CC BY
47
УДК 611. 438-018
Л.М. МЕРКУЛОВА, Г.Ю. СТРУЧКО, М.Н. МИХАЙЛОВА
ИМУНОФАН КАК КОРРЕКТОР МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ В ТИМУСЕ, ВЫЗВАННЫХ ЦИКЛОФОСФАНОМ
Химиопрепараты широко применяются в клинике для лечения злокачественных новообразований. Однако они оказывают цитостатическое действие не только на опухолевые, но и на нормальные, активно пролиферирующие клетки организма, к которым относятся и клетки иммунной системы [1]. При этом уменьшаются масса и размеры лимфоидных органов, количество и функциональная активность лимфоцитов. В связи с нежелательным иммуно-депрессивным действием возникает необходимость использования препаратов, корригирующих вызванные цитостатиками нарушения в иммунной системе.
Для снижения побочных эффектов иммунодепрессоров применяют различные иммуномодуляторы [4]. Одним из них является имунофан - регуляторный пептид четвертого поколения, который обладает иммунокорригирующим действием в отношении Т-клеточного, фагоцитарного, противовирусного и антибактериального иммунитета, повышает генетическую стабильность лимфоцитов [6].
В литературе имеются данные, указывающие на участие биогенных аминов в регуляции внутриорганных процессов морфогенеза [2], в том числе и при супрессии иммунного ответа [3].
Цель исследования - изучить морфофункциональное состояние тимуса при введении циклофосфана и его комбинации с имунофаном.
Материал и методы исследования. Эксперименты выполнены на 145 крысах-самках массой 115-300 г, 14 из которых были интактными. Все процедуры проводились согласно правилам обращения с лабораторными животными. Проведено 3 серии экспериментов, каждая из которых включала курсовое 7-кратное введение разных препаратов с интервалом через день:
1 - введение циклофосфана в дозе 200 мг/кг однократно внутримышечно для моделирования иммунодепрессии [8] с последующим 7-кратным введением через день 0,5 мл физиологического раствора - 37 крыс;
2 - введение имунофана по 1 мкг/кг внутримышечно 7-кратно через день -34 крысы;
3 - комбинация однократного введения циклофосфана и имунофана через день 7-кратно в вышеуказанных дозах - 35 крыс.
В качестве контроля использованы животные, которым вводили по 0,5 мл физиологического раствора внутримышечно 7-кратно через день (п=25).
Тимус забирали через 1, 7 и 14 суток после последней инъекции, взвешивали, затем изготавливали криостатные срезы толщиной 10 мкм.
В работе использовали следующие методы: '
1) люминесцентно-гистохимический метод Фалька-Хилларпа [10] - для выявления серотонина (СТ) и катехоламинов (КА);
2) люминесцентно-гистохимический метод Кросса [9] для идентификации гистамина (ГСТ);
3) цитоспектрофлюориметрия для количественной оценки уровней катехоламинов, серотонина и гистамина в структурах тимуса; ;
4) вычисление соотношения (СТ+ГСТ)/КА (увеличение данного показателя косвенно свидетельствует о подавлении физиологической активности клетки, уменьшение - о стимуляции) [7];
5) окраска гематоксилином-эозином с последующей морфометрией коркового и мозгового вещества долек.
Результаты исследования. В тимусе интактных крыс на окрашенных гематоксилином-эозином срезах хорошо определяются дольки округлой, овальной или полигональной формы со светлым мозговым и темным корковым веществом. Ширина коркового вещества в норме составляет 510 мкм, диаметр мозгового - 989 мкм.
При люминесцентной микроскопии на границе коркового и мозгового вещества выявляется 1 -2 ряда люминесцирующих гранулярных клеток (ЛГК), проявляющих свойства аминопродуцентов. Это - премедуллярные клетки, заполненные гранулами разной величины с беловато-желтым, зеленовато-желтым или оранжевато-желтым оттенком. Гранулы обычно расположены компактно, не оставляя визуально различимых межгранулярных промежутков. На периферии коркового вещества локализуются более мелкие субкапсулярные клетки с гранулами зеленовато-желтого свечения, проявляющие свойства аминопоглотителей.
Цитоспектрофлюориметрия показывает, что ЛГК, а также тимоциты коркового и мозгового вещества содержат биогенные амины: серотонин, катехоламины и гистамин. Соотношение СТ+ГСТ/КА в премедуллярных клетках тимуса интактных животных составляет 2,33; в субкапсулярных - 2,37; в тимоцитах коркового и мозгового вещества 1,93 и 2,33 соответственно.
В серии с изолированным введением циклофосфана через сутки после курса инъекций большую часть лимфоидной ткани тимуса замещает жировая и соединительная ткань. Дольки уменьшаются в размерах, принимают полулунную или веретенообразную форму. Ширина коркового и диаметр мозгового вещества сокращаются в 4 и 2,6 раза и составляют 125 и 380 мкм соответственно. Это приводит к уменьшению массы органа в 1,8 раза.
На срезах, обработанных методами Фалька и Кросса, количество ЛГК в поле зрения увеличивается в 3-5 раз, они становятся более крупными, глыб-чатыми, часто сливаются друг с другом, образуя большие клеточные конгло-
мераты. Содержание биогенных аминов в них резко увеличивается. В преме-дуллярных клетках уровень гистамина возрастает в 2,4 раза, серотонина и катехоламинов - в 2 раза (рис. 1). Субкапсулярные клетки - аминопоглотите-ли в ответ на активацию работы клеток-аминопродуцентов также повышают свою функциональную активность. Уровень гистамина в них увеличивается в
3 раза, моноаминов - в 2,5 раза.
Сутки 1-е 7-е !4-е 1-е 7-е 14-е
Ш серотонин Ш гистамин □ катехоламины Рис. 1 Уровень биогенных аминов в премедуллярных клетках при введении циклофосфана и его комбинации с имунофаном
Возрастание содержания биогенных аминов в ЛГК сопровождается их сбросом в тимоцитарную паренхиму. Особенно значительно повышается уровень гистамина, что придает ткани диффузное желтовато-зеленое свечение. Его уровень в корковом веществе превышает норму в 4,8 раза, в мозговом - в 3,6 раза. Содержание моноаминов изменяется недостоверно.
Соотношение СТ+ГСТ/КА во всех исследуемых структурах возрастает, особенно резко в тимоцитах коркового и мозгового вещества, где составляет 3,50 и 3,54.
Через 7 суток выявляются наиболее выраженные изменения морфологии тимуса. Границы между дольками плохо дифференцируются, мозговое вещество располагается отдельными островками среди тимоцитов коркового вещества, Ширина коркового вещества по сравнению с предыдущим сроком исследования увеличивается вдвое, диаметр мозгового - в 1,4 раза, однако эти показатели остаются в 2 раза ниже нормы. Увеличение размеров долек сказывается на изменении массы органа, которая повышается на 30%, однако остается на 27% меньше, чем у интактных крыс.
При люминесцентной микроскопии выявляется несколько разных участков. Чаще обнаруживаются дольки с крупными и яркими ЛГК, корковое и мозговое вещество в которых ограничено прерывистым рядом премедуллярных клеток, плотно заполненных гранулами с яркой беловато-желтой люминесценцией. В других участках тимуса корковое и мозговое вещество долек
четко не дифференцируется, люминесцирующие клетки расположены хаотично. Обнаруживаются также бесструктурные дольки, в которых визуализируются лишь остатки распавшихся люминесцирующих клеток в виде сплошных оранжевато-желтых пятен или гранул с расплывчатыми контурами, накладывающихся друг на друга на фоне желто- зеленого свечения окружающей ткани.
Уровень биогенных аминов в ЛГК к 7-м суткам немного снижается. Содержание моноаминов в премедуллярных клетках почти достигает нормы, а в субкапсулярных клетках остается на 60% выше, чем у интактных крыс. Уро; вень гистамина снижается, но остается выше, чем в норме. В премедуллярных клетках он превышает норму в 1,5 раза (рис. 1), в субкапсулярных - в 2 раза. В тимоцитах коркового и мозгового вещества содержание гистамина уменьшается лишь на 30-40%, а уровни серотонина и катехоламинов по сравнению с предыдущим сроком не изменяются (рис. 2).
£ 70 ■
Я 60
| 50
I 40
§ 10 ю "
£ 20 а 10 £ 0
Й
їй
Норма
Сутки
ЦФ
1-е
С.Н.1
I
ЦФ
7-е
ЦФ
14-е
ЦФ+ИФ ЦФ+ИФ ЦФ+ИФ 1-е 7-е 14-е
□ серотонин ■ гистамин □ катехоламины
Рис, 2. Уровень биогенных аминов в тимоцитах мозгового вещества при введении циклофосфана и его комбинации с имунофаном
Соотношение СТ+ГСТ/КА через 7 суток в премедуллярных и субкапсулярных клетках увеличивается до 2,81 и 2,49 соответственно. В тимоцитах коркового вещества несколько уменьшается, но, несмотря на это, значительно превышает норму (2,66 против 1,93).
Через 14 суток выявляются маленькие дольки округлой или овальной формы среди островков жировой и соединительной ткани, в которых мозговое вещество, имеющее правильно овальную форму, окаймлено узким ободком коркового вещества. Ширина коркового вещества по сравнению с предыдущим сроком исследования уменьшается на 25%, диаметр мозгового незначительно увеличивается.
При обработке срезов тимуса методами Кросса и Фалька также хорошо определяются формирующиеся маленькие дольки с прерывистыми рядами премедуллярных клеток, местами образующих скопления. Премедуллярные клетки крупные, плотно заполнены беловато-желтыми гранулами. В формирующихся дольках выявляются внутримозговые ЛГК, а также новообразо-
ванные сосуды в виде ярко-зеленых концентрических структур, которые в норме не обнаруживаются.
На этом сроке происходит перераспределение биоаминов в сторону преобладания моноаминов. В премедуллярных клетках уровень гистамина снижается на 19%, однако все еще превышает норму в 1,4 раза. Уровни серотонина и катехоламинов повышаются, не достигая соответствующих значений суточного срока исследования (рис. 1-2). За счет снижения уровня гистамина соотношение СТ+ГСТ/КА во всех люминесцирующих структурах уменьшается. Лишь в тимоцитах коркового вещества данное соотношение остается высоким (таблица).
Соотношение СТ+ГСТ/КА в аминосодержащих клетках тимуса в норме, при изолированном введении физраствора (ФР), имунофана (ИФ), циклофосфана (ЦФ) и их комбинации (ЦФ+ИФ)
Клетки Норма ФР ЦФ ИФ ЦФ+ИФ
(- о 7 сут З г- 0 1 сут 7 сут 14 сут 1 сут 1 7 сут 14 сут 1 сут 7 сут 14 сут
ПМК 2,33 2,23 2,35 2,51 2,46 2,81 2,17 2,48 2,16 2,00 1.83 2,32 2,26
СКК 2,37 2,11 2,34 2,34 2,56 2,49 2,29 2,8 2,07 2,13 1,77 2,42 2,3
ТКВ 1,93 1,65 1,90 1,93 3,50 2,66 2,32 2,36 2,06 1,55 1,57 2,58 1,96
ТМВ 2,33 1,89 2,35 2,33 3,54 2,51 2,39 1.75 1,98 1,54 1,30 2,38 1,30
ПМК - премедуллярные клетки, СКК - субкапсулярные клетки, ТКВ - тимоциты коркового вещества, ТМВ - тимоциты мозгового вещества, жирным шрифтом отмечены высокие значения, подчеркнутым - низкие.
Изолированное введение имунофана приводит к увеличению размеров долек тимуса через 7 и 14 суток. Ширина коркового вещества через 7 суток увеличивается на 23%, диаметр мозгового - на 36%. Эти показатели остаются выше нормы и через 14 суток.
Через 1 сутки после курса введения имунофана биоаминсодержащие структуры реагируют недостоверным повышением уровня гистамина и увеличением количества люминесцирующих клеток. Через 7 суток содержание биогенных аминов соответствует норме. Через 14 суток выявляется инверсия коркового и мозгового вещества, за счет чего мозговое вещество, ограниченное волнообразным рядом премедуллярных клеток, приобретает звездчатую или лапчатую форму. На этом сроке содержание биоаминов возрастает. В премедуллярных клетках отмечается более значительное увеличение уровня серотонина и катехоламинов, в то время как уровень гистамина изменяется незначительно. В тимоцитарной паренхиме коркового и мозгового вещества содержание катехоламинов преобладает над уровнем супрессорных биоаминов, так как увеличение первых более существенно.
Соотношение СТ+ГСТ/КА после введения имунофана через 1 сутки воз-
растает во всех клетках, кроме тимоцитов мозгового вещества, где оно резко снижается (с 2,33 в норме до 1,75). Через 7 суток значения данного соотношения во всех клетках уменьшаются, а через 14 суток опускаются ниже соответствующих значений у интактных крыс, особенно в тимоцитарной паренхиме.
При комбинированном введении имунофана и циклофосфана структуры тимуса и биаминообеспечение клеток значительно отличаются от таковых при изолированном введении обоих препаратов. Через 1 сутки после комбинированного курса дольки тимуса существенно больше, чем при изолированном введении циклофосфана, хорошо отграничены друг от друга широкими соединительнотканными промежутками, жировой ткани вокруг долек значительно меньше. Ширина коркового вещества под влиянием имунофана увеличивается вдвое, но, тем не менее, остается на 40% меньше, чем у интактных крыс. Диаметр мозгового вещества увеличивается лишь на 15%.
На обработанных методами Фалька и Кросса срезах дольки имеют полигональную или треугольную форму. Мозговое вещество ограничено прерывистым рядом премедуллярных клеток. По всему корковому веществу равномерно разбросаны крупные яркие клетки - глубокие корковые ЛГК и суб-капсулярные клетки. В отличие от изолированного введения циклофосфана гранулы люминесцирующих клеток расположены неплотно, оставляя хорошо различимые межгранулярные промежутки. Контуры клеток неровные, но четкие. Количество ЛГК в поле зрения в 2 раза меньше, чем при изолированном введении циклофосфана. На препаратах, обработанных парами параформальдегида, очень часто выявляются внутридольковые сосуды и адренэр-гические нервные волокна.
Содержание биогенных аминов в люминесцирующих структурах тимуса так же, как при изолированном введении циклофосфана, значительно возрастает. Однако при комбинации его с имунофаном через 1 сутки преобладающими являются моноамины, а не гистамин. Уровень серотонина и катехоламинов в премедуллярных клетках увеличивается в 1,6 раза, что на 20% меньше, чем при изолированном введении циклофосфана. В то же время содержание гистамина практически не изменяется (рис. 1). В тимоцитах коркового и мозгового вещества преобладающими становятся катехоламины (рис. 2).
Изменения соотношения СТ+ГСТ/КА прямо противоположны таковым при изолированном введении циклофосфана. Если циклофосфан через 1 сутки повышает данное соотношение в сторону преобладания супрессорных биоаминов, то комбинированное использование препаратов вызывает его резкое падение во всех исследуемых клетках, благодаря увеличению содержания катехоламинов и низкому уровню гистамина (табл. 1).
Структура тимуса через 7 суток после комбинированного введения препаратов мало отличается от таковой при изолированном введении циклофосфана. Морфометрия долек показала, что существенного изменения размеров долек под влиянием имунофана на этом сроке не наблюдается.
В большинстве долек ЛГК расположены хаотично, корковое и мозговое
вещество дифференцируются не четко. Премедуллярные клетки образуют разорванные ряды, ограничивая мозговое вещество неправильной формы. Морфологически клетки сходны с таковыми у интактных крыс. В других дольках клетки яркие, глыбчатые. Характерно значительное увеличение количества субкапсулярных клеток (в 4-5 раз). Местами встречаются и бесструктурные дольки с остатками распавшихся ЛГК. Уровень моноаминов через 7 суток во всех исследуемых структурах снижается до нормы, уровень гистамина незначительно повышается, не достигая соответствующих значений при изолированном введении циклофосфана. Соотношение СТ+ГСТ/КА повышается, но не столь значительно, как при изолированном введении циклофосфана (табл. 1).
Дольки тимуса через 14 суток после комбинированного введения циклофосфана и имунофана большей величины, чем у крыс, которым вводили только цик-лофосфан. Корковое вещество местами вклинивается в мозговое, поэтому последнее имеет амебовидную форму. Ширина коркового вещества в 1,6 раза больше, чем при изолированном введении циклофосфана (рис. 3). Диаметр мозгового вещества увеличивается на 20%. Масса тимуса на 20% больше, чем при изолированном введении циклофосфана, и лишь на 7% меньше, чем у интактных крыс.
На срезах, обработанных методами Фалька и Кросса, количество люминес-цирующих клеток в поле зрения в 2 раза меньше, чем после введения только циклофосфана. Мозговое вещество, в отличие от изолированного введения циклофосфана, не содержит ЛГК и имеет лапчатую, а не овальную форму.
Содержание биогенных аминов в премедуллярных клетках ниже, чем при изолированном введении циклофосфана (рис. 1). В тимоцитарной паренхиме коркового и мозгового вещества (особенно в последнем) возрастает уровень катехоламинов (рис. 2), придавая ткани диффузное зеленоватое свечение. За счет того, что катехоламины значительно преобладают над уровнем супрессорных биоаминов, соотношение СТ+ГСТ/КА в мозговом веществе повторно опускается намного ниже нормы. Во всех остальных клетках данное соотношение практически такое же, как у интактных крыс (табл. 1).
—♦— циклофосфан Я циклофосфан+имунофан
Рис. 3. Ширина коркового вещества тимуса при введении циклофосфана и его комбинации с имунофаном
Таким образом, введение циклофосфана приводит к острой инволюции тимуса, что выражается в уменьшении размеров коркового и мозгового вещества долек, резком сокращении массы тимуса и жировом перерождении органа. Это может быть связано с прямой индукцией апоптоза тимоцитов [12] и уменьшением процента тимоцитов в S-стадии клеточного цикла [11]. Нами установлено, что при этом в структурах тимуса значительно увеличивается уровень биогенных аминов, возрастает доля гистамина, особенно в ти-моцитах коркового и мозгового вещества.
Имунофан, введенный на фоне иммуносупрессии циклофосфаном, оказывает положительное влияние на морфофункциональное состояние тимуса: увеличивает его массу, ширину коркового и мозгового вещества долек, снижает степень жирового перерождения органа. Являясь синтетическим производным тимического гормона тимопоэтина, имунофан способен активировать пролиферацию и дифференцировку Т-лимфоцитов посредством включения продукции различных факторов, контролирующих рост и развитие клеток [5]. В биоаминсодержащих структурах под его действием снижается уровень гистамина и увеличивается доля катехоламинов, особенно в тимоцитарной паренхиме. Наши данные показывают, что имунофан можно использовать для снижения отрицательного действия циклофосфана на лимфоидную ткань тимуса.
Литература
1. Булкина З.П. Противоопухолевые препараты. Киев: Наук, думка, 1991. 302 с.
2. Виноградов С.Ю. Морфогенез и нейромедиаторные биогенные амины // Морфология. 1993. №9-10. С. 59.
3. Девойно Л.В., Альперина Е.Л. Взаимодействие дофаминергической и серотонинергиче-ской систем в регуляции иммунного ответа // Регуляция иммунного гомеостаза. Л., 1982. С. 48-49.
4. Земсков AM., Караулов А.В., Земсков В.М. Комбинированная иммунокоррекция. М.: Наука, 1994. 260 с.
5. Имунофан - пептидный препарат нового поколения в лечении инфекционных и онкологических заболеваний: свойства, область применения / Покровский В.И., Лебедев В В., Шелепова Т.М. и др. //Практикующий врач. 1998. № 12. С. 14-15.
6. Караулов А. О. Молекулярно-биологическое обоснование применения имунофана в клинической практике // Лечащий врач. 2000. № 4. С. 46-47.
7. Стручко Г.Ю. Морфофункциональное исследование тимуса и иммунобиохимических показателей крови после спленэктомии и иммунокоррекции: Дис. ... докт. мед. наук. Саранск, 2003. 236 с.
8. Черненко О.Д., Гриневич Ю.А. Возможность восстановления интерферонообразования биологически активными факторами тимуса в условиях экспериментально вызванной иммунодепрессии//'Вопросы вирусологии. 1991. №4. С. 309-310.
9. Cross S.A., Ewen S. IV., Rost F.W. A study of methods available for cyto-chemical localization of histamine by fluorescence induced with o-phtaldehyde or acetaldehyde // J. Histochem. 1971. V. 3, N.6. P. 471-476.
10. Falk B., Hillarp N.A., Thieme G., Torp A. Fluorescence of catechol-amines and related compounds condensed with formaldehyde//J. Histochem. Cytochem. 1962. V.10, P. 348-354.
11. Miyauchi A., Hiramine C., Tanaka S., Hojo K. Differential effects of a single dose of cyclophosphamide on T cell subsets of the thymus and spleen in mice: flow cytofluorometry analysis // J. Tohoku. Exp. Med. 1990. №2. P. 147-167.
12. Strauss G., Osen W., Debatin K. Induction of apoptosis and modulation of activation and effector function in T cells by immunosuppressive drugs // Clin. Exp. Immunol. 2002. №2. P. 255-266.
МЕРКУЛОВА ЛАРИСА МИХАЙЛОВНА родилась в 1940 г. Окончила Самарский медицинский институт. Заслуженный деятель науки ЧР, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой функциональной и лабораторной диагностики Чувашского госуниверситета. Имеет более 170 научных работ в области радиобиологии, гистологии, физиологии и терапии.
СТРУЧКО ГЛЕБ ЮРЬЕВИЧ родился в 1974 г. Окончил медицинский факультет Чувашского госуниверситета, факультет иностранных языков Чувашского государственного педагогического университета. Доктор медицинских наук, доцент кафедры функциональной и лабораторной диагностики Чувашского госуниверситета. Имеет 75 научных работ в области гистологии, иммунологии и физиологии.
МИХАЙЛОВА МАРИНА НИКОЛАЕВНА родилась в 1974 г. Окончила Чувашский государственный университет. Ассистент кафедры нормальной и топографической анатомии Чувашского университета. Имеет 6 работ в области гистологии.
УДК 616.24-002.17: 612.017.1
Г.Г. МУСАЛИМОВА, В.Н. САПЕРОВ, Л.М. КАРЗАКОВА
КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И ИММУНОТЕРАПИЯ РОНКОЛЕЙКИНОМ МИКОПЛАЗМЕННОЙ И ХЛАМИДИЙНОЙ ПНЕВМОНИЙ
Пневмония является одним из наиболее распространенных заболеваний органов дыхания. Заболеваемость пневмонией составляет 10-15 случаев на 1000 населения в год [5,8,14]. Внебольничные пневмонии - самая большая группа пневмоний, с которой Каждодневно приходится сталкиваться практическому врачу в амбулаторной практике и в каждом терапевтическом стационаре. Наиболее частой причиной внебольничных пневмоний является Streptococcus pneumoniae (30-50%) [5,8,14]. Однако все большее значение среди этиологических факторов внебольничной пневмонии в последние годы придается так называемым атипичным микроорганизмам, прежде всего Mycoplasma pneumoniae и Chlamydophila (Chlamidia) pneumoniae, на долю которых приходится от 8 до 25 % случаев заболевания [6,7,9,12].
Mycoplasma pneumoniae и Chlamydophila pneumoniae являются внутриклеточными возбудителями и, по мнению ряда исследователей, могут дли-
