CC BY
19
УДК 579.083.13
И. С. Захаров, А. П. Бравкова, В. Я. Пономарев, И. С. Низамов, Б. М. Куриненко, А. Б. Маргулис
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ПРОИЗВОДНЫХ ДИТИОКИСЛОТ ФОСФОРА
Ключевые слова: токсичность, микроорганизмы, сканирующая электронная микроскопия, дитиокислоты фосфора.
Исследованы токсические свойства соединений. Показано, что исследуемые соединения обладают высокой степенью антимикробной активности. Они оказывают повреждающее действие на клетки различных микроорганизмов: в большей степени на Micrococcus lysodeikticus sp., Escherichia coli XL-1, в меньшей степени на Saccharomyces cerevisiae. Все эти соединения представляют собой интерес для дальнейшего исследования их потенциальных лекарственных свойств.
Keywords: toxicity, microorganisms, scanning electron microscopy, phosphorus dithio acid.
Investigated the toxic properties of the compounds. It is shown that the test compounds have a high degree of antimicrobial activity. Investigated the toxic properties of the compounds. It is shown that the test compounds have a high degree of antimicrobial activity. They have a damaging effect on cells of various microorganisms. Largely on Micrococcus lysodeikticus sp, Escherichia coli XL-1, to a lesser extent on Saccharomyces cerevisiae. All of these compounds are of interest for further study of their potential medicinal properties.
Введение
Фосфорорганические соединения (ФОС) принадлежат к наиболее важным на сегодняшний день классам пестицидов - нематоцидов, инсектицидов, гербицидов, дефолиантов, фунгицидов, акарицидов [1]. В настоящее время более 220 фосфорорганиче-ских соединений используется в сельском хозяйстве. Наиболее эффективно применение органических соединений фосфора при борьбе с вредителями растений, а также паразитами домашних животных. Мировое производство данных препаратов составляет около 200 тыс. тонн в год, что позволяет им занимать первое место по масштабам применения в сельском хозяйстве [2].
Фосфорорганические соединения, применяемые в качестве пестицидов, обладают рядом особенностей:
1. в процессе разложения ФОС в живых организмах образуются практически нетоксичные вещества;
2. обладают довольно широким спектром действия на вредителей растений (инсектициды и ака-рициды);
3. невысокая хроническая токсичность;
4. отсутствует способность накапливаться в живых организмах;
5. умеренная токсичность для рыб.
Следует отметить, что большинство фосфорсодержащих ядохимикатов в растениях, почве и других объектах внешней среды разлагаются в течение нескольких недель [3].
Необходимо подчеркнуть то, что отрицательным свойством ФОС как пестицидов является относительно высокая острая токсичность по отношению к позвоночным животным [4].
Дитиофосфорные кислоты, в отличие от эфиров монотиофосфорных кислот менее токсичны и химически более стойки, что приведет к возрастанию продолжительности действия дитиофосфатов в полевых условиях. Смешанные эфиры дитиофосфор-ных кислот имеют наименьшую токсичность для позвоночных и активны по отношению к насекомым. Это объясняется различными путями метаболизма препаратов у этих организмов [5].
В связи с изложенным, целью настоящей работы явилось определение токсических свойств некоторых новых синтезированных производных дитио-кислот фосфора.
Материалы и методы исследования
На токсичность были исследованы S-алкиловые эфиры дитиофосфоновых кислот и аммониевая соль дитиокислот фосфора на основе протеиногенных ^)-альфа-аминокислот в концентрациях 1.25 мкг/мл, 6.25 мкг/мл, 12.5 мкг/мл. Формулы соединений представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Формулы исследуемых веществ
Шифр соединения Структурная формула
6.07.131 Me S 1 . ^ /"Л II /S-C(CEt)2 i-Am-(^ J-Р( 2
16.01.142 (¿XlS- + CcOH yp-^o^p-s h3n-ch-ch3 L-
28.02.143 cccH c s s- + 1 Y H3N-CH-CH2-CH2-C-N
Оценка токсических и мутагенных эффектов исследуемых соединений
Чтобы выявить потенциально токсические свойства наших исследуемых соединений в разных концентрациях, мы применяли тестерный штамм Salmonella typhimurium TA 100.
Ход эксперимента:
• За 12-15 часов до проведения эксперимента переносят культуру исследуемого штамма со скошенного агара в 5 мл среды.
• 2% L-агар разливают по чашкам Петри.
• Ночную культуру разводят в стерильной водопроводной воде. Посев с 6-го и 7-го разведений.
• Растопленный 0.6% L-агар стерильно разливают по 3 мл в пробирки, оставляют на водяной бане при 450С.
• В пробирки с 3 мл 0.6 % L-агара вносят 0.1 мл суспензии бактерий в рабочем разведении и 0.1 мл вещества в исследуемой концентрации. Раствор перемешивают и наслаивают на нижний 2% питательный агар в чашки Петри. В негативный контроль (без соединений) вместо вещества добавляют 0.1 мл растворителя. После 24 ч. инкубации при 370С подсчитывают колонии в опытных и контрольных образцах и определяют «процент выживания» микроорганизмов или токсичность исследуемых соединений.
Статистический анализ проводят с применением стандартных математических методов в программе "Microsoft-Excel".
Токсический эффект определяют по выживанию штамма бактерий в опытных образцах по сравнению с контрольным (рисунок 1) [6,7].
2-3): после 120 минут инкубации с исследуемым соединением, контроль (без добавления исследуемого соединения).
Рис. 1 — Токсические эффекты исследуемых соединений
Из рисунка видно, что наиболее сильные токсические эффекты проявили соединения 06.07.13-1 и 16.01.14-2 на всем диапазоне концентраций, токсичность соединения 28.02.14-3 по отношению к штамму Salmonella typhimurium TA 100 была незначительной в концентрациях 6.25 и 12.5 мг/мл.
Оценка токсических эффектов соединений при помощи сканирующей электронной микроскопии
Всего исследовалось 3 вида микроорганизмов (Escherichia. coli XL-1, Saccharomyces cerevisiae, Micrococcus lysodeikticus) в двух вариантах (рисунки
Рис. 2 — Е.соН без добавления исследуемого соединения (контроль). Поверхность клеток гладкая, без каких-либо видимых структурных повреждений
Рис. 3 — Е.соЫ после инкубации с исследуемым соединением
Клетки претерпели значительные структурные изменения, что хорошо видно на рисунке. Они утратили свою первоначальную форму и растеклись. При этом мембрана стала бугристая. На рисунке видно, что благодаря воздействию исследуемого соединения, на внешней мембране образовались поры, которые позволили компонентам клетки легко проходить через них и вызывать разрушение клеток. Наружная мембрана или клеточная стенка бактерий, скорее всего, является мишенью для действия токсических веществ. В результате проникновения компонентов исследуемого соединения происходит изменение внешней мембраны и утечка внутриклеточного содержимого.
Изображения подтверждают потерю формы и целостности, после чего последовала гибель клеток.
Таким образом, исследуемое соединение, возможно, изменило структуру внешней мембраны, увеличило ее текучесть и проницаемость [8].
Нами показано, что наиболее сильные токсические эффекты проявили соединения 06.07.13-1 и 16.01.14-2 на всем диапазоне концентраций, токсичность соединения 28.02.14-3 по отношению к штам-
му Salmonella typhimurium TA 100 была незначительной в концентрации 6.25 и 12.5 мг/мл.
Исследуемые соединения оказали повреждающее действие на клетки различных микроорганизмов: в большей степени на Micrococcus lysodeikticus sp., Escherichia coli XL-1, в меньшей степени на Saccharomyces cerevisiae.
Исследуемые соединения обладают высокой степенью антимикробной активности, и в дальнейшем могут хорошо зарекомендовать себя в качестве потенциальных лекарственных препаратов.
Подобные работы уже проводились нами с соединениями фуранонового ряда [9] и ГРП семейства Болторн [10]. Эти вещества интересны своими возможными потенциальными лекарственными свойствами.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 14-03-00897-а.
Литература
1. Низамов, И. С. Флотореагенты на основе дитиокислот фосфора [Текст] / И.С. Низамов, Р.А. Черкасов, М.Б. Га-зизов, Ф.Д. Ямбушев // Органические соединения четы-рехкоординированного атома фосфора. - Казань.-2010.-С. 184-185.
2. Мельников, Н. Н. Пестициды (Химия, технология и применение) [Текст] / Н.Н. Мельников // Химия. М.-1987.- C.400.
3. Крамаренко, В. Ф. Фосфорсодержащие органические соединения и методы их анализа [Текст] / В. Ф. Крамаренко // Токсикологическая химия. Киев.- 1989.- 400 с.
4. Низамов, И. С. Дитиофосфорные кислоты [Текст] / И.С. Низамов, Р.А. Черкасов, М.Б. Газизов, Ф.Д. Ямбушев // Органические соединения четырехкоординиро-ванного атома фосфора. - Казань.-2010.-С. 186-188.
5. Мельников, Н. Н. Справочник по пестицидам [Текст] / Н. Н. Мельников, К.В.Новожилов, С.Р.Белан, Т. Н. Пы-лова // Химия. М.-1985.^ 352 .
6. Фонштейн, Л. М. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем [Текст] / Л. М. Фонштейн, С. К. Абилев, Е. В. Бобринев; Методические указания.-Москва, 1985.- 34с.
7. Маргулис, А.Б. Методы генетической токсикологии /
A.Б. Маргулис, Н.С. Карамова, О.Н. Ильинская // Учебно-методическое пособие.- Казань: КФУ, 2012.36 с.
8. Hatice Zengin, Ayse H. Baysal. SEM Microscopy[Text] // Hatice Zengin, Ayse H. Baysal // Antibacterial and Antioxidant Activity of Essential Oil Terpenes against Pathogenic and Spoilage-Forming Bacteria and Cell Structure-Activity Relationships Evaluated by SEM Microscopy.-Molecules.-2014.-P.17786-17790.
9. Митько, В.Е. Токсические и генотоксические эффекты новых синтезированных фуранонов и их галогенирован-ных производных [Текст] / В.Е. Митько, А.Б. Маргулис,
B.Я. Пономарев, А.И. Колпаков, О.Н. Ильинская // Вестник Казанского технологического университета.-2013.- Т.16, №11.- С.211-213.
10. Захаров, И.С. Генотоксические эффекты новых гипер-разветвленных полимеров [Текст] / И.С. Захаров, А.И. Колпаков, О.Н. Ильинская, И.С. Низамов, В.Я. Пономарев, А.Б. Маргулис // Вестник Казанского технологического университета.- 2014.- Т.17, №14.- С. 367-369.
© И. С. Захаров, аспирант каф. микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии К(П)ФУ, ivanzakharov2011@gmail.com; А. П. Бравкова, студент той же кафедры, a.bravkova@yandex.ru; В. Я. Пономарев, к.т.н., доцент каф. технологии мясных и молочных продуктов КНИТУ, v.y.ponomarev@gmail.com; И. С. Низамов, д.х.н., профессор каф. химического образования Химического института им А.М. Бутлерова К(П)ФУ, isnizamov@mail.ru; Б. М. Куриненко, д.б.н., профессор каф. микробиологии К(П)ФУ, boris.kurinenko@kpfu.ru; А. Б. Маргулис, к.б.н., доцент каф. микробиологии К(П)ФУ, anna.margulis@kpfu.ru.
© I. S. Zakharov, a graduate student cafes. Microbiology, Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan (Volga Region) Federal University,(ivanzakharov2011@gmail.com, A. P. Bravkova, a student. Biotechnology, Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan (Volga Region) Federal University, a.bravkova@yandex.ru, V. Ya. Ponomarev, Ph.D., assistant professor. technology of meat and dairy products of the Institute of Food Production and Biotechnology KNRTU, vyponomarev@gmail.com, I. S. Nizamov, Ph.D., professor of Department of chemical education of Chemical institute named of A.M. Butlerov, Kazan (Volga Region) Federal University, isnizamov@mail.ru, B. M. Kurinenko, PhD, professor of Microbiology Department, Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan (Volga Region) Federal University, boris.kurinenko@kpfu.ru, A. B. Margulis, PhD, assistant professor. Microbiology, Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan (Volga Region) Federal University, anna.margulis@kpfu.ru.
