CC BY
19© Коллектив авторов, 2022 https://doi.org/10.29296/24999490-2022-04-08
ИНДУКЦИЯ АПОПТОЗА КЛЕТОК РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЭКСТРАКТОМ БАДЯГИ РЕЧНОЙ
А.А. Николаев, Н.И. Гудинская, М.В. Ушакова
ФГБОУВО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, Российская Федерация, 414000, Астрахань, ул. Бакинская д. 121
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Николаев Александр Аркадьевич — зав. кафедрой химии ФГБОУ ВО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава РФ. Доктор медицинских наук, профессор. Тел.: +7(927) 555-51-44. E-mail: chimnik@mail.ru. ORCID: 0000-0001-6607-430X
Гудинская Наталья Игоревна — доцент кафедры химии ФГБОУ ВО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава РФ. Кандидат медицинских наук, Тел.: +7 (905) 360-62-76. E-mail: gudnat@yandex.ru ORCID: 0000-00022643-4806
Ушакова Мария Владимировна — доцент кафедры химии ФГБОУ ВО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава РФ. Кандидат биологических наук, Тел.: +7(927) 575-50-72. E-mail: ms.ehrich@mail.ru ORCID: 0000-00018109-7163
Введение. Рак предстательной железы (РПЖ) на сегодняшний день является самым часто диагностируемым злокачественным новообразованием органов мочевой системы. Патогенез и молекулярные механизмы РПЖ остаются понятыми неполностью. Имеются сообщения о наличии в экстрактах нескольких видов морских и пресноводных губок биоактивных метаболитов, снижающих пролиферативную активность раковых клеток, в частности, клеток РПЖ.
Целью исследования явилась оценка влияния экстракта бадяги речной (ЭБР) на жизнеспособность и апоптоз клеток РПЖ LNCAP клона ФСК (ЕСАСС 89110211) и связанный с этим механизм.
Материал и методы. В работе использованы ЭБР (Ephydatia fluviatilis), клетки LNCAP клона ФСК (ЕСАСС 89110211). Анализ клеточной пролиферации проводили стандартным МТТтестом, анализ апоптоза — методом проточной цитометрии с использованием проточного цитофлуориметра Attune® NxT. Набор для обнаружения апоптоза ANNEXIN V-FITC APOPTOSIS DETECTION KIT I (BD PharmingemTM, США) использован для дальнейшего подтверждения апоптоза, чтобы определить влияние ЭБР на сигнальный путь, участвующий в этом исследовании. Проапоптотические и антиапоптотические белки в клетках LNCAP оценивали методом вестерн-блотт анализа.
Результаты и обсуждение. Предварительное исследование эффекта ЭБР на пролиферацию клеток LNCAP показало, что ЭБР проявил максимальный эффект торможения роста на клетки LNCAP, начиная со 2-х суток инкубации. Дальнейший эксперимент преследовал цель выяснения зависимости ингибирующего эффекта от концентрации ЭБР в среде культивирования. Показана сильная взаимосвязь доза-ответ ЭБР и жизнеспособности клеток LNCAP. Однако показано, что ЭБР вызывал небольшое достоверное увеличение жизнеспособности клеток между 0 мкг/мл (контроль) и 6,25 мкг/мл. Такую реакцию можно объяснить известным эффектом гормезиса. При оценке профиля безопасности ЭБР показан индекс селективности 7,24. Отмечено, что именно апоптоз способствовал снижению жизнеспособности клеток РПЖ линии LNCAP после воздействия ЭБР. Существует прямая зависимость уровня апоптоза от концентрации ЭБР в культуральной жидкости. Вестерн-блоттинг клеток LNCAP, обработанных ЭБР различных концентраций (0, 50, 100 и 200 мг/мл) для оценки экспрессии белков Bcl-2, Bax показал, что уровень Bax растет, а Bcl-2 — падает.
Заключение. ЭБР оказывает ингибирующее влияние на рост и жизнеспособность клеток РПЖ, вызывая их апоптоз. Обработка ЭБР также увеличивала соотношение экспрессии Bax/Bcl2, что указывает на участие митохондриально-опосредован-ного внутреннего апоптотического пути.
Ключевые слова: рак предстательной железы, индукция апопотоза, экстракт бадяги речной
INDUCTION OF APOPTOSIS OF PROSTATE CANCER CELLS BY THE EXTRACT OF THE FRESHWATER SPONGE
A.A. Nikolaev, N.I. Gudinskaya, M.V. Ushakova
FGBOU VO «Astrakhan State Medical University» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 121 Bakinskaya str., Astrakhan, 414000, Russian Federation
INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Nikolaev Alexander Arkadievich — Head of the Department of Chemistry of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Astrakhan State Medical University» of the Ministry of Health of the Russian Federation. Doctor of Medical Sciences, Professor. Tel.: +7(927) 555-51-44. E-mail: chimnik@mail.ru. ORCID: 0000-0001-6607-430X
Gudinskaya Natalya Igorevna — Associate Professor of the Department of Chemistry of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Astrakhan State Medical University» of the Ministry of Health of the Russian Federation. Candidate of Medical Sciences, Tel.: +7(905) 360-62-76. E-mail: gudnat@yandex.ru ORCID: 0000-0002-2643-4806
Ushakova Maria Vladimirovna — Associate Professor of the Department of Chemistry of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Astrakhan State Medical University» of the Ministry of Health of the Russian Federation. Candidate of Biological Sciences. Tel.: +7(927) 575-50-72. E-mail: ms.ehrich@mail.ru ORCID: 0000-0001-8109-7163
Introduction. Prostate cancer (PC) is by far the most commonly diagnosed malignant neoplasm of the urinary system. The pathogenesis and molecular mechanisms of prostate cancer remain incompletely understood. There are reports of the presence in the extracts of several species of marine and freshwater sponges of bioactive metabolites that reduce the proliferative activity of cancer cells and, in particular, prostate cancer cells.
Purpose. The purpose of our study was the effect of freshwater badyagi extract on the viability and apoptosis of prostate cancer cells LNCAP clone FSK (ECACC 89110211) and the associated mechanism.
Material and methods. In the work, we used an extract of the Commonweed (EPHYDATIA FLUVIATILIS), LNCAP cells of the FSK clone (ECAC 89110211), Analysis of cell proliferation was performed by a standard MTT test, Analysis of apoptosis was performed by flow cytometry using an Attune® NxT flow cytometer ANNEXIN Apoptosis Detection Kit V-FITC APOPTOSIS DETECTION KIT I (BD Pharmingem™, USA) was used for further confirmation of apoptosis. To determine the effect of bodyaga extract on the signaling pathway involved in this study, pro-apoptotic and anti-apoptotic proteins in LNCAP cells were assessed by Western blot analysis.
Results and discussion. A preliminary study of the effect of EBR on LNCAP cell proliferation showed that EBR exhibited the maximum growth inhibition effect on LNCAP cells starting from the second day of incubation. The further experiment pursued the goal of elucidating the dependence of the inhibitory effect on the concentration of EBR in the cultivation medium. A strong dose-response relationship between EBR and LNCAP cell viability was shown. However, it was shown that EBR caused a slight significant increase in cell viability between 0 ^g/ml (control) and 6.25 ^g/ml. This reaction can be explained by the well-known hormesis effect. An assessment of the safety profile of EBR showed a selectivity index of 7.24. It was shown that it was apoptosis that contributed to the decrease in the viability of LNCAP prostate cancer cells after exposure to EBR. Moreover, there is a direct dependence of the level of apoptosis on the concentration of EBR in the culture liquid. Western blot analysis of LNCAP cells treated with various concentrations (0, 50, 100 and 200 mg/ml) of EBR to assess the expression of Bcl-2, Bax proteins showed that the level of Bax was rising and Bcl-2 was falling.
Conclusion. EBR has an inhibitory effect on the growth and viability of prostate cancer cells. causing apoptosis of prostate cancer cells. EBR treatment also increased the Bax/Bcl2 expression ratio, indicating involvement of a mitochondria-mediated intrinsic apoptotic pathway.
Key words: prostate cancer, apoptosis induction, bodyaga extract
ВВЕДЕНИЕ
Рак предстательной железы (РПЖ) на сегодняшний день является самым часто диагностируемым злокачественным новообразованием органов мочевой системы, занимающим 4-е место в структуре онкологической заболеваемости в нашей стране и 1-е место по темпам его прироста в последние годы. Заболеваемость РПЖ неуклонно растет, особенно среди мужчин пожилого возраста. РПЖ выявляется у 1 из 39 мужчин в возрасте 40—59 лет, у 1 из 14 — в возрасте 60—69 лет, у 1 из 7 — после 70 лет [1]. Тем не менее патогенез и молекулярные механизмы рака простаты остаются не полностью понятыми. Определение механизмов, вовлеченных в инициацию и прогрессирование РПЖ, может привести к улучшению профилактике и лечения этого заболевания.
Имеются сообщения о наличии в экстрактах нескольких видов морских и пресноводных губок биоактивных метаболитов, снижающих пролифератив-ную активность раковых клеток, в частности, клеток РПЖ [2].
Целью нашего исследования стало влияние экстракта бадяги речной (ЭБР) на жизнеспособность и апоптоз клеток РПЖ ЬКСАР клона ФСК (ЕСАСС 89110211) и связанный с этим механизм.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Сырье. Бадяга речная (Ephydatia fluviatilis) представляет собой колонии губок, обитающих в пресной воде. Бадяга встречается в реках, водоемах, водохранилищах, прудах и покрытых водой болотах. Бадягу собирали в июле—августе 2016 г. в дельтовых районах Астраханской области. Ее вытаскивали из воды, удаляли посторонние примеси, промывали в воде и сушили на открытом воздухе без доступа прямых солнечных лучей. После полного высушивания биомассу растирали в порошок и хранили в сухих емкостях из темного стекла при комнатной температуре. Сырье поступившее на исследование представляет собой порошок серо-бурого цвета, сыпучий, негигроскопичный, без ощутимого запаха.
Сначала 400 г этого порошка экстрагировали 2,0 л 76% этанола в течение 2 ч при 60°С. Затем неочищенные экстракты фильтровали и лиофилизировали с получением всего 45 г коричневого порошка. Этот порошок хранили в темноте при +4°С. Для анализов in vitro ЭБР готовили в виде исходного раствора 200 мг/мл в ДМСО и хранили при 20°С. Затем исходный раствор разбавляли в соответствующей среде и 0,1% ДМСО служил в качестве контроля носителя. Клетки LNCAP клона ФСК (ЕСАСС 89110211)
(Sigma-Aldrich (Worldwide)Culture Collections,Public Health England, Porton Down Salisbury, SP4 0JG UK (ООО «Спутник-К) были выращены в среде RPMI-1640, содержащей 10%-й сыворотки крови теленка, 100 ^g/ml стрептомицина и 100 U/ml пенициллина в увлажненном 5%-м CO2 и 95%-м воздушном(эфирном) инкубаторе при 37°C.
Анализ клеточной пролиферации. Клетки LNCAP[3] были посеяны в 96-луночные культураль-ные планшеты [2000 клеток/лунка в 150 мкл стандартной среды RPMI-1640 + 2 mM глутамина + 1.0 mM пируват натрия + 10% сыворотки теленка (FBS) с концентрациями (0, 20,0, 60,0 и 100 мкмоль/л) ЭБР. После 48 ч воздействия ЭБР проводили стандартный МТТ тест; 50 мкл раствора 3-(4,5-диметилтиазол)-2,5-дифенилтетразолий бромид (MTT) (250 мкг/мл в среде RPMI-1640) добавляли в каждую лунку, клетки инкубировали при 37°С в течение 4 ч; планшеты центрифугировали при 380 g в течение 5 мин, супер-натант удаляли, а затем добавляли 200 мкл диметил-сульфоксида в каждую лунку. Через 20 мин регистрировали оптическую плотность (А) каждой лунки при длине волны 490 нм. Коэффициент выживаемости клеток рассчитывали по следующей формуле:
Клеточная выживаемость (%) =
= A опыт/ A контроль х 100].
Значение 50% цитотоксической концентрации (СС50) рассчитывали в соответствии [4].
Анализ апоптоза методом проточной цитоме-трии. Проточный цитофлуориметр Attune® NxT. Набор для обнаружения апоптоза ANNEXIN V-FITC APOPTOSIS DETECTION KIT I («BD Pharmingem™», США) использован для дальнейшего подтверждения апоптоза. Клетки LNCAP (10 000—20 000 клеток на лунку) высевали в 6-луноч-ные планшеты. Спустя 24 ч клетки обрабатывали ЭБР (0, 12,5, 25, 50, 100, 200 мг/мл) в течение 48 ч. Затем клетки собирали и дважды промывали холодным 0,85% раствором хлорида натрия, приготовленным на 0,05М фосфатном буфере рН=7,2 (PBS) с последующим окрашиванием 5 мл V-FITC и 5 мл PI в течение 10 мин. Состояние апоптоза в каждой группе определяли с помощью проточной цитометрии, а данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo. Этот эксперимент повторяется пять раз [5].
Вестерн-блот анализ. Чтобы определить влияние экстракта Бадяги на сигнальный путь, участвующий в этом исследовании, некоторые белки в клетках LNCAP оценивали вестерн-блоттингом [6]. Сначала клетки LNCAP обрабатывали указанными концентрациями (0, 50, 200, 200 мг/мл) экстракта бодяги в течение 48 ч. Затем клетки были отмыты дважды с холодным PBS и лизировали в RIPA-содержащем буфере в течение 30 мин. Надосадочную жидкость собирали после центрифугирования при 12 000 об/мин при 4°С в течение 20 мин. Концентрацию белка определяли с помощью набора для анализа белка BCA
(Pierce) с использованием бычьего сывороточного альбумина (BSA) в качестве стандарта концентрации белка. Клеточные лизаты, содержащие равные количества белка (20—40 мг) из каждого образца, подвергали электрофорезу в гелях додецилсульфат-по-лиакриламидного геля (SDS-PAGE) и переносили на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF) (Millipore «Immobilon FL»). Мембраны блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре с 5% BSA и затем инкубировали в течение ночи при 4°C с каждым первичным антителом. Мембрану инкубировали с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем проводили три 5-минутных промывания. Полосы идентифицировали с использованием набора диаминобензи-дин (ДАБ)-содержащего субстрата. Набор содержит хромофор-содержащий раствор (А), включающий от 0,1 до 10 мг/мл ДАБ в качестве хромофора перокси-дазы и воду, и хромогенный реагент (В), содержащий от 0,1 до 10 мМ по меньшей мере 1 хелатирующего средства, от 0,02 до 30 масс.% неионогенного поверхностно-активного вещества из алкилового эфира полиоксиэтилена (ПОЭ), от 3 до 300 мМ имидазола, от 0,001 до 0,3 масс.% пероксида водорода, и воду. Согласно инструкциям производителя. Экспрессию белка Bcl-2, Bax количественно определяли с помощью денситометрического анализа с использованием Image-Pro Plus и нормализовали относительно экспрессии р-актина.
Cтатистический анализ. Эксперименты на основе клеточных культур проводились пятикратным дублированием. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы STATISTICA 6.1 (разработчик — StatSoft.Inc). Поверку распределения результатов поводили по критерию Колмогорова, т.к. распределение показателей не отличались от нормального (значимость различий оценивали по Стьюденту) для описания полученных количественных признаков данные представляли в виде средней (М) и ошибки средней (m). Различия между выборками считались достоверными при значении для р<0,05. Достоверность различий оценивали с помощью критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Чтобы оценить антипролиферативный эффект ЭБР, клеточные линии рака простаты LNCAP обрабатывали нарастающими концентрациями ЭБР (0, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 и 200 мкг/мл) по 24; 48 и 72 ч соответственно. Жизнеспособность клеток определяли анализом МТТ. ЭБР ингибировал рост клеточных линий LNCAP клона ФСК (ЕСАСС 89110211). Предварительное исследование эффекта ЭБР на пролиферацию клеток LNCAP, используя максимальную концентрацию в 200 мкг/мл, в течение 24, 48, 72 ч показало, что ЭБР проявил максимальный эффект торможения роста на клетки LNCAP, начиная со вторых суток инкубации. Сроки большей
продолжительности практически не увеличивали способность ЭБР подавлять рост клеточных линий. На этом основании дальнейшие эксперименты с ЭБР по изучению зависимости от дозы проводили на культурах с 48-часовой преинкубацией. Дальнейший эксперимент преследовал цель выяснения зависимости ингибирующего эффекта от концентрации ЭБР в среде культивирования. Для каждой концентрации было проведено по 10 исследований ЭБР. Результаты приведены в табл. 1.
Данные, приведенные в табл. 1, указывают на сильную взаимосвязь доза-ответ ЭБР и жизнеспособности клеток LNCAP Жизнеспособность клеток LNCAP демонстрирует постепенное снижение с увеличением дозы ЭБР. Результаты свидетельствуют, что ЭБР вызывал небольшое достоверное увеличение жизнеспособности клеток между 0 мкг/мл (контроль) и 6,25 мкг/мл. Между дозами 6,25 и 12,5 мкг/мл отмечается недостоверное повышение числа жизнеспособных клеток, вызванное вероятно случайными причинами. Далее происходит статистически достоверное постепенное снижение после концентрации 12,5 до 200 мкг/мл.
Повышение числа жизнеспособных клеток при минимальной концентрации ЭБР можно объяснить известным эффектом гормезиса [7]. Важнейшим показателем цитоток-сичности любого препарата является его СС50. По нашим расчетам СС50 ЭБР составило 38,6 мкг/мл.
Далее оценивали избирательность токсического действия ЭБР Индекс селективности рассчитывали как отношение 50% цитотокси-ческой концентрации (СС50) для клеток фибробластов эмбрионов человека (ФЭЧ-Т институт вирусологии им. Д.И.Ивановского) к СС50 для опухолевых клеток LNCAP [8]. По нашим данным, СС50 для клеток фибробластов эмбрионов человека составил 279,6±28,4 мкг/мл, следовательно, индекс селективности составляет для ЭБР 7,24, что указывает на высокие профили безопасности ЭБР. Таким образом, приведенные выше данные означают, что ЭБР проявлял сильное цитостатическое действие на клетки LNCAP
Далее при рассмотрении причин цитотоксичности ЭБР исследовали роль апоптоза в развитии
цитотоксичности, вызванной ЭБР. Для количественной оценки апоптоза, вызванного ЭБР в клетках LNCAP, провели анализ с помощью проточной цитофотометрии после двойной метки аннексина V-FITC/PI. Использование многопараметрического анализа и одновременное докрашивание клеток красителями для нуклеиновых кислот, которые
Таблица 1
Ингибирующий эффект ЭБР на пролиферацию клеток LNCAP (в процентах от контроля)
Table 1
Inhibitory effect of the Spongia fluviatilis extract on the proliferation of LNCAP cells (as a percentage of the control)
Концентрации мкг/мл N (число наблюдений) Процент жизнеспособных клеток (от контроля) р
6,25 11 112,4±8,21% 0,046622
|12,5 9 105,3±3,21% 0,212344
25,0 11 87,5±4,13% 0,020535
|50,0 9 64,8±8,68% 0,001430
100,0 10 21,8±10,13% 0,000001
¡200,0 9 18,4±12,77% 0,000015
PI
0 (контроль)
12,5 мкг/мл
25,0 мкг/мл
0/1 _ Q'2 1,1V.
O-i юдт Q/J А,21%
ч1 ir ч ч 50,0 мкг/мл
Ol 14.6* .'v^l ■'гЯЯ 1)1 R№ ¿5v
Q4 Q1 Ч.Ч-/,
VI MW VI Ш
^flj Vi?.»*
VI MI* -•УД: VI i
ЛЙГ (jj IM*
100,0 мкг/мл
1»" ч* ч
200,0 мкг/мл
vi ms* vi 21,4% vi i.*.<*- Vi «.ts fkir
я m
*** ■ . лЩ
Vitus VJÜ.IO». vt 2W* v» IMSfi
14* f*' 1 (■ J -
Annexin V-FITC
Рис. 1. Проточная цитометрия индукции апоптоза в клетках LNCAP воздействием ЭБР. Точечные графики после двойной маркировки с помощью Annexin V-FITC и PI. Клетки LNCAP обрабатывали увеличивающимися концентрациями (0, 12,5; 25,0; 50,0; 100,0 и 200,0мкг/мл) ЭБР. Ось X представляет окрашивание FITC, а ось Yпредставляет окрашивание PI (пропидий иодид) Fig. 1. Flow cytometry of induction of apoptosis in LNCAP cells by the action of the extract of the river bodya. Dot plots after double labeling with Annexin V-FITC and PI. LNCAP cells were treated with increasing concentrations (0, 12.5; 25.0; 50.0; 100.0 and 200.0 ng/ml) of EBR. The x-axis represents FITC staining and the y-axis represents PI staining
Таблица 2
Изменение уровня апоптоза клеток рака предстательной железы линии LNCAP в зависимости от концентрации ЭБР (n=5)
Table 2
Change in the level of apoptosis of prostate cancer cells of the LNCAP line depending on the concentration of the extract of the freshwater sponge (n=5)
ЭБР Ранний апоптоз, Ànn+PI- р Поздний апоптоз, Ànn+PI+ р Суммарный апоптоз р
0 (контроль) 4,18+0,30 - 2,10+0,30 - 6,28+0,30 -
12,5 7,45+0,27 0,0008 6,55+0,35 0,000027 14,00+0,82 0,003
25,0 25,14+0,32 0,00002 9,56+2,75 0,030784 34,70+2,07 0,00086
50,0 9,11+0,16 0,0007 14,90+1,90 0,000289 11,01+1,70 0,028918
100,0 22,12+0,84 0,0003 27,40+1,80 0,000002 49,52+2,56 0,000001
200,0 18,62+0,80 0,0005 46,10+1,35 0,000000 64,72+3,83 0,000001
не проникают в живые клетки, например, иоди-дом пропидия (Р1), позволяют дифференцировать клетки, находящиеся в раннеИ фазе апоптоза (АпУ+Р1-), позднем апоптозе (АпУ+Р1+), и мертвые клетки (АпУ-Р1+).
Весьма ценноИ является возможность одновременной оценки экспрессии мембранных маркеров и окрашивания АпУ, что позволяет охарактеризовать популяцию апоптотирующих клеток. Как показано на рис. 1, скорость апоптоза клеток ЬКСАР значительно увеличилась после 48-часовой обработки ЭБР с 6,3% в контрольной группе до 64,75% в группе концентрации ЭБР 200 мкг/мл.
Рис. 2. Вестерн-блоттинг клеток LNCAP, обработанных различными концентрациями (0, 50, 100 и 200мг/мл) ЭБР для оценки экспрессии белков Bcl-2, Bax. в-актин, служил в качестве контроля загрузки. Показаны статистические данные относительной экспрессии Bax, Bcl-2 после обработки ЭБР. Данные выражены как среднее стандартное отклонение от трех экспериментов (Объяснения в тексте)
Fig. 2. Western blotting of LNCAP cells treated with various concentrations (0, 50, 100 and 200 mg/ml) of EBR to assess the expression of Bcl-2, Bax proteins. в-actin served as a loading control. Statistical data on the relative expression of Bax, Bcl-2 after EBR treatment are shown. Data are expressed as the mean standard deviation of three experiments (See text for explanation)
Приведенные точечные графики профиля клеток были получены в 1 из 5 независимых экспериментов, которые дали аналогичные результаты. Квадрант Q1 отражает некротические клетки (AnV-PI+), квадрант Q2 отражает поздний апоптоз (AnV+PI+), квадрант Q3 отражает ранний апоптоз (AnV+PI-), квадрант Q4 отражает процент жизнеспособных клеток (AnV-PI-).
На основе точечных графиков составлена табл. 2, которая наглядно отражает динамику изменения уровня апоптозирующих клеток РПЖ линии LNCAP
Из данных, приведенных в табл. 2, очевидно, что именно апоптоз способствовал снижению жизнеспособности клеток РПЖ линии LNCAP после воздействия ЭБР. Причем существует прямая зависимость уровня апоптоза от концентрации ЭБР в культуральной жидкости. Статистический анализ подтвердил, что коэффициент корреляции Спирмена между уровнем суммарного апоптоза и концентрацией ЭБР равен 0,829. Связь между исследуемыми признаками — прямая, теснота (сила) связи по шкале Чеддока — высокая.
Чтобы дополнительно оценить предварительный механизм апоптоза, вызванного ЭБР, проведено исследование экспрессии антиапоптотиче-ского белка Bcl2 и проапопто-тического белка Bax методом иммуноблоттинга.
Результаты на рис. 2 указывают на снижение экспрессии антиапоптотического Bcl2 после обработки ЭБР. Экс-
прессия носит дозозависимый характер и достоверно снижается при концентрациях 100 (р=0,000837) и 200 (р=0,000095) мкг/мл.
Примечательно, что отношение экспрессии Bax/Bcl2 увеличилось с 0,53 в контрольной группе с носителем до 1,79 — в группе 200 мкг/мл. Эти данные указывают на то, что ЭБР способен индуцировать апоптоз клеток LNCAP и это может происходить через митохондриальный апоптотический путь.
Таким образом, мы продемонстрировали, что ЭБР оказывает очевидное ингибирующее влияние на рост и жизнеспособность клеток РПЖ. ЭБР также может вызывать апоптоз клеток РПЖ. Обработка ЭБР также увеличивала соотношение экспрессии
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Винник Ю.Ю., Андрейчиков А.В., Климов Н.Ю. Современное представление о диагностике рака простаты. Урология, 2017; 2: 110-52. [Vinnik Yu.Yu., Andrejchikov A.V., KlimovN.Yu. Sovremennoe predstavle-nie o diagnostike raka prostaty". Urologiya. 2017; 2: 110-52 (In Russian)].
2. Ottinger S., Klöppel A., Rausch V., Liu L., Kallifatidis G., Gross W., Gebhard M.M., Brümmer F., Herr I. Targeting of pancreatic and prostate cancer stem cell characteristics by Crambe crambe marine sponge extract. Int. J. Cancer. 2012; 130 (7): 1671-81. https://doi.org/ 10.1002/ijc.26168.
3. Николаев А.А., Выборнов С.В. Торможение роста клеток культуры рака простаты LNCAP аналогами полиаминов. Современные проблемы науки и
Для цитирования: Николаев А.А., Гудинская Н.И., Ушакова М.В. Индукция апоптоза клеток рака предстательной железы экстрактом Бадяги речной. Молекулярная медицина. 2022; 20 (4): 50-55. https:// doi.org/10.29296/24999490-2022-04-08
Bax/Bcl2, что указывает на участие митохондриаль-но-опосредованного внутреннего апоптотического пути. Эти результаты обеспечивают теоретическую основу для дальнейшего изучения ЭБР и других природных соединений, давая нам альтернативные пути найти лекарства для лечения рака и других заболеваний.
* * *
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
6. Pillai-Kastoori L., Schutz-Geschwender A.R., Harford J.A. A systematic approach to quantitative Western blot analysis. Anal Biochem. 2020; 593: 113608. https://doi. org/10.1016/j.ab.2020.113608.
7. Jodynis-Liebert J., Kujawska M.. Biphasic Dose-Response Induced by Phytochemi-cals: Experimental Evidence. J. Clin. Med. 2020; 9 (3): 2-28. https://doi.org/10.3390/ jcm9030718.
8. Razumov A., Zav'yalov E.L., Troitskii S.Yu., Romashchenko A.V., Petrovskii D.V., Kuper K.E., Moshkin M.P. Selective Cytotoxicity of Manganese Nanoparticles against Human Glioblastoma Cells. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2017; 163 (3): 561-5. https://doi.org/10.1007/ s10517-017-3849-0
Поступила 20 апреля 2022 г.
For citation: Nikolaev A.A., Gudinskaya N.I., Ushakova M.V. Induction of apoptosis of prostate cancer cells by the extract of the freshwater sponge. Molekulyarnaya meditsina. 2022; 20 (4): 50-55 (in Russian). https://doi.org/10.29296/24999490-2022-04-08
образования. 2016; 6: 1-8. [Nikolaev A.A., Vy"bornov S.V. Tormozhenie rosta kletok kul"tury" raka prostaty" LNCAP analogami poliaminov. Sovremenny"e problemy" nauki i obrazovaniya. 2016; 6: 1-8. URL: http://science-education.ru/ru/article/ view?id=25573 (In Russian)]. Niks M., Otto M. Towards an optimized MTT assay. J. Immunol Meth 1990; 130 (1): 149-51 https://doi.org/10.1016/0022-1759(90)90309-j.
Shi J.M., Huang H.J., Qiu S.X., Feng S.X., Li X.E. Griffipavixanthone from Garcinia oblongifolia champ induces cell apop-tosis in human non-small-cell lung cancer H520 cells in vitro. Molecules. 2014; 19 (2): 1422-31. https://doi.org/ 10.3390/mol-ecules19021422
