CC BY
15
ПРОМЫШЛЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И ЭКОЛОГИЯ
УДК 579.23; 579.22
Л. Р. Усманова, В. Е. Митько, В. Я. Пономарев, Б. М. Куриненко, А. Б. Маргулис
ВЛИЯНИЕ ГАЛОГЕНИРОВАННЫХ ФУРАНОНОВ НА МЕМБРАНУ
MICROCOCCUS LYSODEIKTICUS
Ключевые слова: фураноны, структура мембраны, Micrococcus lysodeikticus.
Показано, что исследуемые фураноны в низких концентрациях (0.1 мкг/мл) стимулируют переход клеточной мембраны микрококка в жидкокристаллическое состояние.
Keywords: furanones, structure of membrane, Micrococcus lysodeikticus.
The studied furanones at low concentrations (0.1 mcg / ml) stimulated the transition of Micrococcus cell membrane to a liquid crystal state.
Введение
Чувство кворума (Quorum sensing, QS) позволяет бактериям следить за плотностью популяции, что важно учитывать в биотехнологических исследованиях и промышленных процессах. QS опирается на взаимодействие аутоиндуктора с активатором транскрипции белка. Эти сигнальные молекулы диффундируют из бактериальных клеток и накапливаются в окружающей среде. Как только пороговое значение концентрации достигает своего максимума, эти сигналы служат индукторами для регуляции целевых генов. У грамотрицательных бактерий ау-тоиндукторы относятся к семейству ацилированных гомосеринлактонов. Ацилированные гомосеринлак-тоны в межклеточной коммуникации играют роль в регулировании различных функций, таких как биосинтез антибиотика, продукция факторов вирулентности, биосинтез экзополисахаридов и другие [1].
Было показано, что фураноны ингибируют экспрессию бактериальных экзоферментов, которые активно разрушают компоненты иммунной системы, таким образом, усиливая иммунную реакцию [2]. Например, Serratia marcescens - это оппортунистический патоген, вызывающий тяжелые инфекции мочевыводящих путей. Инфекции, вызываемые Serratia marcescens, представляют большой интерес из-за устойчивости к анбитиотикам. Межклеточные коммуникации (QS системы) Serratia marcescens выступают в качестве глобального регулятора почти всех факторов вирулентности, в основном, например, образование биопленок. Так, QS системы Serratia marcescens обеспечивают улучшение стратегии в борьбе с лекарственной устойчивостью [3]. По секреции и выявлению ряда сигнальных молекул, бактерии способны координировать экспрессию генов. Широко использованный сигнальный механизм - система-кворума. Галогенированные фураноны, известные как ингибиторы кворума, эффективно подавляют кворум-системы многих бактерий [4]. Фураноны также способны влиять на активность белков, их конформацию, ферментативную активность клетки и т.д. [5-8].
Целью настоящей работы явилась оценка влияния новых галогенированных производных фурано-нов на изменение мембраны Micrococcus lysodeikticus.
1. Материалы и методы исследования
1.1 Определение изменения микровязкости мембраны при действии фуранонов
1) 18-часовые культуры микроорганизмов выращивали на питательном LB-бульоне, при температуре 37°С.
2) Сливали пробирки с ночной культурой микрококка в одну и определяли плотность клеток на ФЭ-Ке.
3) Разливали по 1 мл культуры в 8 эппендорфов. Центрифугировали 20 минут при 6 тыс. оборотов для осаждения клеток.
4) Сливали стерильно надосадочную жидкость и разливали в эппендорфы по 1 мл чистого питательного бульона. Хорошо взбалтывали и сливали содержимое всех эппендорфов в одну пробирку.
5) Добавили определенный фуранон в определенной концентрации (0.1, 0.01, 0.001 мкг\мл соответственно) в соотношении 1:9.
6) Далее выращивали в термостате 15 минут и 24 часа.
7) Затем измеряли проницаемость мембраны Micrococcus lysodeikticus с помощью флуоресцентного зондирования на спектрофлуориметре LS55 (Perkin Elmer) после добавления к НК с фураноном 0.1 объема спиртового раствора пирена в концентрации 100 цМ/л.
8) Проводили анализ жизнеспособности по учету ОЧК, КОЕ и измеряли плотность культуры на ФЭ-Ке.
9) Исследование состояния мембраны проводили по известной методике Ю.А. Владимирова и Г.Е. Добрецова [9].
Определение текучести мембран производили при помощи флуоресцентного зондирования на спектрофлуориметре LS55 (Perkin Elmer). Текучесть глубоких слоев липидного бислоя определяли, добавляя к объему суспензии бактерий 0.1 объема
спиртового раствора пирена в концентрации 100 цМ/л. Регистрировали спектры флуоресценции эк-симеров пирена при длине волны флуоресценции 470 нм и мономеров при длине волны флуоресценции 371.5 нм, возбуждении 340 нм (Molecular Probes). Вычисляли коэффициент эксимеризации пирена F, значение которого обратно пропорционально микровязкости мембраны [9]. Для расчетов использовали формулу:
F=(I470пир-I470б/пир)/(I370 Шр-1370 б/пир),
где 1470шр - интенсивность флуоресценции клеточной суспезии в присутствии пирена; 1470б/пир - интенсивность флуоресценции клеточной суспезии в отсутствии пирена. Аналогичный смысл у подстрочных обозначений для I370.
Флуоресценция клеточной суспензии в отсутствии пирена (1470б/пир) представляет из себя фоновую флуоресценцию клеток при облучении светом с длиной волны 340нм, которая вычитается из величины флуоресценции суспензии клеток в присутствии пирена (1470пир).
1.2 Соединения, которые применяли в работе
На рисунке 1 представлены модифицированные бромом и хлором производные фуранонов, которые применяли в работе. Соединения синтезированы на кафедре органической химии КФУ под руководством к.х.н. доцента Курбангалиевой А.Р.
Вг Вг
Вг
Вг
H ОСН2СНгВг
H ОСН2СН2С1 10
Рис. 1 - Формулы бромсодержащих производных фуранонов
1.3 Статистическая обработка результатов
Математическую обработку полученных результатов проводили стандартными методами в компьютерной программе "Microsoft-Excel".
Результаты считали достоверными при среднеквадратичном отклонении ст< 10%. В качестве критерия достоверности полученных разностей использовали критерий Стьюдента, принимая Р< 0.05 за достоверный уровень значимости.
2. Определение изменения микровязкости мембраны при действии фуранонов
Показано, что интенсивность флуоресценции эк-симера пирена клеточной суспензии после добавления фуранона №10 в концентрации 0,1 мкг\мл, рассчитанная как = (1470ПИр-1470б\ПИр)- 1470ф/ПИр =37,59 усл.ед. Интенсивность флуоресценции мономера,
рассчитанная по формуле (1370Шр-1370б\шр)-1370ф/Шр =32,53 усл.ед. Коэффициент эксимеризации F=37,59/32,53=1,155.
Интенсивность флуоресценции эксимера пирена клеточной суспензии после добавления фуранона №9 (токсичный) в концентрации 0,1 мкг\мл, рассчитанная как = (1470пир-1470б\пир)-1470ф/пир=30,99 усл.ед. Интенсивность флуоресценции мономера, рассчитанная по формуле (1370Шр-1370б\пир)-1370ф/ПИр=44,21 усл.ед. Коэффициент эксимеризации F= 30,99/44,21=0,701.
Интенсивность флуоресценции эксимера клеточной суспензии без добавления фуранона, рассчитанная аналогичным образом равна 20,55 усл.ед. Интенсивность флуоресценции мономера этой же клеточной суспензии равна 47,98 усл.ед. Коэффициент эксимеризации F=20,55/47,98=0,43.
Известно, что интенсивность эксимеризации обратно пропорциональна микровязкости мембраны [9]. Иными словами, увеличение коэффициента эк-симеризации пирена в присутствии фуранона свиде-телствует о том, что они способны воздействовать на мембрану Micrococcus lysodeikticus.
С пиреном не взаимодействует соотношение I470/370 (возбуждение 340)=0,135 для фуранона №9 и 0,1302 для фуранона №10 (результат измерений фуранонов с пиреном без клеток).
Интересно то, что фураноны, особенно Ф10, увеличивают коэффициент эксимеризации. У клеток коэффициент эксимеризации без фуранонов = 0,43; с фураноном Ф9 коэффициент эксимеризации = 0,7, а для Ф10 коэффициент эксимеризации = 1,155. Это свидетельствует о стимуляции фуранонами перехода мембраны в жидкокристаллическое состояние (о том, что в присутствии фуранонов больше доменов мембраны в жидкокристаллическом состоянии, чем в гель-состоянии).
Ранее нами были проведены исследования токсичности и генотоксичности соединений фураноно-вого ряда [10]. Данные соединения потенциально обладают лекарственным потенциалом и представляют собой интерес для дальнейшего исследования.
Литература
1. Bedmar, E. J. Detection, purification and characterisation of quorum-sensing signal molecules in plant-associated bacteria [Text] / E.J. Bedmar, G. Brelles-Marino // Biotechnol -2001.- V.91.- P. 197-209.
2. Decho, A. W. Quorum sensing in natural environments: emerging views from microbial mats [Text] / A.W. Decho // Trends in Microbiology - 2010.-V. 18.-P. 73-80.
3. Bakkiyaraj, D. Inhibition of quorum sensing regulated biofilm formation in Serratia marcescens causing nosocomial infections [Text] / D. Bakkiyaraj, C. Sivasankar, S.K. Pandian // Bioorg Med Chem Lett - 2012.-V.22.- P.3089-3094.
4. Tao, Y. The function of SpnR and the inhibitory effects by halogenated furanone on quorum sensing in Serratia marcescens AS-1 [Text] / Y. Tao, T. Morohoshi, N. Kato, T. Ikeda, H. Zhuang // Wei Sheng Wu - 2008.-V.48.- P. 391397.
5. Гимадеева, Р.М. Цитотоксичность и генотоксичность новых производных фуранона / Р.М.Гимадеева, Э.В.Бабынин, А.Б.Маргулис // "Вестник Уральской медицинской академической науки" (Тематический вы-
пуск по микробиологии, иммунологии и биотехнологии).- 2011.- С. 26.
6. Митько, В.Е. Производные фуранонов как ингибиторы плотностно-зависимых процессов у бактерий [Текст] / В.Е.Митько, А.В.Гарусов, О.Н.Ильинская, А.Б.Маргулис // Вестник Уральской медицинской академической науки (Тематический выпуск по микробиологии, иммунологии и биотехнологии).- 2011.- С. 41.
7. Маргулис, А.Б. Влияние хлорпроизводных 2(5Н)-фуранона на жизнеспособность бактериальных клеток / А.Б.Маргулис, А.Р.Курбангалиева, Н.В.Белоногова, Л.З.Латыпова, В.Я.Пономарев, Э.Н.Хакимуллина, Е.Ю.Тризна, М.И.Богачев, А.Р.Каюмов // Вестник Казанского технологического университета.- 2012.- Т. 15.-С. 220-224.
8. Белоногова, Н.В. Галогенированные фураноны как модификаторы физиологической активности Staphylococcus aureus [Текст] / Н.В. Белоногова, Т.С. Бардина, В.Я. Пономарев, А.И. Колпаков, А.Б. Маргулис, О.Н. Ильинская // Вестник Казанского технологического университета.- 2013.- Т.16.- С. 100-102.
9. Владимиров, Ю.А. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран [Текст] / Ю.А. Владимиров, Т.Е. Добрецов // М.- 1980. - 320 с.
10. Митько, В.Е. Токсические и генотоксические эффекты новых синтезированных фуранонов и их галогенирован-ных производных [Текст] / В.Е. Митько, А.Б. Маргулис, В.Я. Пономарев, А.И. Колпаков, О.Н. Ильинская // Вестник Казанского технологического университета.-2013.- Т.16, №11.- С.211-213.
© Л. Р. Усманова, студент каф. микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии «Казанский (Приволжский) федеральный университет», lei412@mail.ru; В. Е. Митько, аспирант каф. микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии «Казанский (Приволжский) федеральный университет», unoh@mail.ru; В. Я. Пономарев, к.т.н., доцент каф. технологии мясных и молочных продуктов КНИТУ, v.y.ponomarev@gmail.com; Б. М. Куриненко, д.б.н., профессор каф. микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии «Казанский (Приволжский) федеральный университет», boris.kurinenko@kpfu.ru; А. Б. Маргулис, к.б.н., доцент каф. микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии «Казанский (Приволжский) федеральный университет», anna.margulis@kpfu.ru.
© L. R. Usmanova, a student of Department of Microbiology, Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan (Volga Region) Federal University, lei412@mail.ru; V. E. Mit'ko, a graduate student of Department of Microbiology, Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan (Volga Region) Federal University, unoh@mail.ru; V. Ya. Ponomarev, Ph.D., assistant professor. technology of meat and dairy products of the Institute of Food Production and Biotechnology KNRTU, vyponomarev@gmail.com; B. M. Kurinenko, Professor of Department of Microbiology, Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan (Volga Region) Federal University, boris.kurinenko@kpfu.ru; A. B. Margulis, PhD, assistant professor. Microbiology, Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan (Volga Region) Federal University, anna.margulis@kpfu.ru.
