтрофилов, активированных IgG-опсонизированным зимозаном.
Следует отметить, что все вышеупомянутые работы проведены до представления A. Kusumi и соавт. [6, 7, 22] своей модели организации мембраны (модель fence и pickets) или без учета ее существования. Напомним, что в соответствии с этой моделью постулировалось, что диффузия мембранных белков происходит в компартментах, границы которых определяют так называемые белковые колья (pickets) и актиновый цитоскелет (fence), а связывание плазматической мембраны с выстилающим ее актиновым цитоскелетом оказывает влияние на диффузию мембранных рецепторов, но также допускает их быстрое перескакивание из одного компартмента в другой.
Если допустить, что связывание мишеней с мембранными рецепторами происходит в компартментах, ограниченных актиновым цитоскелетом, то добавление малых доз актиндиссоциирующих препаратов, например ЦБ, должно способствовать усилению латеральной подвижности FcyR и других рецепторов (CR1, CR3), а также усиливать фагоцитоз и сопровождающий его экзоцитоз гранул. Напротив, более высокие дозы ЦВ будут подавлять ремоделирование актина в фагоцитарной чаше и вести к снижению фагоцитарной и экзоцитозной активностям клеток.
Это предположение проверили на модели дегрануляции нейтрофилов человека, стимулированных опсонизирован-ным зимозаном и обработанных ЦБ в широком диапазоне концентраций. Мы показали, что мягкое разрушение акти-нового цитоскелета ЦБ приводит к усилению экзоцитоза азурофильных и специфических гранул на 26 и 33% соответственно. Это повышение соответствовало усилению “дыхательного взрыва” при данных дозах ЦБ.
Напротив, более высокие концентрации ЦБ дозозависимо подавляли экзоцитоз азурофильных (62-68%) и специфических гранул (12-36%) во внешнее окружение клеток при стимуляции OZ. Такое движение гранул в зависимости от структуры актинового цитоскелета мы объясняем тем, что низкие дозы ЦВ способствуют латеральной подвижности FcyR и других рецепторов в мембранных компартментах в соответствии с моделью A. Kusumi и соавт. [6, 7], а более высокие концентрации ЦБ нарушают ремоделирование актина в фагоцитарной чаше и подавляют фагоцитоз и сопровождающий его экзоцитоз гранул во внешнее окружение нейтрофила.
Интересно, что в работе B. Treanor и соавт. [23] недавно продемонстрирована прямая ассоциация В-клеточных рецепторов с актиновым цитоскелетом. Использование метода флюоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения TIRFM (high-speed dual-view acquisition total internal reflection fluorescence microscopy) позволила авторам показать, что актин и эзрин образуют сеть микронных компартментов, определяющих границы диффузии B-клеточных рецепторов. Кроме того, P. Mattila и соавт. [24] показали, что в покоящихся В-клетках предсуществующие нанокластеры BCR и CD19 расположены в различных компартментах плазматической мембраны, образованных актиновым цитоскелетом. Добавление к клеткам антигена приводит через BCR к локальной реорганизации цитоскелета, высвобождающей нанокластеры рецепторов из компартментов и способствующей их взаимодействию с нанокластерами CD19, которые в свою очередь организуются сетью тетраспанинов CD81. В результате объединение этих нанокластеров способствует привлечению других эффекторных молекул и распространению сигнала на
- 127 -
ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2014
Рис. 4. Модель, описывающая процесс дегрануляции при активации нейтрофилов человека опсонизированным зимозаном.
Контролируемая деполимеризация актина инициируется после лигирования FcyR с IgG (1). Ремоделирование актина (2) высвобождает Fcy-рецепторы из компартментов, образованных актиновым цитоскелетом, что способствует образованию микрокластеров FcyR. Кластеризация Fcy-рецепторов обеспечивает прочное связывание мишени и образование сигналов, активирующих тирозинкиназу, P13K, MAP-киназ. Далее происходит синтез F-актина de novo, что ведет к образованию филоподий и погружению мишени в цитоплазму. Одновременно происходит синтез F-актина, обеспечивающий транспортную сеть для переноса гранул к цитоплазматической мембране и их экзоцитоз. В этом процессе принимают участие ГТФаза Rac 2, MAP-киназы и протеинкиназа С.
новые BCR, даже не активированные антигеном. Таким образом, результаты представленных работ показали, что мембранный цитоскелет играет важную роль в контроле динамики B-клеточного рецептора и передаче сигнала.
В заключение нам хотелось бы отметить, что данные, полученные в настоящей работе, подтверждают модель компар-тментализации цитоплазматической мембраны, обусловленной кортикальным актиновым цитоскелетом, предложенной A. Kusumi и соавт. (модель fence и pickets) [6, 7].
Основываясь на данных, полученных в работе, мы предлагаем рабочую модель, описывающую процесс дегрануляции при активации нейтрофилов опсонизированным зимозаном (рис. 4). В соответствии с этой моделью деполимеризация актина способствует микрокластеризации FcyR и других поверхностных рецепторов и последующей передаче сигналов, регулирующих фагоцитоз и экзоцитоз гранул.
Следует сказать, что дегрануляция нейтрофилов человека в ответ на растворимые стимулы, например хемоаттрактант ФМЛФ, отличается от таковой, индуцированной таким нерастворимым индуктором, как OZ. Для активации дегрануляции, индуцированной ФМЛФ, не требуется ремоделирования актина, который сопровождает интернализацию и фагоцитоз мишеней. Поэтому дегрануляция, активированная ФМЛФ,
сопровождается синтезом F-актина de novo для обеспечения транспортной сети, необходимой для сборки субъединиц NADPH-оксидазы [25] и передвижения гранул к цитоплазматической мембране [13]. В связи с этим динамика дегрануляции при добавлении ЦБ в широком диапазоне концентраций и активировании ФМЛФ сильно отличается от таковой при активации OZ. Таким образом, сложные процессы ремоделирования актина, происходящие на начальных стадиях фагоцитоза, таких как связывание мишеней и их интернализация, находят свое отражение в динамике экзоцитоза гранул и могут представлять собой важную модель в исследовании функциональной активности нейтрофилов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Borregaard N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 2010; 33(5): 657-70.
2. Kantari C., Pederzoli-Ribeil M., Witko-Sarsat V The role of neutrophils and monocytes in innate immunity. Contrib. Microbiol. 2008; 15: 118-46.
3. Flannagan R.S., Jaumouille V, Grinstein S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 2012; 7: 61-98.
4. Michl J., Pieczonka M.M., Unkeless J.C., Bell G.I., Silverstein S.C. Fc receptor modulation in mononuclear phagocytes maintained on
- 128 -
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
immobilized immune complexes occurs by diffusion of the receptor molecule. J. Exp. Med. 1983; 157(6): 2121-39.
5. Singer S.J., Nicolson G.L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 1972; 175(4023): 720-31.
6. Kusumi A., Sako Y., Yamamoto M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophys. J. 1993; 65(5): 2021-40.
7. Kusumi A., Nakada C., Ritchie K., Murase K., Suzuki K., Murakoshi H. et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2005; 34: 351-78.
8. Saxton M.J. Lateral diffusion in an archipelago. Single-particle diffusion. Biophys. J. 1993; 64(6): 1766-80.
9. Jaumouille V, Grinstein S. Receptor mobility, the cytoskeleton, and particle binding during phagocytosis. Curr. Opin. Cell. Biol. 2011; 23(1): 22-9.
10. Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow. Introduction. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1968; Suppl. 97: 7.
11. Воробьева Н.В., Муругин В.В., Кулаков В.В., Пинегин Б.В. Изучение роли активных форм кислорода в процессе дегрануляции нейтрофилов человека. Иммунология. 2012; 33(1): 11-6.
12. Burgoyne R.D., Morgan A. Secretory granule exocytosis. Physiol. Rev. 2003; 83(2): 581-632.
13. Jog N.R., Rane M.J., Lominadze G., Luerman G.C., Ward R.A., McLeish K.R. The actin cytoskeleton regulates exocytosis of all neutrophil granule subsets. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2007; 292(5): 1690-700.
14. Lyubchenko T.A., Wurth G.A., Zweifach A. The actin cytoskeleton and cytotoxic T lymphocytes: evidence for multiple roles that could affect granule exocytosis-dependent target cell killing. J. Physiol. 2003; 547(3): 835-47.
15. Pendleton A., Koffer A. Effects of latrunculin reveal requirements for the actin cytoskeleton during secretion from mast cells. Cell. Mo-til. Cytoskeleton. 2001; 48(1): 37-51.
16. Oheim M., Stuhmer W. Tracking chromaffin granules on their way through the actin cortex. Eur. Biophys. J. 2000; 29(2): 67-89.
17. Greenberg S., Chang P., Silverstein S.C. Tyrosine phosphorylation of the gamma subunit of Fc gamma receptors, p72syk, and paxillin during Fc receptor-mediated phagocytosis in macrophages. J. Biol. Chem. 1994; 269(5): 3897-902.
18. Herskovitz B., Guerry D, Cooper R.A., Schreiber A.D. Effect of cytochalasin B on human monocyte binding and sphering of IgG-coated human erythrocytes. Blood. 1977; 49(2): 289-94.
19. Lawrence W.D., Packman C.H., Rowe J.M., Lichtman M.A. Attachment of particle-bound IgG and complement to human neutrophils. Blood. 1981; 58(4): 772-81.
20. Dale B.M., Traum D., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Greenberg
S. Phagocytosis in macrophages lacking Cbl reveals an unsuspected role for Fc gamma receptor signaling and actin assembly in target binding. J. Immunol. 2009; 182(9): 5654-62.
21. Bentwood B.J., Henson P.M. The sequential release of granule constituents from human neutrophils. J. Immunol. 1980; 124(2): 855-62.
22. Morone N., Fujiwara T., Murase K., Kasai R.S., Ike H., Yuasa S. et al. Three-dimensional reconstruction of the membrane skeleton at the plasma membrane interface by electron tomography. J. Cell Biol. 2006; 174(6): 851-62.
23. Treanor В., Depoil D., Gonzalez-Granja A., Barral P., Weber M., Du-shek O. et al. The Membrane Skeleton Controls Diffusion Dynamics and Signaling through the B Cell Receptor. Immunity. 2010; 32(2): 187-99.
24. Mattila P.K., Feest C., Depoil D., Treanor B., Montaner B., Otipoby K.L. et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 2013; 38(3): 461-74.
25. Bengtsson T., Orselius K., Wettero А. Role of the actin cytoskeleton during respiratory burst in chemoattractant-stimulated neutrophils. Cell Biol. Int. 2006; 30(2): 154-63.
Поступила 04.02.14
REFERENCES
1. Borregaard N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 2010; 33(5): 657-70.
2. Kantari C., Pederzoli-Ribeil M., Witko-Sarsat V The role of neutrophils and monocytes in innate immunity. Contrib. Microbiol. 2008; 15: 118-46.
3. Flannagan R.S., Jaumouille V, Grinstein S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 2012; 7: 61-98.
4. Michl J., Pieczonka M.M., Unkeless J.C., Bell G.I., Silverstein S.C. Fc receptor modulation in mononuclear phagocytes maintained on immobilized immune complexes occurs by diffusion of the receptor molecule. J. Exp. Med. 1983; 157(6): 2121-39.
5. Singer S.J., Nicolson G.L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 1972; 175(4023): 720-31.
6. Kusumi A., Sako Y., Yamamoto M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophys. J. 1993; 65(5): 2021-40.
7. Kusumi A., Nakada C., Ritchie K., Murase K., Suzuki K., Murakoshi H. et al. Paradigm shift of the plasma membrane concept from the two-dimensional continuum fluid to the partitioned fluid: high-speed single-molecule tracking of membrane molecules. Annu. Rev. Bio-phys. Biomol. Struct. 2005; 34: 351-78.
8. Saxton M.J. Lateral diffusion in an archipelago. Single-particle diffusion. Biophys. J. 1993; 64(6): 1766-80.
9. Jaumouille V, Grinstein S. Receptor mobility, the cytoskeleton, and particle binding during phagocytosis. Curr. Opin. Cell. Biol. 2011; 23(1): 22-9.
10. Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow. Introduction. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1968; Suppl. 97: 7.
11. Vorobjeva N.V., Murugin V.V., Kulakov V.V., Pinegin B.V. Inhibitory analysis of NADPH-oxidase activity in the model of chemoattractant-induced degranulation of human neutrophils. Immunologiya. 2012; 33(1): 11-6. (inRussian)
12. Burgoyne R.D., Morgan A. Secretory granule exocytosis. Physiol. Rev. 2003; 83(2): 581-632.
13. Jog N.R., Rane M.J., Lominadze G., Luerman G.C., Ward R.A., McLeish K.R. The actin cytoskeleton regulates exocytosis of all neutrophil granule subsets. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2007; 292(5): 1690-700.
14. Lyubchenko T.A., Wurth G.A., Zweifach A. The actin cytoskeleton and cytotoxic T lymphocytes: evidence for multiple roles that could affect granule exocytosis-dependent target cell killing. J. Physiol. 2003; 547(3): 835-47.
15. Pendleton A., Koffer A. Effects of latrunculin reveal requirements for the actin cytoskeleton during secretion from mast cells. Cell. Motil. Cytoskeleton. 2001; 48(1): 37-51.
16. Oheim M., Stuhmer W. Tracking chromaffin granules on their way through the actin cortex. Eur Biophys. J. 2000; 29(2): 67-89.
17. Greenberg S., Chang P., Silverstein S.C. Tyrosine phosphorylation of the gamma subunit of Fc gamma receptors, p72syk, and paxillin during Fc receptor-mediated phagocytosis in macrophages. J. Biol. Chem. 1994; 269(5): 3897-902.
18. Herskovitz B., Guerry D, Cooper R.A., Schreiber A.D. Effect of cytochalasin B on human monocyte binding and sphering of IgG-coated human erythrocytes. Blood. 1977; 49(2): 289-94.
19. Lawrence W.D., Packman C.H., Rowe J.M., Lichtman M.A. Attachment of particle-bound IgG and complement to human neutrophils. Blood 1981; 58(4): 772-81.
20. Dale B.M., Traum D., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Greenberg S. Phagocytosis in macrophages lacking Cbl reveals an unsuspected role for Fc gamma receptor signaling and actin assembly in target binding. J. Immunol. 2009; 182(9): 5654-62.
21. Bentwood B.J., Henson P.M. The sequential release of granule constitutents from human neutrophils. J. Immunol. 1980; 124(2): 855-62.
22. Morone N., Fujiwara T., Murase K., Kasai R.S., Ike H., Yuasa S. et al. Three-dimensional reconstruction of the membrane skeleton at the plasma membrane interface by electron tomography. J. Cell. Biol. 2006; 174(6): 851-62.
23. Treanor В., Depoil D., Gonzalez-Granja A., Barral P., Weber M., Du-shek O. et al. The Membrane Skeleton Controls Diffusion Dynamics and Signaling through the B Cell Receptor. Immunity. 2010; 32(2): 187-99.
24. Mattila P.K., Feest C., Depoil D., Treanor B., Montaner B., Otipoby K.L. et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 2013; 38(3): 461-74.
25. Bengtsson T., Orselius K., Wettero ... Role of the actin cytoskeleton during respiratory burst in chemoattractant-stimulated neutrophils. Cell. Biol. Int. 2006; 30(2): 154-63.
Received 04.02.14
- 129 -
