Индукция адвентивных луковиц на листовых и луковичных эксплантах редкого и охраняемого растения Lilium martagon L Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 58.085

ИНДУКЦИЯ АДВЕНТИВНЫХ ЛУКОВИЦ НА ЛИСТОВЫХ И ЛУКОВИЧНЫХ ЭКСПЛАНТАХ РЕДКОГО И ОХРАНЯЕМОГО РАСТЕНИЯ LILIUM MARTAGON Ь.1

E.E. Костюкова, В.В. Заякин, И.Я. Нам

Была исследована регенерационная способность листовых пластинок и луковичных чешуек Lilium martagon L. Для прямого побегообразования использовалась среда МС в сочетании с 1мг/л 6-БАП, 2мг/л ИУК; 1мг/л 6-БАП, 2мг/л НУК; 1мг/л 6-БАП, 2мг/л ИМК; 1мг/л 6-БАП, 2мг/л 2,4-Д. Наибольшая скорость и интенсивность побегообразования отмечены на среде с содержанием 1мг/л 6-БАП, 2мг/л ИУК.

Ключевые слова: регенерация, Lilium martagon L., луковичные и листовые экспланты.

ВВЕДЕНИЕ

Особое место среди глобальных проблем современности занимает сохранение растений, находящихся под угрозой исчезновения. Согласно последнему обзору Международного Союза Охраны Природы (IUCN), более одной пятой (22%) видов растений из Красного Списка находятся под угрозой исчезновения [1].

Большое внимание уделяется группе дикорастущих видов, обладающих высокой декоративностью. К ним относят редкий и исчезающий вид Lilium martagon L., занесенный в Красную книгу Брянской области [2; 3, с.34] и включенный в список Красных страниц Европы (LRE). Из-за вырубки лесов, замены растений монокультурами, сбора на букеты и выкапывание луковиц их численность постоянно сокращается, в связи с чем этот редкий вид нуждаются не только в охране, но и в размножении, с целью последующей реинтродукции в естественные условия местообитания [4].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Ткань луковичных чешуй является наиболее распространенным способом размножения [5, р.184]. К сожалению, подземные части растений сложно использовать в качестве эксплантов для культуры in vitro из-за высокого риска микробиологической контаминации, что объясняется рыхлостью расположения чешуй в луковице.

Поэтому для опыта по регенерации были использованы растения Lilium martagon L. найденные на территории Брянской области и ранее введенные в культуру in vitro [6].

В качестве эксплантов для размножения in vitro использовали листовые пластинки и луковичные чешуйки. Листовые пластинки 1 см длиной и целые луковичные чешуйки размером

0,5см длиной помещали на питательные среды с различными регуляторами роста2:

1) 1мг/л 6-БАП, 2мг/л ИУК;

2) 1мг/л 6-БАП, 2мг/л НУК;

3) 1мг/л 6-БАП, 2мг/л ИМК;

4) 1мг/л 6-БАП, 2мг/л 2,4-Д.

Питательные среды готовили по прописи MS [7, p.473], с добавлением 30г/л сахарозы, pH 5.8. Стерилизацию питательных сред проводили при температуре 120оС в течение 25±3 минут.

Первые 10 дней экспланты находились в темноте, после чего были перенесены на исскуственное освещение с фотопериодом: 16/8 ч свет/темнота.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Начало морфогенеза отмечалось через 10 дней на питательной среде MS с содержанием 6-БАП 1мг/л и ИУК 2мг/л. Образование побегов преимущественно наблюдалось на базальной части чешуек (рис.1).

Рисунок 1. Образование побегов на эксплантах луковичных чешуй.

1

Работа выполнена при поддержке грантов ФЦП №02.740.11.0285, АВЦП 2.11/224 и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно - технической сфере 2 Сокращения: 6-БАП - 6-бензиламинопурин, ИУК - индолил-3-уксусная кислота, НУК - нафтилуксусная кислота, ИМК - индолилмасляная кислота, 2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота

В результате проведенного опыта нам удалось подобрать условия регенерации, при которых эксплант развивается в растение, не образуя каллусной ткани.

К концу опыта максимальное количество точек регенерации образовалось на среде с 2,4-Д, однако первые точки регенерации появились на среде с ИУК, уже на 10 день опыта, в то время как на среде с 2,4-Д только на 20 (рис.2).

*

ш

У

о

н

о

со

н

и

ш

У

5

О

35 § 30 * 25

* 20

ГО

ш 15

£ 10

ш

а.

□ 6-БАП(1) ИМК(2)

□ 6-БАП(1) ИУК(2)

□ 6-БАП(1) НУК(2)

□ 6-БАП(1) 2,4-Д(2)

10

15 20

30

35

50 60

Время, дни

Рисунок 2. Влияние фитогормонов на образование точек регенерации

На 60 день интенсивное развитие регенерантов наблюдалось на всех вариантах сред (рис.3). К концу опыта максимальная высота побегов отмечена на среде с ИУК, незначительно отстает по этому показателю вариант среды с 2,4-Д. (рис.4).

и

ГС

н

X

го

а

си

X

си

|_

си

а

го

н

о

и

2

со

ОС

к

X

<£

си

а

и

3

2.5 2

1.5 1

0,5

0

6-БАП(1) ИУК(2) 6-БАП(1) 2,4-Д(2) 6-БАП(1) ИМК(2) 6-БАП(1) НУК(2)

10 15 20 30 35 50 60

Время, дни

Рисунок 3. Влияние фитогормонов на рост регенерантов в динамике.

X

га

а

ш

X

ш

|_

ф

а

о

и

2

со

к

к

X

Ч

ш

а

и

3

2.5 2

1.5 1

0,5

0

6-БАП(1) 6-БАП(1) 2,4- 6-БАП(1) 6-БАП(1)

ИУК(2) Д(2) ИМК(2) НУК(2)

Варианты среды

0

Рисунок 4. Влияние фитогормонов на величину регенерантов (через 60 дней).

На 30 день проведения опыта на средах с НУК и 2,4-Д началось формирование корневой

системы в местах образования регенерантов. К 35 дню формирование корневой системы было отмечено на среде с ИУК (рис.5). На среде с ИМК формирование корневой системы не обнаружено.

При сравнении видно, что начиная с 50 дня на среде с НУК, замечено самое интенсивное корнеобразование. По образованию корней заметно отстает вариант с ИУК, корни начинают образовываться только на 35 день и их количество меньше, чем в других вариантах опыта, но при этом их размеры к концу опыта превышают почти в три раза остальные варианты опыта (рис.6).

>s

X

а

о

*

о

со

н

и

а

т

S

о

б

10

15

20 30 35

Время, дни

50 б0

7

0

□ б-БАП(1) ИУК(2)

□ б-БАП(1) 2,4-Д(2)

□ б-БАП(1) ИМК(2)

□ б-БАП(1) НУК(2)

Рисунок 5. Влияние фитогормонов на образование корней.

б-БАП(1)

ИУК(2)

б-БАП(1) 2,4-Д(2)

б-БАП(1)

НУК(2)

б-БАП(1)

ИМК(2)

Варианты среды

Рисунок 6. Влияние фитогормонов на длину корней.

Спустя 2 месяца побеги переносили на среду MS для дальнейшего роста и размножения. Процесс ризогенеза проводили на среде MS/2 с содержанием 0,5мг/л ИУК и активированного угля 5г/л, что способствовало образованию развитой корневой системы и формированию растений готовых к пересадке в почву.

Опыт по регенерации листовых пластинок не дал положительных результатов. Через две недели проведения опыта были отмечены потемнение и гибель эксплантов.

Нами были выявлены ауксины наиболее активные при регенерации растений Lilium martagon L. из луковичных эксплатнов, ранее полученных из пробирочных растений. Самый высокий уровень регенерации был получен на среде с 2,4-Д. Несколько ниже по количеству регенетантов был результат с вариантом ИУК, однако на этой среде побеги были более развитые.

Таким образом можно сделать вывод, что наиболее подходящими средами для регенерации растений из луковичных чешуек являются варианты сред с ИУК и 2,4-Д. Менее эффективными оказались среды с ИМК и НУК.

Organogenetic capacity of leaves and bulb explants of Lilium martagon L. was tasted. For direct shoot formation MS medium with combination of 1mg/L BAP, 2mg/L IAA; 1mg/L BAP, 2mg/L NAA; 1mg/L BAP, 2mg/L IBA; 1mg/L BAP, 2mg/L 2,4 - D. Good results was obtained on MS basal medium with 1mg/L BAP, 2mg/L IAA and with 1mg/L BAP, 2mg/L 2,4 - D.

The key words: regeneration, Lilium martagon L., bulb and leaves explants

Список литературы

1. The IUCN Red List of Threatened Species -http://www.iucnredlist.org., accessed in September,

2010.

2. Красная книга Брянской области (http://www.inf-red.ru/liliia saranka.html)

3. Семенищенков Ю.А.. Термофильные леса юго-западного Нечерноземья и вопросы их охраны. // Лесопользование, экология и охрана лесов: фундаментальные и прикладные аспекты. / Материалы международной научно-практической конференции. Томск, 2005г. Стр. 34-35.

4. Костюкова Е.Е., Заякин В.В., Нам И.Я.. Клональное микроразмножение in vitro для сохранения редких и исчезающих видов растений, занесенных в Красную книгу Брянской области. // Сб. матер. международной научно-практической конференции молодых ученых «Современная биотехнология: фундаментальные проблемы, инновационные проекты и бионанотехнология», Брянск, 2010. - Стр. 71-75

5. Takayama S. & Misawa M. 1979. Differentation in Lilium bulbscales grown in vitro. Effect of

various cultural conditions. Physiol. Plant. 46: 184-190

6. Му-За-Чин В.В., Нам И.Я.. Клональное микроразмножение лилии саранки в культуре in

vitro // Теоретические основы применения биотехнологии, генетики и физиологии растений в современной селекции растений и растениводстве. / Материалы международной научно-

практической конференции молодых ученых. Брянск, 2009г. Стр. 193-186.

7. Murashige T. & Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plantarum 15: 473-497.

Об авторах

Костюкова Е.Е. - аспирант третьего года кафедры ботаники Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского, wild.biologist@mail.ru

Заякин В.В. - доктор биологических наук, профессор Брянского государственного

университета имени академика И.Г. Петровского.

Нам И.Я. - доктор биологических наук, профессор Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского.