CC BY
286
БИОХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 579.22; 579.083.13
В. Г.Евтюгин, А. Б.Маргулис, О. Н. Ильинская,
М. К. Кадиров
ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ КЛЕТОК КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ В УСЛОВИЯХ ГОЛОДОВОГО СТРЕССА
Ключевые слова: электронная микроскопия, морфология клеток, гипометаболические формы, стресс, разделение
в криогелях.
Методы электронной микроскопии применяются в различных исследованиях, в частности в микробиологии и биотехнологии. Особый интерес представляют электронно-микроскопические исследования микроорганизмов. Исследована популяция кишечной палочки, перешедшая в гипометаболическое состояние и разделенная на субпопуляции в полимерных криогелях. Популяция состоит из вегетативных, гипометаболических и мертвых клеток. Методами электронной микроскопии зафиксированы значительные морфологические изменения, уменьшение размеров клеток, переход палочковидных форм в кокковидные. Гипометаболические клетки характеризуются утолщением клеточной стенки, конденсацией цитоплазмы и формированием капсулоподобной стуктуры.
Key words: еlectron microscopy, morphology of cells, hypometabolic cells, stress, separation in criogels.
The methods of electron microscopy used in various studies, particularly in microbiology and biotechnology. Of particular interest are the electron-microscope studies of microorganisms. Investigated population of E. coli, passed in hypometabolic and divided into subpopulations in the cryogels. Population consists of vegetative hypometabolic and dead cells. Electron microscopy detected significant morphological changes, reduction in cell size , the transition to rod-like forms (as coccus). Hypometabolic cells are characterized by thickening of the cell wall, condensation of cytoplasm and formation of capsu-likel forms.
Введение
Электронная микроскопия является одним из высокотехнологичных методов изучения материалов и структур на наноуровне, метод известен в материаловедении, фундаментальной физике, а также в биологии и биомедицине. Применение методов просвечивающей электронной микроскопии в биотехнологии открывает новые возможности для изучения таких биомедицински-значимых бактерий как кишечная палочка. Разрешающая способность метода подходит для изучения морфологии клеток бактерий, поверхностных структур и образований, в частности для исследования перехода бактерий в гипометаболическое состояние.
Способность микроорганизмов приспосабливаться к меняющимся условиям существования очень высока. При различного рода воздействиях на организмы наблюдаются сходные эффекты развития комплекса неспецифических физиологических и биохимических изменений в клетке, что, вероятно, послужило предпосылкой к появлению термина «стресс у бактерий». Изменения условий окружения микроорганизмов вынуждают популяцию мобилизовать все свои возможности для формирования адаптивного ответа клетки [1]. Следует отметить, что стратегия переживания микроорганизмами неблагоприятных воздействий не ограничивается образованием специализированных метаболически покоящихся форм (экзоспоры, цисты, акинеты, экзоспоры). В последние годы большое внимание уделяется изучению способов переживания неблагоприятных условий неспорообразующими бактериями за счет перехода их в состояние «вегетативного» покоя и
образования цистоподобных форм [2]. Однако остается еще недостаточно изученным вопрос о морфо-физиологических особенностях этих форм неспорообразующих микроорганизмов.
Ранее нами была решена задача разделения гипометаболических и метаболически активных клеток кишечной палочки [3] с помощью криогелей [4, 5], предоставленных профессором Лозинским В.И. (Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН), что позволило провести детальное сравнение морфологических и физиолого-биохимических характеристик клеток полученных фракций.
Экспериментальная часть
Работа проводилась на просвечивающем электронном микроскопе биомедицинского назначения JEOL JEM-100B с разрешающей способностью 0.5нм, ускоряющим напряжением от 20 до 100 кВ, увеличением от х100 до х1 000 000.
В работе использовали штаммы Escherichia coli K12 из музея кафедры микробиологии Казанского федерального университета. Электронно-микроскопические исследования производились на базе Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, г. Пущино-на-Оке и на базе кафедры физики факультета нанотехнологий Казанского государственного технологического университета, криогели были предоставлены В.И Лозинским (ИНЭОС РАН).
Применяли агарозные и ПВС криогели (рис. 1) с длиной алифатической цепи в 4, 7, 12 углеродных атомов, гели, несущие остаток трис оксиметил аминометана (положительно заряженные группировки) и тиогликолевой кислоты (отрицательно заряженные группировки). Столбики гелей находились в медицинских шприцах на 5 мл, и доходили до середины шприца. В период между постановками экспериментов гели содержались в растворе азида натрия. Перед экспериментом гели тщательно промывались не менее чем 25 мл (5 объемов геля) 0,9% раствора NaCl.
Рис. 1 - Микрофотография (оптический микроскоп) тонкого среза широкопористого криогеля
Для моделирования условий стресса и естественного перехода в гипометаболическое состояние штаммы микроорганизмов культивировали в среде ЬБ (на 1000 мл дистиллированной воды: ЫаО! - 5 г, дрожжевой экстракт - 5 г, пептон - 10 г), разведенной 1:10. Газообмен с внешней средой блокировали стерильной полиэтиленовой пленкой. Культивирование проводили в течение 270 суток при температуре 370С в термостате.
Через 120 и 270 суток культивирования проводили стерильный забор клеток из колб с разделением их на фракции в криогелях [3] и последующей подготовкой к электронной микроскопии по стандартной схеме обезвоживания и фиксации.
Результаты и их обсуждение
Известно, что клетки, находящиеся под действием стрессовых факторов или при переходе к гипометаболическому состоянию могут изменять свою морфологию [6-9]. В криогелях было проведено разделение гипометаболической популяции кишечной палочки на активную, гипометаболическую и мертвую субпопуляции (табл. 1). Для изучения перехода исследуемых нами бактериальных культур в состояние гипометаболизма в результате стресса была проведена просвечивающая электронная микроскопия клеток гипометаболической субпопуляции.
Таблица 1 - Содержание клеток (в %) в 180-дневной суспензии грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, отвечающих на внесение экзогенного субстрата, %
Штамм Количество клеток, %*
Активные (вегетативные) клетки Гипометаболи-ческие клетки Мертвые клетки
Escherichia coli K12 4+1 69+2 27+1
"-1 За 100% принято среднее число клеток при анализе 10-12 полей зрения в световом микроскопе при увеличении 1600 (объектив с иммерсией).
Микрофотографии ультратонких срезов клеток стареющей популяции (120 суток) клеток E. coli K12 приведены на рисунке 2.
Рис. 2 - Сравнительный размер и морфология вегетативной (б) и гипометаболической (г) клеток E. coli K12 (популяция в процессе старения, 150-180 суток)
Данные показывают, что популяция гетерогенна и состоит из вегетативных клеток нормальных размеров и мелких гипометаболических клеток. В полях снимков присутствуют гипометаболическая клетка и вегетативная клетка, в частности на нижнем рисунке вегетативная клетка находится в процессе деления (рис. 2). Клетка, перешедшая в
гипометаболическое состояние, значительно уменьшилась в размере, при этом сохранив целостность оболочки и жизнеспособность. О последнем свидетельствует аналогичная вегетативной клетке электронная плотность содержимого. При этом значительных изменений в морфологии клеточной поверхности не наблюдали, так же, как и утолщения клеточной стенки.
Обнаруживаются значительные изменения в клетках кишечной палочки: в морфологии, ультраструктурах, и, как и предполагалось, структуре клеточной поверхности и защитных слоев. В литературе и ранее встречались свидетельства изменения форм клеток кишечной палочки в сторону шарообразных [7-9]. Это происходило как в результате серьезных стрессовых условий, таких как токсиканты, тепловой и осмотический шоки, так и в результате голодового стресса вследствие длительного инкубирования.
На электронных фотографиях ультратонких срезов мы видим ряд значительных изменений, которые принято считать характеризующими гипометаболическое состояние. Это значительное уменьшение размера клеток относительно вегетативных, шарообразная форма, изменение поверхностных структур. Последнее представляет, с нашей точки зрения, наибольший интерес, ввиду того, что именно характеристика поверхности клеток определяет выживание в агрессивной среде. При более детальном рассмотрении клеточной стенки E. coli мы видим значительное ее утолщение, 28-30 нм, в некоторых областях наблюдается отслоение мембраны от клеточной стенки, значительно увеличилось периплазматическое пространство. Вокруг клетки наблюдается зона высокой проходимости электронного пучка, что может свидетельствовать о наличии в этой области специального образования, не пропускающего в себя электронно-плотные молекулы, контрастированные уранилацетатом и свинцом. Это может свидетельствовать о капсулоподобных образованиях, окружающих клетки в состоянии гипометаболизма. Наличие таких структур для кишечной палочки детектировано впервые, анализ 35-40 клеток в более чем 20 полях зрения говорит о статистически достоверном присутствии этого образования у клеток E. coli (Рис. 2). Отсутствие подобных образований у мертвых клеток, присутствовавших в этих ультратонких срезах, говорит о связи образований с жизнедеятельностью микроорганизма в гипометаболическом состоянии.
Авторы выражают благодарность д.х.н., проф. В.И. Лозинскому (ИНЭОС РАН, Москва) за предоставленные криогели.
Работа выполнена по Государственному контракту между Федеральным агентством по науке и инновациям и государственным образовательным учреждением Казанским государственным технологическим университетом на 2011 г. № 16.552.11.7012.
Литература
1. Головлев, Е.Л. Введение в биологию стационарной фазы бактерий: механизм общего ответа на стрессы / Е.Л. Головлев // Микробиология. 1999. Т.68, №5. С.623-631.
2. Мулюкин, А.Л. Образование покоящихся форм в автолизирующихся суспензиях микроорганизмов [Текст] / А.Л. Мулюкин, К.А. Луста, М.Н. Грязнова, Е.С. Бабусенко, А.Н. Козлова, М.В. Дужа, Л.А. Митюшина, В И. Дуда, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология.- 1997.- Т. 66, № 1.- С. 42-49.
3. Евтюгин, В.Г., Гидрофобизованные производные широкопористого криогеля поливинилового спирта: новые возможности применения в биотехнологии / В.Г. Евтюгин, А.Б.Маргулис, О.В.Бушманова, Е.В.Никитина, А.И.Колпаков, Л.Г.Дамшкалн, В.И.Лозинский, О.Н.Ильинская // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2010. - № 9. - С.89-97.
4. Лозинский, В.И. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения / В.И. Лозинский // Успехи химии. 2002. Т. 71. N6. С. 559-585.
5. Лозинский, В.И. Новое семейство макропористых и сверхмакропористых материалов биотехнологического назначения - полимерные криогели / В.И. Лозинский // Известия РАН. 2008. Сер. хим. N5. С. 996-1013.
6. Никитина, Е.В. Особенности распределения и физиологического состояния микроорганизмов нефтешлама - отхода нефтехимического производства / Е.В. Никитина, О.И. Якушева, С.А. Зарипов, Р.А. Галиев, А.В. Гарусов, Р.П. Наумова // Микробиология. 2003. Т. 72. N5. С. 699-706.
7. Мулюкин, А.Л. Синтез аутоиндукторов анабиоза у неспорообразующих бактерий как механизм регуляции их активности в почве и подпочвенных осадочных породах [Текст] / А. Л. Мулюкин, Е.В. Демкина, А.Н. Козлова, В.С. Соина, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология. 2001. Т. 70, № 5.- С. 620628.
8. Куриненко, Б.М. Особенности токсического действия 2,4,6-тринитротолуола в отношении Escherichia coli K12 [Текст] / Б.М.Куриненко, Н.А.Дениварова, Р.Э.Давыдов, Г.Ю.Яковлева // Прикл. биохимия и микробиология. 2007. T. 43. № 1. С. 59-64.
9. Черепнев, Г.В. Оценка токсического действия 2,4,6-тринитротолуола на клетки Escherichia coli K12 методом проточной цитофлуориметрии [Текст] / Г.В.Черепнев, Т.А.Велижинская, Г.Ю.Яковлева, Н.А.Дениварова, Б.М.Куриненко // Микробиология. 2007. Т. 76. № 3. С. 377-382.
© В. Г. Евтюгин - асс. каф. физики КГТУ, vevtugyn@gmail.com; А. Б. Маргулис - канд. биол. наук, доцент каф микробиологии КФУ; О. Н. Ильинская - д-р биол. наук, проф., зав. каф. микробиологии КФУ; М. К. Кадиров - канд. физ.-мат. наук, доц. каф. физики КГТУ.
