CC BY
22
УДК 636.92:591.441 Дунаевська О. Ф.
1МУН0Г1СТ0Х1М1ЧНАХАРАКТЕРИСТИКА СУБП0ПУЛЯЦ1Й Л1МФ0ЦИТ1В
СЕЛЕ31НКИ КР0Л1В
Житомирський нацюнальний агроеколопчний утверситет (м. Житомир)
Оквапа [email protected]
Виконане досл\дження е частиною науково! тематики кафедри анатом\1 \ пстологп факультету вете-ринарно! медицини Житомирського нац\онального агроеколог\чного ун\верситету «Розвиток, морфо-лог\я та г\стох\м\я орган\в тварин у норм\ та при патологи», № державно! реестрацп 0113У000900.
Вступ. Селез\нка - багатофункц\ональний не-парний орган, розташований у черевн\й порожнин\. Це важливий орган л\мфоцитоутворення та \мун\те-ту, в якому п\д впливом антиген\в, наявних у кров\, в\дбуваеться утворення кл\тин, як\ продукують гу-моральн\ антит\ла чи т\, що беруть участь у реакц\ях кл\тинного \мун\тету й е б\олог\чним ф\льтром арте-р\ально! кров\. У н\й фагоцитуються стар\ та пошко-джен\ еритроцити й тромбоцити, що завершили св\й життевий цикл. Доведено, що основна II функц\я -нейтрал\зац\я у кров\ патогенних м\кроорган\зм\в, токсин\в, загиблих еритроцит\в, п\гмент\в \ електро-негативних коло!д\в [5].
Використання сучасних досягнень г\сто- та ци-то\муног\стох\м\1 \з застосуванням моноклональних антит\л та \муноферментного анал\зу дало змогу виявити на поверхн\ л\мфоцит\в та \нших \муноком-петентних кл\тин специф\чн\ рецептори, що можуть слугувати маркерами р\зних субпопуляц\1 кл\тин [5]. I стало можливим \мунофенотипування л\мфо-цит\в у норм\ та за патолог\чних стан\в орган\зму [1,2], вивчення впливу на популяц\1 р\зних чинник\в [7,10]. Встановлено, що в Т-залежн\й зон\ селез\нки (пер\артер\альн\ л\мфо!дн\ п\хви (ПАЛП) переважа-ють л\мфоцити популяц\й С03+ \ С04+, в незначн\й к\лькост\ виявляються С08+, наявн\ також макрофаги, ретикулярн\ кл\тини. У зовн\шн\х в\дд\лах таких п\хв б\льш пол\морфний склад, присутн\ популяц\1 В-л\мфоцит\в. Св\тлий центр л\мфо!дного вузлика е Т-незалежною зоною, тут розм\щуються основн\ три типи кл\тин: В-л\мфобласти, як\ д\ляться; дендрит-н\ кл\тини, як\ ф\ксують антиген \ збер\гають його протягом тривалого часу та в\льн\ макрофаги. Кр\м В-л\мфо1дних елемент\в м\ститься невелика к\ль-к\сть Т-л\мфоцит\в, серед яких переважають С04+, в менш\й к\лькост\ е С08+ кл\тини. Мант\йна зона л\мфо!дного вузлика, як \ св\тлий центр, в\дноситься до тимуснезалежно! зони. В н\й в\дбуваеться коопе-ративна взаемод\я Т- \ В-л\мфоцит\в, що зумовлюе р\зноман\тний популяц\йний склад л\мфоцит\в [5,6]. Серед популяц\й С08+ Т-л\мфоцит\в важливими е кл\тини пам'ят\ [8]. Т-л\мфоцити з кластерами С08+ зустр\чаються не т\льки в б\л\й, а й у червон\й пульп селез\нки [9]. 1муног\стох\м\чн\ досл\дження прово-
дяться, як правило, в гуманн\й медицин\ \ починають впроваджуватись для продуктивних тварин.
Мета дослщження. З'ясувати особливост\ мор-фофункц\онального стану селез\нки крол\в на основ! визначення вм\сту, розм\щення \ к\льк\сного сп\вв\дно-шення субпопуляц\й л\мфоцит\в С04+, С08+, С019+, С020+, як\ будуть доповнювати морфометричн\ тест-критер\1 органу та виступатимуть чутливими маркерами впливу фактор\в р\зноман\тного ^енезу.
0б'ект I методи дослщження. Для досл\дження зд\йснювали в\дб\р селез\нки в стад\1 морфофункц\-онально! зр\лост\ у кл\н\чно здорових статевозр\лих крол\в кал\форн\йсько! породи (6-8 м\сяц\в, к\льк\сть 34) обох статей у сп\вв\дношенн\ 1:1. Для м\кроско-п\чних досл\джень шматочки матер\алу ф\ксували в 10-12%-му охолодженому розчин\ нейтрального формал\ну, зд\йснювали параф\н\зац\ю. Г\столог\чн1 зр\зи виготовляли на санному м\кротом\ МС-2 тов-щиною не б\льше 5 мкм. Для виявлення та вивчення субпопуляц\й л\мфоцит\в при св\тлов\й м\кроскоп\1 використовували мишинн\ моноклональн\ антит\ла датсько! ф\рми ОДКО, експресуюч\ антигенн\ марке-ри С04+ (Т-хелпери), С08+(Т-цитотоксичн\ кл\тини \ нормальн\ Т-к\лери), С019+ (В-л\мфоцити ранн\х етап\в розвитку), С020+ (В-л\мфоцити на стад\1 ди-ференц\ац\1). Визначали розм\щення та вм\ст (абсо-лютну \ в\дносну к\льк\сть) \ к\льк\сне сп\вв\дношення популяц\й. 1мунорегуляторний \ндекс (1Р1) визначали як в\дношення к\лькост\ кл\тин С04+ до кл\тин С08+. Методики, статистична обробка результат\в вико-ристовувались в\дпов\дно до описаних в пос\бнику Горальського Л.П. з\ сп\вавторами (2005) [3]. Мор-фометричн\ досл\дження зд\йснювали за допомо-гою програми «Мав1:ег о1 МогрИо!оду».
Уся експериментальна частина досл\дження була проведена зг\дно з вимогами м\жнародних принци-п\в «бвропейськоУ конвенц\1 щодо захисту хребет-них тварин, як\ використовуються в експеримент\ та \нших наукових ц\лях» (Страсбург, 1986 р.) та в\дпо-в\дного Закону УкраУни «Про захист тварин в\д жор-стокого поводження» (№ 3446-1У в\д 21.02.2006 р., м. КиУв).
Результати досл1джень та "Гх обговорення. За
нашими попередн\ми досл\дженнями встановлено, що селез\нка крол\в в\дноситься до захисного типу, в\дносна площа б\лоУ пульпи становила 17,68±4,40% [4]. Л\мфо1дним вузликам (ЛВ) належало 67,59 % б\лоУ пульпи, решта - пер\артер\альним л\мфо1дним п\хвам. В склад\ л\мфо1дних вузлик\в ч\тко вид\лялась пер\артер\альна зона навколо центрально! артер\1, св\тлий центр, мант\йна \ марг\нальна зони. У струк-
тypi циx вyзликiв нaйбiльшoгo poзвиткy мaлa мapгi-нaльнa зoнa, чacткa якoÏ cтaнoвилa 38,85±11,98%. нaймeншoгo - cвiтлий цeнтp (17,37±6,01%). Чepвoнa пyльпa зaймaлa 76,45±3,78% мacи ceлeзiнки. Iмyнo-кoмпeтeнтнa фyнкцiя ceлeзiнки визнaчaeтьcя caмe ÏÏ лiмфoÏднoю ткaнинoю (бiлoю пyльпoю). Ocнoвними клiтинaми е лiмфoцити. 3a мopфoлoгiчнoю бyдoвoю i poзмipaми T-лiмфoцити кpoлiв вiдпoвiдaють мaлим фopмaм лiмфoцитiв. Зpiлi лiмфoцити дocягaли 6,26,4 мкм i мaли пepeвaжнo oкpyглe, piдшe - бoбoпo-дiбнe ядpo тa вузьку цитoплaзмy. B-лiмфoцити дeщo бiльшi зa poзмipaми - 8,3-8,5 мкм, зa cвoeю вeли-чинoю близькi дo cepeднix лiмфoцитiв. CyбпoпyляцiÏ лiмфoцитiв з клacтepaми CD4+, CD8+, CD19+, CD20+ в пульт ceлeзiнки poзмiщyвaлиcь пooдинoкo (pиc. 1) тa дифyзнo (pиc. 2), чacтiшe yтвopювaли лaнцю-ги (pиc. 3) aбo cкyпчeння (pиc. 4).
Рис. 1. CД4+-лiмфoцити у чepвoнiй пульпГ ceлeзiнки кpoлiв. X 400.
лocь 8,6±4,18 шт. нa ум. oд. пл. (13,99 % вщ зaгaльнoÏ кiлькocтi пoпyляцiÏ в бiлiй пyльпi), в ЛB - 52,86±19,02 шт. нa ум. oд. пл. B мaнтiйнiй зoнi ЛB дaнa пoпyляцiя пepeвaжaлa y пopiвняннi з cвiтлим цeнтpoм ЛB y 1,8 paзiв (21,00±8,94 шт. нa ум. oд. пл. i 37,80±14,88 шт. нa ум. oд. пл. вiдпoвiднo). IPI ПАЛП cтaнoвив бiльшe 1 (1,34) тa мeншe 1 y бiлiй пульт (0,92), нaймeнший IPI cвiтлoгo цeнтpy (0,53), y мaнтiйнiй зoнi цeй iндeкc дopiвнювaв 0,90.
Рис. 3. CД19+-лiмфoцити мянтГйнсГ зoни лiмфoïднoгo вузлика ceлeзiнки кpoлiв. х В0.
Cepeд пoпyляцiй B-лiмфoцитiв нa 0,7 % пepe-вaжaли CД19+ - лiмфoцити y пopiвняннi з CД20+. Haйбiльшa Ïx кiлькicть знaxoдилacь в мaнтiйнiй зoнi (37,83±9,80 i 37,29±4,40 шт. нa ум. oд. пл. в^^-вiднo), нaймeншa в ПАЛП (14,87±4,79 i 13,20±3,49 шт. нa ум. oд. пл. вiдпoвiднo). B пepiapтepiaльниx зoнax Ïx кiлькicть дocтoвipнo зpocлa дo 8,50±1, 12 i 11,75±1,48 шт. нa ум. oд. пл. (P >0,95). B cвiтлoмy цeнтpi кiлькicть CД19+ cтaнoвилa 32,64 % вiд зaгaль-нoÏ кiлькocтi пoпyляцiй ЛB бiлoÏ пульпи, Ïx кiлькicть нapaxoвyвaлa 18,33±2,36 шт. нa ум. oд. пл. B cвiтлo-му цeнтpi кiлькicть ОД20+ бyлa бiльшoю пpиблизнo нa 2 % i cтaнoвилa 34,75 % вщ зaгaльнoÏ кiлькocтi пoпyляцiй ЛB бiлoÏ пульпи, Ïx кiлькicть нapaxoвyвaлa 19,85±3,59 шт. нa ум. oд. пл. Taкa нeвeликa piзниця
Рис. 2. CД8+-лiмфoцити у пepiаpтepiальниx лГмф^Гдних шхвах ceлeзiнки кpoлiв. х 400.
Юлькють CД4+ в ПАЛП cтaнoвилa 20,25 % вiд зaгaльнoÏ юльте^ пoпyляцiй бiлoÏ пульпи, peштa (79,75 %) poзтaшoвyвaлacь в ЛB. B cвiтлoмy цeн-тpi ЛB Ïx ктькють cклaлa 45,29±13,34 шт. нa yмoвнy oдиницю плoщi (шт. нa ум. oд. пл.), в мaнтiйнiй зoнi -34,14±9,96 шт. нa ум. oд. пл., щo cтaнoвилo 24,61 % i 75,39 % вiдпoвiднo. Kлiтин CД8+ в ПАЛП нapaxoвyвa-
Рис. 4. CД20+-лiмфoцити пepiаpтepiальнoГ зoни лiмфoïднoгo вузлика ceлeзiнки кpoлiв. х 80.
Рис. 5. СубпопуляцГГ л1мфоцит1в 6iëoï пульпи селезшки крол1в у кГлькГсному вимГрюваннГ.
пояснюеться тим, що СД19+-л1мфоцити знаходять-ся на самих раншх етапах розвитку лшп, а СД20+-л1мфоцити на стадiях диференцiацiï В-кл^ин.
Kiлькiсний аналiз субпопуляцiй лiмфоцитiв бто)' пульпи селезiнки кролiв (рис. 5) свщчить, що серед дослiджуваних Т^мфоци^в СД8+. Це пояснюеться отриманими результатами при дослщженш клас-терiв селезшки мишей [6]: СД8+ можуть додатково експресуватися на дендритних ^тинах. Значний вмiст В-клiтин пояснюеться особливiстю первинно)' iмунноï вiдповiдi i наявнiстю у значнм кiлькостi роз-чинних форм антигешв, якi найбiльше презентатив-ш саме цим популяцiям [6]. Кшьюсть субпопуляцiй прямо пропорцiйно залежить вщ вiдносноï площ1 структурно) одиницi бто) пульпи: свiтлий центр за-ймае найменшу вiдносну площу, вiдповiдно, кшь-кiсть субпопуляцiй найменша.
Висновки
1. Вивчення iмуногiстохiмiчних популяцiй лiм-фоци^в CD4+, CD8+, CD19+, CD20+ засвщчило, що
вони розташовувались поодиноко в чер-вонiй пульпi, утворювали ланцюги i скуп-чення в бтм пульпi.
2. Kiлькiсть СД4+ кл^ин в перiарте-рiальних лiмфоïдних тхвах становила 20,25 % вiд загально[ кiлькостi популя-цiй бiлоï пульпи. В лiмфоïдному вузлику 75,39 % кластеру знаходилось в мантм-шй зонi.
3. В мантiйнiй зон популяцiя СД8+ переважала у порiвняннi з свiтлим центром у 1,8 разiв, в лiмфоïдних вузликах
- у 6,15 разiв вщносно перiартерiальних лiмфоïдних пiхв. 1мунорегуляторний Ыдекс перiартерiальних лiмфоïдних пiхв становив 1,34, бiлоï пульпи 0,92, свiтлого центру 0,53, мантмно[ зони 0,90.
4. Серед популяцм В-лiмфоцитiв незначно пере-важали СД19+. Hайбiльша ïх юльюсть знаходилась в мантiйнiй зонi, найменша в перiартерiальних лiм-фоïдних тхвах. В перiартерiальних зонах лiмфоïд-них вузликах ix кiлькiсть зросла з поодиноких кл^ин до 8,50±1,12 i 11,75±1,48 шт. на ум. од. пл. (СД19+1 СД20+ вiдповiдно). В марпнальшй зонi зустрiчались всi субпопуляцп у майже однакових кiлькостях, що зумовлено функ^ею кооперативноï взаeмодiï Т- i В^мфоци^в.
Перспективи подальших дослщжень. По-дальшi дослiдження плануемо спрямовувати на вивчення iнших субпопуляцм лiмфоцитiв селезiнки у кролiв з врахуванням рiзних вiкових груп.
Лгтература
1. Vpliv plazmaferezu na deyaki imunologichni pokazniki u zhinok z bezpliddyam trubnogo pohodzhennya / O.V. Bakun, O.A. And^ts, M.G. Oliynik[ta in.] // VisnikVDNZU «Ukrainska medichna stomatologichna akademiya». - 2012. - T. 12. - Vip. 3 (39). -S.116-118.
2. Gladkih A.A. Ekspressiya tsiklinov fazyi S1 v V-zrelokletochnyih limfomah cheloveka: avtoref. diss. na soiskanie nauch. stepenya k. b. nauk: spets. 03.03.04 «Kletochnaya biologiya, tsitologiya, gistologiya» / A.A. Gladkih. - M., 2013. - 26 s.
3. Goralskiy L.P. Osnovi gistologichnoуi tehniki i morfofunktsionalni metodi doslidzhen u normi ta pri patologiуi: navch. posibnik / L.P. Goralskiy, V.T. Homich, O.I. Kononskiy. — Zhitomir: Polissya, 2005. — 288 s.
4. Dunaiеvska O.F. Osoblivosti morfologiуi selezinki kroliv / O.F. Dunaiеvska // Visnik Problem biologiYi i meditsini. - Poltava, 2016.
- Vip. 1. - T. 1 (126). - S. 80-83.
5. Panikar I.I. Morfogenez organiv imunnoуi sistemi sviyskoуi svini na rannih etapah postnatalnogo periodu ontogenezu: avtoref. dis. na zdobuttya nauk. stupenya d. vet. nauk: spets. 16.00.02 "Patologiya, onkologiya i morfologiya tvarin" / I.I. Panikar. - K., 2015.
- 42 s.
6. Fedorovskaya N.S. Immunomorfologicheskaya harakteristika selezуonki pri tsitopeniyah immunnogo genezisa / N.S. Fedorovskaya, D.A. Dyakonov. - Kirov: Avers, 2013. - 101 s.
7. Acute arsenic exposure induces inflammatory responses and CD4+Tcell subpopulations differentiation in spleen and thymus with the involvement of MAPK, NF-kB, and Nrf2 / X. Duan, S. Gao, J. Li [et al.] // Molecular Immunology. - 2017. - № 81. - P. 160-172.
8. Immune signatures of protective spleen memory CD8 T cells / L. Brinza, S. Djebali, M. Tomkowiak [et al.] // Scientific Reports. -2016. — DOI: 10.1038/srep37651.
9. Local Cellular and Cytokine Cues in the Spleen Regulate In Situ T Cell Receptor Affinity, Function, and Fate of CD8+ T Cells / Y-J. Seo, P. Jothikumar, M.S. Suthar [et al.] // Immunity. - 2016. - № 45. - P. 988-998. - Режим доступу до журн.: http://dx.doi. org/10.1016/j.immuni.2016.10.024.
10. Spleen Tyrosine Kinase Is Involved in the CD38 Signal Transduction Pathway in Chronic Lymphocytic Leukemia / M.B.-Petersen, M. Buchner, Arlette Dorffel [et al.] // Plos One. - 2016. DOI:10.1371/journal.pone.0169159.
УДК 636.92:591.441
1МУНОГ1СТОХ1М1ЧНАХАРАКТЕРИСТИКА СУБПОПУЛЯЦ1Й Л1МФОЦИТ1В СЕЛЕ31НКИ КРОЛ1В Дунаевська О. Ф.
Резюме. Представлеш результати iмуногiстохiмiчноï характеристики субпопуляцм лiмфоцитiв бшо1 пульпи селезЫки статевозртих кролiв калiфорнiйськоï породи вком 6-8-ми мюяшв. З'ясовано розмщення, ктьюсний вмют субпопуляцм лiмфоцитiв CD4+, CD8+, CD19+, CD20+, вираховано iмунорегуляторний шдекс.
Встановлено, що л1мфоцити CD4+, CD8+ бтьше зосереджувалися в мантмнм 30HÍ, híx у св1тлому центр! л1мфо1дного вузлика. 1мунорегуляторний ¡ндекс пер1артер1альних л1мфо'щних nixB становив 1,34, бтоУ пуль-пи 0,92. Серед популяцм В-л1мфоцит1в незначно переважали СД 19+. Найбтьша ¿х ктьюсть знаходилась в мантмнм зон!, найменша в пер!артер!альних л1мфо'щних тхвах. В марпнальнм зон! наявн вс субпопуляцп.
Ключов1 слова: селезшка, морфолопя, !мунопстох!м!чна характеристика, крол!, бта пульпа, субпопуляцй' л!мфоцит!в CD4+, CD8+, CD19+, CD20+, л1мфо'щний вузлик.
УДК 636.92:591.441
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ СЕЛЕЗЁНКИ КРОЛИКОВ
Дунаевская О. Ф.
Резюме. Представлены результаты иммуногистохимической характеристики субпопуляций лимфоцитов белой пульпы селезёнки половозрелых кроликов калифорнийской породы возрастом 6-8-ми месяцев. Выяснено размещение, количественное содержание субпопуляций лимфоцитов CD4+, CD8+, CD19+, CD20+, рассчитан иммунорегуляторный индекс. Установлено, что лимфоциты Cd4+, Cd8+ больше сосредоточивались в мантийний зоне, чем в светлом центре лимфоидного фолликула. Иммунорегуляторный индекс периартериальных лимфоидных муфт составлял 1,34, белой пульпы 0,92. Cреди популяций В-лимфоцитов незначительно преобладали ОД 19+. Наибольшее их количество находилось в мантийний зоне, наименьшее в периартериальных лимфоидных муфтах. В маргинальной зоне имеющиются все субпопуляции.
Ключевые слова: селезенка, морфология, иммуногистохимическая характеристика, кролики, белая пульпа, субпопуляции лимфоцитов CD4+, CD8+, CD19+, CD20+, лимфоидный фолликул.
UDC 636.92:591.441
IMMUNOHISTOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF SUBPOPULATIONS OF SPLENIC LYMPHOCYTES IN RABBITS
Dunaievska О. F.
Abstract. The modern achievements of histo - and cytoimmunohistochemistry with the monoclonal antibodies and enzyme-linked immunosorbent assay are allowed detecting on the surface of lymphocytes and other immunocompetent cells the specific receptors that can serve as markers of various subpopulations of cells. Such immunohistochemical studies should be carried out under pathological conditions, primarily, disorders of the immune system, study the effects on populations of different factors. This is especially important to implement for productive of farm animals with the aim of obtaining the safe food.
Object and methods. For research were conducted selections of mature spleen сalifornia breed rabbits (6-8 mons) of both sexes (ratio female: male was 1:1).
For histological studies pieces of material recorded in the 10-12% refrigerated neutral formalin solution, with subsequent filling in paraffin. Paraffin sections were made at sledge microtome MC-2, with a thickness less than 5 microns. To identify and study subpopulations of lymphocytes by light microscopy are used murine monoclonal antibodies from Danish company DAKO, expressing antigenic markers CD4+, CD8+, CD19+, CD20+. The placement, content (absolute and relative quantity) and proportion of populations were determined. The immunoregulatory index was determined as the ratio of CD4+ cells to CD8+ cells.
Research results. The subpopulations of cells with CD4+, CD8+, CD19+, CD20+ in the splenic pulp was placed solitary and diffuses, often formed of a chain or cluster
The number of CD4+ in lymphoid sheaths near the vessels made up of 20,25 % of the total number of populations of the white pulp, and the rest (79,75 %) were located in pieces per unit area. The bright center of the lymphoid nodule number was 45,29±13,34 pieces per unit area, in mantle zone - 34,14± 9,96 pieces per unit area which amounted to 24,61 % and 75,39 %, respectively. The cells with CD8+ in lymphoid sheaths near the vessels were 8,6±4,18 pieces per unit area (13,99 % of the total number of population in the white pulp), in lymphoid nodule - 52,86±19,02 pieces per unit area. In the mantle zone of lymphoid nodule this population was predominant to compared to the bright center of lymphoid nodule in 1,8 times (21,00± 8,94 and 37,80±14,88 pieces per unit area respectively). The immunoregulatory index of the lymphoid sheaths near the vessels was > 1 (1,34), <1 in the white pulp (0,92), the lowest immunoregulatory index in the light center (0,53), in the mantle zone this index was equal to 0,90.
The light center number of CD19+ made up 32,64 % of the total population of the lymphoid nodule in the white pulp, their number is totaled 18,33±2,36 pieces per unit area. In the light center number of CD 20+ was increased by approximately 2 % and accounted for 34,75 % of the total population of the lymphoid nodule in white pulp, their number have consisted of 19,85±3,59 pieces per unit area. Such a small difference is because CD 19+cells are at a very early stage of development; the CD 20+cells are at the stages of differentiation of b-cells.
Quantitative analysis of subpopulations of lymphocytes of the splenic white pulp of rabbits is indicated that among the studied T-cells is dominated the CD8+. This is due to the results which obtained in the study of mice. The CD8+ cells can additionally expressive also in dendritic cells. A significant content of B-cells is explained to the feature of the primary immune response and the presence of considerable amount of soluble antigens which the most appealing these populations.
Keywords: spleen, morphology, immunohistochemical characteristics, rabbits, white pulp, cells subpopulations CD4+, CD8+, CD19+, CD20+, lymphoid nodule.
Рецензент — проф. Б1паш С. М.
Стаття надшшла 15.06.2017 року
