CC BY
51
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИНФЕКЦИЯ КЛЕТОК ГЛИОМ ОШОЛИТИЧЕСКИМ... 45
УДК 616-006.484-085.2/.3.099:578.826 И.В. Уласов1, Н.В. Каверина2, А.Ю. Барышников2 ИНФЕКЦИЯ КЛЕТОК ГЛИОМ ОИКОЛИТИЧЕСКИМ ВИРУСОМ СЕНСИБИЛИРУЕТ ИХ К ТЕРАПИИ ТЕМОЗОЛОМИДОМ 1 Центр опухолей головного мозга, Шведский медицинский центр, Сиэтл, США 2ФГБНУ «РОНЦ им Н.Н. Блохина», Москва Контактная информация Уласов Илья Валентинович, к. б.н., ведущий сотрудник центра лечения опухолей головного мозга адрес: 550 17th Avenue, suite 570, Seattle, Wa, 98122, USA; тел. +1-206-991-2053 e-mail: ulasov75@vahoo.com Статья поступила 03.07.2014, принята к печати 24.11.2014. Резюме Опухолевые стволовые клетки являются объектами исследований и терапевтических интервенций. Недавно популяция клеток, обладающая характеристиками стволовых клеток, была идентифицирована в глиомах. Оказалось, что такие клетки экспрессируют поверхностный маркер проминин-1/ CD133, формируют сфероиды in vitro и отличаются высокой способностью к делению с превращением их в нейроны, астроциты или олиго-дендроциты. Активация генетических программ в опухолевых стволовых клетках контролирует не только их дифференциацию, но и высокую устойчивость к терапевтическим препаратам. В этой работе мы продемонстрировали, что глиомные стволовые клетки могут служить эффективными мишенями для онколитической терапии. Более того оказалось, что онколитическая аденовиротерапия в присутствии ингибиторов GLI-сигнального пути увеличивает эффективность применения темозоломида ex vivo. Ключевые слова: глиома, аденовирус, темозоломид, токсичность.
I.V. Ulasov1, N.V. Kaverina2, A.Yu. Baryshnikov2 INFECTION OF GLIOMAS WITH ONCOLYTIC ADENOVIRUS SENSITIZED THEM TO TEMOZOLOMIDE 1Advanced Brain Rumor Treatment, Swedish Medical Center, Seattle, Wa, USA 2FSBSI «N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center», Moscow Abstract Cancer stem cells are represent one of the target for conventional therapy. Recently, stem cell-like subpopulations have been identified in human gliomas. These cells resemble neural stem cells since they express neural stem cell markers such as prominin-1/ CD133, are capable of self-renewal, form neurosphere-like spheroids, and differentiate into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Activation of genetic program insides these cells governs cells differentiation and their resistance to the therapeutic modalities. In our study we demonstrate that CD133 positive cancer stem cells exhibit prefect opportunity for the oncolytic therapy. Moreover, infection of glioma stem cells in the presence of SHH inhibitor has a beneficial effect for temozolomide application ex vivo. Key words: glioma, adenovirus, temozolomide, toxicity. Введение Давно известно, что вирусы способны селективно убивать клетки опухоли, однако в последние Мультиформная глиобластома - наиболее годы появилась возможность получения вариантов распространенная и агрессивная форма первичной вирусов, обладающих максимальным терапевтическим опухоли головного мозга [1-3]. Несмотря на агрес- потенциалом. Онколитические аденовирусы разраба-сивные терапевтические подходы, включая лечение тываются для направленного уничтожения злокачест-темозоломидом, выживаемость пациентов не пре- венных клеток. Используя различные модели опухоли, вышает 24 мес. Одна из причин низкой продолжи- было показано, что высокая экспрессия вирусных бел-тельности жизни этой группы пациентов может ков аденовирусной области E1A вызывала гибель, забыть связана с нечувствительностью опухолевых раженных, чувствительных к ним раковых клеток. Неклеток к терапии и высоким уровнем их резистент- давно нашей группой было отмечено, что высокая спе-ности, что является большой клинической пробле- цифичность аденовируса может быть увеличена за счет мой в нейроонкологии. использования специфичного промотора и/или путем Мультиформная глиобластома является вы- клонирования рецептор-связывающих доменов в соко гетерогенной опухолью, состоящей из попу- структурные белки аденовируса [8; 13]. Поскольку ляции клеток, обладающих различным потенциа- ингибирование роста глиом связано с аттенуацией рослом к росту и чувствительности к терапии [4; 9; 10]. та опухолевых стволовых клеток, мы изучили возмож-Известно, что проминин (CD133) - маркер мезен- ность направленной доставки вирусных белков в химальных CD34+ клеток, представлен на поверх- CD133+ клетки в присутствии химического ингибитора ности стволовых клеток глиом, резистентных к те- GLI-сигнального пути и темозоломида. Мы предпола-рапии [11]. Показано, что в данных клетках генети- гаем, что комбинирование онколитической терапии с ческие изменения затрагивают WNT-, NOTCH- и ингибированием GLI-сигнального пути ограничит GLI- сигнальные пути, которые необходимы клет- пролиферацию CD133+ клеток и усилит терапевтиче-кам для поддержания жизнедеятельности. ский эффект темозоломида.
№ 4/том 13/2014 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
46 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИНФЕКЦИЯ КЛЕТОК ГЛИОМ ОНКОЛИТИЧЕСКИМ...
Материалы и методы цу между величинами, соответствующую p<0,05, принимали как достоверную. Клеточные культуры Линия глиом человека U251MG была полу- Результаты и обсуждение чена в Американской коллекции клеточных линий (ATCC, США). Клетки были культивированы в Для определения чувствительности стволо-среде MEM (HyClone, США), содержащей 10 %- вых клеток глиом к аденовирусной инфекции мы ную ТЭС, 1 %-ную смесь пенициллина и стрепто- изучили экспрессию аденовирусных рецепторов на мицина (Invitrogen, США). Первичные клетки гли- поверхности клеток-мишеней. областом были получены от пациентов с диагнозом Для этого мы выделили СБ133+-клетки из "глиома IV степени злокачественности в процессе общей популяции клеток глиом. В наших экспери-оперативного вмешательства". Все процедуры бы- ментах уровень СБ133+-клеток варьировал в прели проведены в отделении нейроонкологии делах 0,2-26,8 % от общего количества клеток, од-Institutional Review Board Российского Онкологиче- нако при использовании APC-меченных антител ского Центра. Культура CD133+ и CD133- клеток процент CD133+-KreTOK в выделенной популяции была культивирована в среде Neurobasal A, содер- вырос до 60-70 %. Выделенные клетки были про-жащей 20 нг/мл FGF, 20 нг/мл of EGF, N2 и В27 анализированы в реакции проточной цитофлуоро-супплемент (Invitrogen, США) [7]. метрии с использованием антител к аденовирусным рецепторам (рис. 1, табл.). Иммунофлуоресцентный анализ и сортинг Было показано, что CD133+-KreTKH содержа-CD133+-^eTKH, полученные в результате ли высокий уровень и а^5 интегринов, кото-сортинга, были проинкубированы с 1 мкг одного из рые, как известно, являются маркерами активной следующих первичных антител: CD80 (BD инвазии и ангиогенеза глиом. Pharmingen, США), CD86 (Chemicon, США), CAR Оказалось, что интегрин а^3 был детектиро-(Abcam, США), CD46 (BD Pharmingen, США), а^3 ван на поверхности 27,3 %; 64,1 % и 58,1 % клеток (Chemicon, США), или 0vß5 (Chemicon, США) в те- ГБМ1, ГБМ2 и U251, тогда как рецептор 0vß5 был чение 30 минут при 4 °C. На следующем этапе дан- обнаружен на поверхности клеток 11 % ГБМ1; ные клетки промывали 3-кратно по 5 минут в 66,7 % ГБМ1 и 3,12 % U251. 0,01М фосфатном буфере (pH 7,6) и инкубировали На следующем этапе исследования мы ин-с 1 мкг вторичных антител (BD Pharmingen, США). фицировали клетки CD133+ и ОТ133различными Изотипический контроль был использован для оп- аденовирусами (AdWT-Luc, Ad5/3-Luc, AdRGD-ределения неспецифического связывания для каж- Luc, AdCAV1-Luc AdCAV2-Luc), распознающие дого антитела. Подсчет клеток производили на ана- следующие рецепторы: CD46, CAR, CD80, CD86 и лизаторе FACSCanto (Becton&Dickinson, США). В интегрины. каждом образце были проанализированы минимум Мы обнаружили, что модификации вируса 10000 клеток. RGD и CAV2 обеспечивают наивысший уровень инфекции опухолевых CD133+ клеток глиом (в 1,7-Вирусы и химиопрепараты 2 увеличенная инфекционность vs ADWT). Похо-Репликативно-деффектные AdWT-Luc, AdRGD- жие результаты были получены при инфекции Luc, AdCAV1 -Luc, AdCAV2-Luc и Ad5/3-Luc векто- CD133+ и251-перевиваемых клеток. ра, содержащие ген люциферазы под контролем Поскольку CD133+-^eTKH (ГБМ1 и U251) CMV-промотора, были описаны ранее [5; 12]. Посте- содержат на своей поверхности большое количест-янно реплицирующиеся векторы, содержащие промо- во рецепторов avß3 и övß5, можно предположить тор гена сюрвивина человека, а также белок фибер наличие корреляции между активностью AdRGD-"дикого" типа или модификации RGD, pk7, 5/3 были Luc вектора и высоким уровнем рецептора 0vß3. получены нами, используя AdEasy протокол [6]. Титр Как показывают данные предыдущих иссле-вирусов был определен по протоколу производителя дований, клонирование промотора увеличивает (Adeno Titer X kit, Clontech, США). специфичность аденовирусных векторов. В этой связи мы изучили экспрессию потен-Анализ люциферазной активности циальных промоторов, чья экспрессия увеличена в Люциферазная активность была измерена пу- CD133+-клeткаx. тем добавления 20 мкл люциферазного субстрата По данным экспериментального анализа (Promega,США) к 50 мкл лизированных клеток и шести клинических образцов сурвивин обеспечива-затем измерена на люминометре (Turner Biosystems, ет наивысший уровень транскрипции среди изу-США). Результаты были стандартизированы, ис- ченных потенциальных кандидатов (рис. 2). пользуя Bio-Rad protein assay (Bio-Rad, США). Таким образом, можно предположить, что клонирование промотора сурвивина в состав ви-Инфекция клеток русного генома позволит увеличить инфекцион-аденовирусным вектором ность и специфичность рекомбинантных аденови-CD133+ и CD133- клетки в количестве 1*103 русных векторов к CD133+-клeткам. С этой целью через 24 ч после начала эксперимента были инфи- нами была сконструирована панель онколитиче-цированы в дозе 100 частиц на клетку. Час спустя ских векторов, чья токсичность изучена далее в не адсорбированный на клетках вирус был удален, реакции LDH. клетки промыты фосфатным буфером, и к клеткам Как представлено на рис. 3, наибольшая ток-добавлена среда с ростовыми факторами. Через 1; сичность была обнаружена после инфекции SS-3; 5 или 7 дней после инфекции клетки были про- RGD вектора. От 40 до 70 % CD133+ клеток, выде-анализированы в реакции количественных транс- ленных из двух ГБМ1 и ГБМ2 клинических образ-крипции и репликации, клеточной токсичности цов, были лизированы RGD-модифицированным (LDH, Promega, США) или титровании вируса. вектором. Данная активность была в 1,5-4 раза Статическую значимость результатов больше по отношению контрольному вектору оценивали с помощью критерия Стьюдента. Разни- Had5RGD.
№ 4/том 13/2014 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
Таблица
Фенотипические характеристики выделенных CD133 -стволовых клеток глиом
Рецептор Case/CD133+
GBM, grade 4 H. Glioma cell
GBM1 GBM2 U373MG
CD80 0 20,5 1,82
CD 86 2,85 55,6 14,9
CAR 35,3 0 6,9
CD 46 22,5 61,5 18,2
avß3 27,3 64,1 58,1
avß5 11,0 66,7 3,12
Рис. 1. Экспрессия иитегрииов на поверхности СЭ133 позитивных клеток обеспечивает высокий уровень инфекции стволовых клеток глиом:
а. Определение экспрессии СБ133 в клетках первичных глиом с помощью метода проточной цитофлуорометрии;
б. Эффективность инфекции СБ133+ стволовых клеток глиом аденовирусными векторами. Через 48 часов после инфекции СБ133+ клетки были проанализированы на люциферазную экспрессию. Результаты представлены как уровень экспрессии люциферазы по отношению к контрольному вектору А(1"МТ-1ис (А(!ШТ).
Рис. 2. Транскрипционный анализ экспрессии генов в CD 133 позитивных клетках глиом с помощью количественного ПЦР. Активность CXCR4, Survivin, C-myc, BMI1, Sox2, Olig2, Nanog, Nestin, Mushashi, CD 133, OCT4, как будущих промоторов для аденовирусного генного трансфера. В исследовании использовано 7 клинических образцов.
48
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ИНФЕКЦИЯ КЛЕТОК ГЛИОМ ОНКОЛИТИЧЕСКИМ..
ГБМ1
ГБМ2
CD 133+ CD 133-
о о
II-
а:
ф
=г о о. 1=
100 908070 60 50 40 30 20 10 0
¡# юо
5 90
8 80 ? 701 60" р 50
ь 40
§ 30-
а 20
С 10
U251
Ш
»v><
^ J* ^
9Г
I
Ii
\f # #
Рис. 3. СБ133+-клетки чувствительны к инфекции онколитическим вирусом в CD133+ или СБ133-клетках была определена с помощью количественного ПЦР и LDH анализа.
а. Вирусная репликация
б. клеточная токсичность
Рис. 4. Инфекция клеток глиом в присутствии ингибитора 8НН повышает чувствительность СБ133+ к темозо-ломиду. СШ33+-клетки были инфицированы вирусом СКА^8-ЯОБ в присутствии/отсутствии смеси 8НН ин-гибитора/темозоломида и последующая токсичность определена в течение 3 дней. Среднее значение ± стандартное значение (8Б). представлены на основании 5 повторов, р<0,05
Ранее мы показали, что инфекция аденовирусом оказывает аддитивный противоопухолевый эффект на активность темомозоломида. Поскольку существуют данные, показывающие, что ингибиро-вание вЫ-сигнального пути увеличивает антигли-омную активность темозоломида, мы предполагаем, что комбинация онколитического вируса с ингибитором вЫ способна еще больше усилить терапевтический эффект темозоломида. В наших экспериментах показано, что обработка СБ133+-клеток с вирусом 88-ЯОБ в присутствии ингибитора вЫ увеличивала токсичность темозоломида (с 0,48±0,03 до 0,69±0,07; рис. 4).
Токсичность вируса 88-ЯОБ, вЫ ингибитора и темозоломида по отдельности была значительно меньше.
В результате нашего исследования показано, что возможную резистентность темозоломида можно преодолеть, используя онколитический агент в комбинации с вЫ-ингибитором. Поскольку многие антиглиомные агенты проходят клинические испытания, их комбинация имеет большое практическое значение.
Заключение
Литература
1. Брюховецкий И.С., Брюховецкий А.С., Мищенко П.В., Хотимченко Ю.С. Роль системных механизмов миграции и хоуминга стволовых клеток в развитии злокачественных опухолей центральной нервной системы и разработка новых методов противоопухолевой терапии // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т. 12, № 4. - С. 3-12.
2. Уласов И.В., Каверина Н.В., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю. Антиглиомная аденовирусная вироте-рапия: механизм, регуляция и клинические перспективы // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 2. - С. 11-8.
3. Уласов И.В., Каверина Н.В., Барышников А.Ю. Роль сурвивина в диагностике и терапии опухолей головного мозга // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 2. - С. 71-6.
4. Bao S., Wu Q., McLendon R.E. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response // Nature. - 2006. - 444(7120). - P. 756-60.
5. Borovjagin A. V., Krendelchtchikov A., Ramesh N. Complex mosaicism is a novel approach to infectivity enhancement of adenovirus type 5-based vector // Cancer Gene Ther. - 2005. - 12(5). - P. 475-86.
6. He T.C., Zhou S., da Costa L.T. A simplified system for generating recombinant adenoviruses // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1998. - 95(5). - P. 2509-14.
7. Lee J., Kotliarova S., Kotliarov Y. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines // Cancer Cell. - 2006. - 9(5). - P. 391-403.
8. Mei Y.F., Segerman A., Lindman K. Human hematopoietic (CD34+) stem cells possess high-affinity receptors for adenovirus type 11p // Virology. - 2004. - 328(2). - P. 198-207.
9. Salmaggi A., Boiardi A., Gelati M. Glioblastoma-derived tumorospheres identify a population of tumor stem-like cells with angiogenic potential and enhanced multidrug resistance phenotype // Glia. - 2006. -54(8). - P. 850-60.
10. Singh S.K., Clarke I.D., Terasaki M. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors // Cancer Res. - 2003. - 63(18). - P. 5821-8.
11. Stupp R., Hegi M.E. Targeting brain-tumor stem cells // Nat Biotechnol. - 2007. - 25(2). - P. 193-4.
12. Takayama K., Reynolds P.N., Short J.J. A mosaic adenovirus possessing serotype Ad5 and serotype Ad3 knobs exhibits expanded tropism // Virology. - 2003. - 309(2). - P. 282-93.
13. Tuve S., Wang H., Ware C. A new group B adenovirus receptor is expressed at high levels on human stem and tumor cells // J Virol. - 2006. - 80(24). - P. 12109-20.
