CC BY
54
A. Б. Маргулис, М. А. Данилова, П. В. Зеленихин,
B. Я. Пономарев, Б. М. Куриненко
ИНДУКЦИЯ ГИПОМЕТАБОЛИЗМА У КЛЕТОК ПРОКАРИОТ ИОНАМИ Ca2+
Ключевые слова: гипометаболическое состояние, прокариоты, ионы Ca2+, фазовые переходы в мембране.
Исследована возможность индукции гипометаболизма у бактерий при помощи ионов кальция. В диапазоне концентраций 100-200 мМ Са2+ отмечается достоверное изменение соотношения живых клеток и колониеобразующих единиц Micrococcus lysodeikticus в сторону уменьшения последних. При концентрации С3!+ 200 мМ происходит снижение эксимеризации пирена на 22% по сравнению с контролем, что свидетельствует об увеличении микровязкости мембраны.
Keywords: hypometabolic state, prokaryotes, ions Ca2+, phase transitions in membrane.
Studied the possibility of induction of hypometabolism in bacteria by calcium ions. In the concentration range of 100200 mM of Са2+ there was a significant change in the ratio of living cells, and colony forming units of Micrococcus lysodeikticus towards reduction last. At a concentration of 200 mM Са2+ is a decrease of pyrene excimer by 22% compared with the control, indicating an increase in membrane microviscosity.
Введение
Регулирование перехода микроорганизмов в состояние покоя имеет огромное значение для биотехнологии и медицины. Прикладной аспект этой проблемы связан с потенциальной возможностью управления такими процессами, как образование некультивируемых форм патогенов, устойчивых к различным стрессовым условиям, в том числе к фармакологическому воздействию.
Изменение текучести мембран - изменение ее состояния из жидкокристаллического в кристаллическое (или гелеобразное) - связано с подвижностью липидных молекул и с фазовыми переходами в мембране. Основным фактором, вызывающим фазовые переходы мембранных липидов, является изменение температуры среды.
Значение температуры, при которой происходит переход данного липида из кристаллического в жидкокристаллическое состояние (и обратно), называется температурой фазового перехода (ТФП) «гель-жидкий кристалл». Температура фазового перехода зависит от длины углеводородных цепей, наличия и положения цис-этиленовой связи, введение метильных групп в углеводородные связи цепи липидных молекул.
Существенно влияют на ТФП различия в строении полярных головок, а именно степень ионизации полярных групп, присутствие в водной среде двухвалентных катионов, особенно Са2+. таким образом, температура является не единственным фактором, определяющим фазовое состояние липидов. О важности фазового состояния липидов для функционирования мембран свидетельствуют широко известные факты корреляции между температурой фазового перехода мембранных липидов и активностью ряда мембраносвязанных ферментов [1].
Исследования изменения цитоплазматической мембраны при переходе в некультивируемое состояние поможет сделать определенные выводы как об индукции гипометаболического состояние бактерий, так и о возможном выходе из него.
Целью данной работы является оценка способности ионов Са2+ индуцировать гипометаболическое состояние бактерий на примере Micrococcus lysodeikticus. В связи с поставленной целью решались следующие задачи:
1. Определить концентрации Са2+,
индуцирующие быстрый переход клетки в гипометаболическое состояние.
2. Выявить изменения цитоплазматической мембраны микрококка при переходе в состояние гипометаболизма.
3. На основе полученных данных обосновать предполагаемые критерии перехода клетки в гипометаболическое состояние.
Материалы и методы исследования
В работе использовали штамм Micrococcus lysodeikticus из музея кафедры микробиологии. Оценивали влияние ионов Са2+ в концентрации 20, 100, 200 мМ на жизнеспособность бактерий при стандартном количестве клеток в 1 мл суспензии. В качестве источника Са2+ использовали раствор CaCl2.
Для определения процентного соотношения живых и мертвых клеток использовали метод проточной цитометрии, работали на проточном цитометре BD FACSCanto (США) с программным обеспечением FACSDiva. К 1мл суспензии клеток добавляли йодид пропидия (PI) в концентрации 10 мг/мл, выдерживали пробы в темноте в течение 5 минут при комнатной температуре, далее цитометрически детектировали процентное соотношение мертвых и жизнеспособных клеток в популяции.
Для определения мембранных изменений был использован прибор спектрофлуориметр LS55 Perkin Elmer. Исследование состояния мембраны проводили основываясь на известной обратно пропорциональной зависимостью между степенью эк-симеризации пирена и микровязкостью мембраны [2] по методике [3].
Подбор оптимальной концентрации ионов кальция для индукции гипометаболического состояния микрококка
Для каждого из контрольных и опытных вариантов определяли оптическую плотность, количество колониеобразующих единиц и общее число клеток. Исходя из полученных данных, для последующих экспериментов была выбрана максимальная концентрация ионов кальция (200 мМ).
Определение соотношения живых и мертвых клеток при действии ионов кальция на клетки микрококка
С помощью проточной цитометрии было показано, что концентрация ионов кальция 100мМ (рис. 1 Б, В) не изменяет количество мертвых клеток относительно контроля (рис. 1 А). Концентрация 200 мМ (рис. 1 Г, Д) приводит к увеличению числа мертвых клеток (особенно после 24-часовой инкубации - до 43%) (рис. 1 Д). Однако число КОЕ в варианте 200 мМ при 24-часовой инкубации было почти в 8 раз меньше, чем в контроле. Эти данные подтверждают переход клеток в гипометаболиче-ское состояние, индуцированное ионами кальция.
а
тли.
1" ■1 1 ■да '* "г1 тг 1 i 1 11И1| г—г^г 1Г № P4*CPC*Ï*A i uni i ■ 1
ЕЧ«пямнм>« Ъчтягнчг* 1иЫ ШГГЛ ЯксШ с«* fOF OUO MtlKKCUt.rit ЛЛШ1 r*i»24. M121ÎÎ6 «РМ МГТМПМИ мм: зя лаг *?ь: <H»vnai4*ош
rVifiHétn IFmrti Г ВС-А «Taiart Ma ал ИС-й Ум1
■ ■! F-rl, ■ *l ЮМ» 6.5 Л мм $1.111 iТУ 4ÍJÜ* 11.31? Н.ПВ 4МЯ
б зт та-
г -»1 У,!? £ PwCK?iH+ 1 ' тттг—г-■щ
[qaTmilNim St+rmn Ншп+ TtaiMme AKfttlCib í» eue Млк1ЖЕ11_Я1 HWIrtî 10I_1 SíTi 1МЛ ,201 2 1 1104 РМ Adn nnikr 1ШМ 1ИИ>1и0ИММВй>
rctülllf КчпЬ ЧГии! ГВС-А SK-A Huil
■ U EWfl! К I It.IM] mrr ITJHI ИЗ 9 (•,441 Id 3 58 Ü0 IS 4ZJ 31.511 16T.Mi1 113.491 liJ.EDÏ
В
гаипз-идль
PfiCPCÿiîÂ
Ефа-ln art Нагт» Ъцггщп Нжг* T'jll ГЧ4Т>4 hV.'j'J L'.h CMD CLfMllEll ПЧМ12 iDOjM» Hc* 31.10121*44 98 PN Асгтп itÏLI Í «Ol *r-J 1?4-41»М*М-ЮИ*«0а»0* №m<i XT.uli FBG-A Haart »SC -A 4a.ii
■ M E«4H 10O.EOO rrrt PÍ.TJ8 137,541
I*1' Ы 1Ы 4а D 14,444 Ilt.t.'J
ЩР] l.tK 3 h M,«F 153.Г53
Fiptrrrtrt Kmi SWIWiNint Tjfcv Murv Reraa) C4tT- tjP QUO 31Л1Л2 31 DJ IM Mt<?4.3M?1 II3JPM NlMltMH • 4SOBal7 П1 4..Г1 -lau ПИкМГЬОв
TOpjkjlJLn Krrtiia ГНС-A <ЬГ*<а1| Ma«i 5ЕСД Ча.и
l|lHllEa4«N ■ r 0PÏ ILlj LÚJ b.Vñ ■n iSMÜ JDf ll.i 31 Î1.I <Е-.ЭГЕ ÏH.M1 1ПГ.1Я! 1Я.151
Д
21Л1Л2-2» 241
FwIP-C:»***
Сфагггм*H*n» М гпмг’и« <м
SpwwiiriNipii 3141Л2 Tut« Магм ЛВ_24» feMOCufr Un 34. ЗС1? 1? J7 I » FM ЭДР: мптгим
OUO 4ааЭсОМ-4аЮ4иЬв*1«-Яйс2ЪгЯе144
FlpjI
:
MIÉ-iíU llMLÜtl
3S.BCI 15.1«
11S.ÍI3 ЗВ.НЬ 21.41t
2ia,iMî
lili?]
1*1,142
Рис. 1 - Соотношение живых и мертвых клеток в 15-минутных (б, г) и 24-часовых (в, д) суспензиях клеток микрококка при действии 100 мМ (б, в) и 200 мМ (г, д) ионов кальция. За контроль принята культура без добавления ионов кальция (а)
Определение изменения микровязкости мембраны при действии ионов кальция
Оценку текучести мембран проводили с помощью флуоресцентного зондирования на спек-трофлуориметре LS55 (Perkin Elmer). Определение текучести глубоких слоев липидного бислоя проводили после добавления к объему суспензии клеток микрококка 0.1 объема спиртового раствора пирена в концентрации 100 цМ/л [3]. Измеряли спектры флуоресценции его эксимеров при длине волны флуоресценции 470 нм, мономеров при длине волны флуоресценции 371,5 нм, возбуждении 340 нм (Molecular Probes). Определяли коэффициент экси-меризации пирена F величина которого обратно пропорциональна микровязкости мембраны [2; 4].
Расчет производили по формуле:
^(147°пир-147°б/пир)/(1370 пир-1370 б/пир) ,
где 1470пир - интенсивность флуоресценции клеточной суспензии в присутствии пирена; 1470б/пир - интенсивность флуоресценции клеточной суспензии в отсутствии пирена; аналогичный смысл у подстрочных обозначений для I370.
Флуоресценция клеточной суспензии в отсутствии пирена (1470б/пир) является фоновой флуоресценцией клеток при облучении светом с длиной волны 340нм, которая вычитается из значения флуоресценции клеточной суспензии в присутствии пирена (1470пир).
Показано, что интенсивность флуоресценции эксимера пирена клеточной суспензии после добавления СаС12, рассчитанная как (1470шр-1470б/пир) = 75 усл.ед. Интенсивность флуоресценции мономера, рассчитанная по формуле (I370 пир-1370
г
б/пир) = 200 усл.ед. Коэффициент эксимеризации F=75/200=0,375.
Интенсивность флуоресценции эксимера клеточной суспензии без добавления СаС12, рассчитанная аналогичным образом равна 91усл.ед. Интенсивность флуоресценции мономера этой же клеточной суспензии равна 188 усл.ед. Коэффициент эксимеризации F=91/188=0,480.
Известно, что интенсивность эксимериза-ции обратно пропорциональна микровязкости мембраны [4]. Другими словами, уменьшение коэффициента эксимеризации пирена в присутствии СаС12 свидетельствует об упорядоченности структуры клеточной мембраны, что связано с увеличением в ней доли гель-структурированных доменов [2], по сравнению с жидкокристаллическими доменами и, как следствие, увеличением микровязкости мембраны.
Таким образом, нами было показано следующее: в диапазоне концентраций 100-200 мМ Са2+ отмечается достоверное изменение соотношения живых клеток и колониеобразующих единиц Micrococcus lysodeikticus в сторону уменьшения последних. При концентрации Са2+ 200 мМ происходит снижение эксимеризации пирена на 22% по сравнению с контролем, что свидетельствует об увеличении микровязкости мембраны. Однонаправленное снижение текучести мембраны и способности к колониеобразованию является индикатором перехода клетки в состояние гипометаболизма.
Ранее аналогичные результаты были получены при действии 2,4,6-тринитротолуола в качестве стрессора на клетки грамотрицательных бактерий и описаны в работах Куриненко с соавторами [5; 6]. Кроме того, изменения в метаболическом статусе и в состоянии мембраны клеток при действии различных видов стрессоров были показаны в работах других авторов [7-9].
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 12-04-01226-а.
Регистан. Под общей редакцией И.М. Грачевой // М.: Элевар, 2003.- 554с.
2. Владимиров, Ю.А. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран [Текст] / Ю.А. Владимиров, Т.Е. Добрецов // М.: Наука, 1980.- 320с.
3. Максим, О.В. Динамика некоторых биофизических свойств мембран эритроцитов у военнослужащих срочной службы в процессе адаптации к военной службе [Текст] / О.В. Максим, В.П. Терещенко, О.И. Зайцева // Биологические науки. Современные наукоемкие технологии №1.- 2006.- С.14-17.
4. Добрецов, Т.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов [Текст] / Т.Е. Добрецов // М.: Наука, 1989.- 277с.
5. Куриненко, Б.М. Структурные изменения в мембранах клеток Escherichia coli, индуцированные 2,4,6-тринитротолуолом [Текст] / Б.М. Куриненко, В.Г. Евтю-гин, А.И. Голубев, Е.В. Никитина, Г.Ю. Яковлева // Вестник Казанского технологического университета.-Т.15, № 18.- С. 200-202.
6. Куриненко, Б.М. Особенности химического сдвига
ядер 31Р фосфолипидов плазматической мембраны клеток Escherichia coli, индуцированного 2,4,6-
тринитротолуолом [Текст] / Б.М. Куриненко, Т. Зинкевич, А.Г. Крушельницкий, В.Я. Пономарев, Г.Ю. Яковлева // Вестник Казанского технологического университета.- Т.15, № 23.- С. 113-114.
7. Маргулис, А.Б. Влияние хлорпроизводных 2(5Н)-фуранона на жизнеспособность бактериальных клеток / А.Б. Маргулис, А.Р. Курбангалиева, Н.В. Белоногова, Л.З. Латыпова, В.Я. Пономарев, Э.Н. Хакимуллина, Е.Ю. Тризна, М. И. Богачев, А. Р. Каюмов // Вестник Казанского технологического университета.- 2012.- Т. 15, №15.- С. 220-224.
8. Евтюгин, В.Г. Электронно-микроскопическое исследование морфологических изменений клеток кишечной палочки в условиях голодового стресса / В.Г. Евтюгин, А.Б. Маргулис, О.Н. Ильинская, М.К. Кадиров // Вестник Казанского технологического университета.- 2011.-№12.- С.167-171.
9. Маргулис, А.Б. Изменение функциональной активности бактериальной клетки сопряжено с изменением ее элементного состава / А. Б. Маргулис, А. В. Волошин, А.Х. Гильмутдинов, А.И. Колпаков, О.Н. Ильинская // ДАН.- 2009.- Т.427, №4.- С.553-556.
Литература
1. Бутова, С.Н. Теоретические основы биотехнологии. Биохимические основы синтеза биологически активных веществ [Текст] / С.Н. Бутова, И.А. Типисева, Г.И. Эль-
А. Б. Маргулис - к.б.н., доц. каф. микробиологии К(П)ФУ, anna.margulis@kpfu.ru; М. А. Данилова - студ. К(П)ФУ;
П. В. Зеленихин - к.б.н., доц. каф. микробиологии К(П)ФУ; В. Я. Пономарев - к.т.н., доц. каф. технологии пищевых
КНИТУ,v.y.ponomarev@gmail.com; Б. М. Куриненко - д.б.н., проф. каф. микробиологии К(П)ФУ, boris.kurinenko@kpfu.ru.
