CC BY
81
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИНГИБИТОР КЛЕТОЧНОГО БЕЛКА Р53... 25
УДК 616-006.831-085.2/.3:578.826:576.533 И.В. Уласов1, Н.В. Каверина2, А.Ю. Барышников'2 ИНГИБИТОР КЛЕТОЧНОГО БЕЛКА Р53 ПОЗИТИВНО РЕГУЛИРУЕТ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ ОНКОЛИТИЧЕСКОГО ВЕКТОРА В КЛЕТКАХ ГЛИОБЛАСТОМЫ 1 Центр опухолей головного мозга, Шведский медицинский центр, Сиэтл, США 2ФГБНУ «Российский онкологический научный центр им Н.Н. Блохина», Москва Контактная информация Уласов Илья Валентинович, к. б.н., ведущий сотрудник центра лечения опухолей головного мозга адрес: 550 17th Avenue, suite 570, Seattle, Wa, 98122, USA; тел. +1-206-991-2053 e-mail: ulasov75@vahoo.com Статья поступила 03.10.2014, принята к печати 24.11.2014. Резюме Резистентность мультиформных глиобластом требует создания новых подходов для терапии опухолей головного мозга. Белок Р53 - один из главных клеточных онкогенов, чья экспрессия увеличена в 50% клеток глиобластом. Эффект ингибитора Р53 был изучен в присутствии онколитического аденовируса, и темодала, демонстрирующих противоопухолевый эффект на глиобластомных моделях. В клетках U87 глиобластомы человека мы обнаружили аддитивный эффект между ингибированием Р53, активностью аденовирусного вектора и противоопухолевой активностью алкилирующег о химиопрепарата темодал, выражающийся в увеличенной опухолевой токсичности. Оказалось, что ингибирование Р53 химическим реагентом PFTa вызывает активацию аутофагии, одного из вариантов клеточной смерти. Таким образом, данная терапевтическая комбинация может представлять один из возможных способов увеличения противоопухолевого эффекта онколитического вируса. Ключевые слова: аденовирус, P53, аутофагия, пролиферация.
I.V. Ulasov1'2, N.V. Kaverina2 and A.Yu. Baryshnikov2 SUPPRESSION OF CELLULAR P53 PROMOTES CYTOTOXICITY OF ONCOLYTIC VECTOR 1AT THE MODELS OF HUMAN GLIOBLASTOMA 1The Center for Advanced Brain Tumor Treatment, Swedish Medial Center, Seattle, USA 2FSBSI «N'N. Blokhin Russian Cancer Research Center», Moscow, Russia Abstract Glioblastoma multiforme resistance requires a new approach for glioma therapy. Protein p53 is one of the main cellular oncogene, overexpressed in 50% of brain tumor cases. Impact of p53 attenuation was evaluated in the presence of oncolytic adenovirus and temodar, which exhibit anti-glioma effect using in vitro glioma models. Using U87 human glioma cells we observed an additive effect between alkilated chemotherapeutic agent temodar and oncolytic adenovirus which results into p53 inhibition. It occurs that attenuation of p53 using PFTa inhibitor, significantly prolongs cell death type II- autophagy and, therefore improves effect mediated by autophagy induced agents. In conclusion, combination of PFTa and temodar might represent a powerful therapeutic combination which sensibilises glioma cells to the infection with oncolytic vector. Key words: adenovirus, p53, autophagy, proliferation. Введение интервенций и влияет на выживаемость пациентов. Похожая проблема ассоциирована с препаратом Глиобластома является самой распростра- направленного действия против клеточного белка ненной формой опухолей ЦНС [1; 2; 4]. В послед- Р53. Оказалось, что, несмотря на сниженную спо-ние годы произошел существенный прогресс в по- собность химических ингибиторов белка Р53 про-нимании механизма резистентности глиом к теку- никать через гипоталамо-гипофизарный барьер, щей терапии. Так, недавние исследования, прове- продолжительный курс химиотерапии с использо-денные группой Galvin-Burgess, показали, что гли- ванием Р53-ингибитора повышал противоопухоле-областомы представляют собой гетерогенную по- вый эффект. пуляцию клеток, имеющих различный фенотип [6]. Таким образом, ведется поиск новых тера-Одной из таких фенотипических характеристик певтических путей, повышающих эффективность является активация генетических программ, регу- химиотерапии и снижающих побочный токсиче-лирующих клеточные сигнальные пути, такие как ский эффект по отношению к здоровым клеткам. ангиогенез и клеточное деление. Клеточный белок Комбинирование химиотерапии с терапией Р53 относится к группе белков, регулирующих кле- онколитическими векторами является одним из точный гомеостаз [7]. методов, который нашел свое экспериментальное Химиотерапия - один из видов противоопу- подтверждение в противоопухолевой терапии. В холевой терапии, применяемой в лечении глиобла- настоящее время в мире созданы несколько прото-стом. Несмотря на широкое применение, отсутст- типов генно-инженерных вакцин на основе ОН-вие селективности по отношению к опухолевым ВИР, имеющих ограниченную репликацию в нор-клеткам снижает эффективность терапевтических мальных клетках, но способных вызывать клеточ-
№ 1/том 14/2015 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
26 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИНГИБИТОР КЛЕТОЧНОГО БЕЛКА Р53...
ную смерть клеток-мишеней [S; 9]. Так, одной из было добавлено к каждой лунке для дальнейшей таких конструкций является вектор CRAd-s-pK7, инкубации. Спустя 4 ч после инкубации при 5 % который эффективно инфицировал клетки глиобла- CO2 при +37 °C, к каждой лунке добавили 0,1 мл стом и вызывал токсичность, ассоциированную с ДMСО для ингибирования метаболической реак-развитием как апоптоза, так и аутофагии. Высокая ции и разрушения формазана активно делящимися продукция вирусных частиц инфицированной клет- клетками. кой способствовала терапевтическому эффекту на Оптическое поглощение было измерено при неопластических клетках. X 540 нм. Жизнеспособность клеток определяли по Целью настоящей работы являлось изуче- исключению красителя трипанового синего (Fisher ние терапевтического эффекта между онколитиче- Scientific США). ским вирусом, темодалом и ингибированием Р53. Цитологический метод Материалы и методы окрашивания клеток, имеющих фрагментацию ДНК Клетки и клеточные линии TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-Эмбриональные клетки почки эмбриона че- mediated dUTP nick end labeling) был произведен со-ловека HEK293, человеческие клетки глиобласто- гласно рекомендациям фирмы-производителя Roche мы N10 и US7, и клетки аденокарциномы человека (США) для набора In situ cell death Detection kit. A549 были получены из японской (Tokyo, Япония) и американской коллекции клеточных линий Анализ экспрессии белков (ATCC, Manassas, VA). с помощью вестерн блоттинга Клетки были выращены в Дульбеко модифи- Клетки, выращенные в 6-луночном планше-цированной среде Игла (DMEM; Life Technologies), те, были затем обработаны темодалом, инфициро-содержащей 10 % ТЭС (фетальной бычьей сыво- ваны онколитическим вирусом CRAd-S-pK7 (5 ротки) ;GIBCO-Life Technologies, США), 2 mM L- IU/мл), или в комбинации темодал-ОНВИР в при-глутамита, 100 IU/мл пенициллита, 50 IU/мл сутствии или отсутствии ингибитора PFTa. Через стрептомицин (Invitrogen, США). Клетки культи- 72 ч после начала эксперимента клетки были лизи-вировали при температуре +37 °С в присутствии рованы в буфере, содержащем 50мM HEPES; 0,15 5% СО2. M NaCl, 0,5 %-ный Nonidet P-40 и смесь протеи- назных ингибиторов. Белковые фракции были ис-Реагенты следованы в 10 %-ном ПААГ-геле и перенесены на Темодал (Temozolomide), ингибитор клеточ- поливинилидин дифлуорид мембрану (PVDF, Bio-ного Р53 (PFTalpha), 2 %-ный водный раствор AO и Rad, США). Mембраны были проинкубированы с PI, 1 мг/мл были получены из компании Sigma- первичными антителами P53 (клон DO-1), E1A Aldrich (США). (клон M5S) и Актин (клон с-2), указанные антитела В качестве растворителя для темодара и ин- были получены из компании Santa Cruz Biotech-гибитора Р53 использовали ДMСО с целью полу- nology (Техас, США). чения 100^M раствора темодала [10] и 20мM рас- Связанные первичные антитела были детек-твора PFTa (1000* раствор, [11]). тированы со вторичными антителами, конъюгиро- ванными с пероксидазой хрена Santa Cruz Вирусные вектора Biotechnology (Техас, США). Детекция белковых Постоянно реплицирующийся компетентный фракций была произведена с помощью реакции аденовектор CRAd-S-pK7 был получен путем гомо- хемилюминесценции согласно инструкции (Bio-логической рекомбинации с SpeI-обработанной Rad, Hercules, Калифорния, США). плазмидой, кодирующей полноразмерный геном аденовируса, содержащего 7 аминокислотных ос- Определение клеточного деления татков полилизина, вклонированных в С- и аутофагии терминальный конец гена полноразмерного белка с помощью иммунофлуоцитометрии фибера типа 2 аденовирусов, с El-pSurvivin шаттл Анализ клеточного деления был проведен с плазмидой. Вирусная конструкция была получена использованием АО или PI. Клетки, обработанные путем трансфекции клеток HEK293 плазмидой. темодаром, инфицированные онколитическим ви-CRAd-S-p^-вирус был наработан в клетках A549 русом CRAd-S-pK7 (5 IU/мл), или в комбинации и тестирован с использованием Adeno Titer X kit темодал-ОНВИР в присутствии или отсутствии (Clontech, Mountain View, Ca, USA). ингибитора PFTa были центрифугированы. Затем часть клеточного осадка была дважды Тест для определения пролиферации промыта в фосфатно-солевом буфере и зафиксиро-клеток (MTT-тест) вана в 70 %-ном этаноле перед окраской PI (50 Опухолевые клетки культивировали при mg/мл) на 4 ч. Вторая часть осадка была окрашена температуре +37 °С в присутствии 5 % СО2 в среде раствором АО. ,3MEM, содержащей 2 мM L-глутамина и 10 % ТЭС Анализ распределения клеток по фазам кле-(«Atlanta Bio», Atlanta, США). Клетки, достигшие точного деления был осуществлен с помощью про-логарифмической фазы роста, пассировали в плос- точной цитофлуориметрии. Данные была получены кодонные 9б-луночные микропланшеты («Costar», после анализа 10 000 клеточных событий. США) по 5 000 - б 000 клеток на лунку и инкубировали в указанных выше условиях в течение 24 ч Статистический анализ перед добавлением тестируемого вещества. Результаты представлены в виде стандартно-Для определения цитотоксичности клеточ- го значения ± стандартное отклонение. Статистиче-ные линии были инфицированы CRAd-S-pK7- ский анализ был выполнен с использованием теста вектором в разной множественности инфекции. Стьюдента (SPSS 13.0 программа, Чикаго, Илли-Через 72 ч после инфекции 200 микролитров нойс, США). Разница меньше 0,05 означала суще-Mrr (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) ственное различие.
№ 1/том 14/2015 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ИНГИБИТОР КЛЕТОЧНОГО БЕЛКА Р53.
27
Рис. 1. Вестерн блоттинг анализ экспрессии белка Р53 в клеточных лизатах и87 и N10 глиобластом человека в условиях нормального роста клеток и после облучения ионизирующим излучением.
Рис. 2. Влияние индукции клеточного белка Р53 на клеточную токсичность:
Б - белковые фракции клеток глиомы человека и87, инфицированных ОНВИР, обработанных темодалом, или комбинацией ОНВИР+темодал, были проанализированы с помощью вестерн-блотта с антителами к Актину, Р53 и аденовирусной области Е1А белка (клон М58).
Контроль
Темодар
ОВ
ОВ+Темодар
» с
0 £Е
ЕЗ
ф
у
1
61 70.9 . в 9.1 аг/гл го
1
61 62.1
3 12.9
1 62/М 25.0
ДМСО
РРТа
ингибирование
ДМСО£
Пропидиум Иодид
##
ВД1
(ДНК)
РРТа
11
Ю1 ЗЭ
1в2/М
100
•й I-
о о
х —
о ^
о
60
40
20
1 2 3
I ДМСО ] РРТа
I
I I
Темщаар ОВ ОВ+Темодар
К
О Ё
| 100
-й X ей
со о с
о <
80
60
40
20
##
I ДМСО I РРТа
Г
Л
#
\
ж
*
«Й к
Темодар ОВ ОВ+Темодар
Рис. 3. Ингибирование клеточного Р53 повышает чувствительность опухолевых клеток к терапии те-модалом в комбинации с ОНВИР:
А - распределения клеточных популяций по фазам клеточного деления в присутствии ингибитора Р53; Б - график анализа клеточной пролиферации после обработки клеток ингибитором Р53 в присутствии ОНВИР и темодала, " # "и "##" р<0,05; В - повышение уровня аутофагии в клетках после обработки ингибитором Р53 в присутствии ОНВИР и темодала;
Г - трипан+ клетки в образцах с ингибитором Р53, обработанных темодалом и ОНВИР. "*", "**", "***" р<0,05 в сравнении с ДМСО обработанными образцами, "#" и "##" в сравнении с темодалом и ОНВИР обработанными образцами.
Б
В
№ 1/том 14/2015
РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
28 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ИНГИБИТОР КЛЕТОЧНОГО БЕЛКА Р53...
Результаты и обсуждение Поскольку функциями клеточного белка P53 являются транскрипционная регуляция клеточного Функциональная характеристика цикла и контроль за клеточной реакцией на повре-клеточного P53 ждение ДНК, мы предположили, что ингибирова-Эксперимент по индукции экспрессии белка ние P53 может усилить цитотоксическую реакцию P53 в модификации [3; 12] проводили в частоте 0- в клетках глиобластомы U87. 20 Грей [3; 12]. Клетки были собраны для анализа экспрессии белка через 24 и 48 ч после облучения Ингибирование P53 ионизирующей радиацией. На рис. 1 показано, что повышает активность ОНВИР ионизирующее излучение увеличивало экспрессию и темодала P53 только в клетках опухоли головного мозга N10, Как оказалось, в соответствии с нашей гипоте-но не в клетках опухоли U87. Полученные резуль- зой ингибирование клеточного P53 не нарушало де-таты согласуются с данными литературы [3] и сви- ления клеток U87 (рис. 3, А). При этом оказалось, что детельствуют об отсутствии в этих клетках P53 ингибирование P53 усиливало эффект темодала, "дикого" типа. В то же самое время, ионизирующее ОНВИР и комбинации темодал+ОНВИР, что выра-излучение вызывало индукцию P53 в клетках N10, жалось в накоплении клеток в состоянии G2- и M-фаз что свидетельствует о мутантном типе гена P53. По клеточного цикла (рис. 3, Б). Чтобы определить, приданным литературы, увеличение Р53 в клетках гли- вело ли нарушение клеточного деления ингибитором областом U87 не приводило к возрастанию белка P53 к клеточной смерти, мы пронализировали клетки Р21, для которого Р53 является индуцирующим в реакции клеточной пролиферации. Как оказалось, регулятором клеточного деления [5]. ингибирование P53 также приводило к нарушению клеточной пролиферации. Комбинация По нашим данным, в среднем в 2-3 раза по от-терапевтических подходов ношению к клеткам, обработанным ДМСО, ингиби-вызывает активацию клеточного P53 рование P53 усиливало активность темодала (с 25,2 до Наши предыдущие исследования показыва- 55,8 %), ОНВИР (с 18,2 до 49,4 %) и их комбинации (с ют, что присутствие P53 снижает эффективность 24,1 до 63,8 %, p<0,05; рис. 3, Б). виротерапии с использованием CRAd-S-pK7 векто- По результатам наших исследований, увеличе-ра [10]. Более того, наши недавние предваритель- ние клеточной токсичности при применении темодала ные результаты позволяют предположить, что P53 привело к активации аутофагии. Поскольку активация также негативно влияет на активность темодала, аутофагии может служить как защитным механиз-нашедшего широкое применение в клинической мом, так и механизмом клеточной смерти, с целью практике при лечении глиобластом человека. По- детекции аутофагосом с двойной мембраной мы ок-скольку наша рабочая гипотеза позволяет предпо- расили клетки с помощью акридина оранжевого. Как ложить, что экспрессия P53 препятствует антигли- и ожидалось, ингибирование P53 приводило к увели-омному эффекту CRAd-S-pK7-вектора и темодала, чению числа акридин+ клеток (рис. 3, В). Более того, мы ингибировали экспрессию Р53 в клетках глиоб- результаты окрашивания трипановым синим показа-ластомы человека U87 с помощью химического ли, что ингибирование пролиферации клеток PFTa ингибитора PFTalpha. приводило к клеточной смерти (рис. 3, Г). В этом слу-Мы обрабатывали клетки, содержащие P53 чае, увеличение аутофагии в клетках U87 также со-"дикого типа", темодалом, или ОНВИР CRAd-S- провождалось арестом клеточного деления и накоп-pK7, или их комбинацией (темодал+ОНВИР). Через лением клеток в G2/M фазе клеточного цикла. 72 ч клетки окрашивали с помощью TUNEL и определяли число CRAd-s-pK7-клеток по цитоплаз- Заключение матическому окрашиванию аденовирусных белков области E1A (рис. 2А; см. вклейку). Оказалось, что Таким образом, впервые показано, что инги-комбинация темодал+ОНВИР существенно увели- бирование клеточного белка P53 увеличивает не чивала количество поврежденных клеток глиобла- только токсичность онколитического аденовируса стомы по сравнению с обработкой темодалом или и темодара, но терапевтический эффект их комби-ОНВИР по отдельности. нации. Полученные данные подтверждают сущест-Более того, высокий уровень токсичности венную роль белка P53 в регуляции клеточного соответствовал высокому уровню P53 в этих клет- ответа на внешние стимулы и воздействие химиоп-ках (рис. 2, Б). репаратов в комбинации с аденовирусом. Литература 1. Уласов И.В., Каверина Н.В., Кадагидзе З.Г., Барышников А.Ю. Антиглиомная аденовирусная виротерапия: механизм, регуляция и клинические перспективы // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, №2. - С. 11-8. 2. Уласов И.В., Тусон А., Барышников А.Ю. Белок фибера аденовируса человека обеспечивает стабильность вирусных капсидов // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. - Т. 13, № 2. - С. 51-5. 3. Badie B., Goh C.S., Klaver J., Herweijer H., Boothman D.A. Combined radiation and p53 gene therapy of malignant glioma cells //Cancer Gene Ther. - 1999. - 6. - Р. 155-62. 4. Bao S., Wu Q., McLendon R.E. et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response // Nature. - 2006. - 444. - Р. 756-60. 5. el-Deiry W.S., Tokino T., Velculescu V.E. et al. WAF1 a potential mediator of p53 tumor suppression // Cell. - 1993. - 75. - Р. 817-25. 6. Galvin-Burgess K.E., Travis E.D., Pierson K.E., Vivian J.L. TGF-beta-superfamily signaling regulates embryonic stem cell heterogeneity: self-renewal as a dynamic and regulated equilibrium // Stem Cells. - 2013. - 31. - Р. 48-58. 7. Kremenetskaya O.S., LogachevaN.P., Baryshnikov A.Yu. et al. Distinct effects of various p53 mutants on differentiation and viability of human K562 leukemia cells // Oncology Research. - 1997. - 9. - P. 155-66 8. Ulasov I.V., Tyler M.A., Rivera A.A. et al. Evaluation of E1A double mutant oncolytic... // J Med Virol. - 2008. - 80. - P. 1595-603. 9. Ulasov I.V., Zhu Z.B., Tyler M.A. et al. Survivin-driven and fiber-modified oncolytic adenovirus exhibits potent antitumor activity in established intracranial glioma // Hum Gene Ther. - 2007. - 18. - P. 589-602. 10. Ulasov I.V., Sonabend A.M., Nandi S. et al. Combination of adenoviral virotherapy and temozolomide chemotherapy eradicates malignant glioma through autophagic and apoptotic cell death in vivo // Br J Cancer. - 2009. - 100. - P. 1154-64. 11. Xu G.W., Mymryk J.S., Cairncross J.G. Pharmaceutical-mediated inactivation of p53 sensitizes U87MG glioma cells to BCNU and temozolomide // Int J Cancer. - 2005. - 116. - P. 187-92. 12. Yamashita K., Nakashima S., You F. et al. Overexpression of immediate early gene X-1 (IEX-1) enhances gamma-radiation-induced apoptosis of human glioma cell line, U87-MG. // Neuropathology. - 2009. - 29. - P. 20-4.
№ 1/том 14/2015 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
