CC BY
52
УДК 611.438-018
Т В. АГАФОНКИНА, Л.М.МЕРКУЛОВА, Г.Ю. СТРУЧКО
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ТИМУСА И ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ КРЫС ПРИ ПРИЕМЕ ЦЕОЛИТСОДЕРЖАЩЕГО ТРЕПЕЛА
Проблема иммунодефицитных состояний и их коррекции является одним из актуальных вопросов современной медицины. Наряду с применением традиционных иммуномодулирующих препаратов в последние годы появилось большое количество биологически активных добавок различного происхождения, используемых для профилактики ряда иммунодефицитных состояний, а также для восполнения недостатка витаминов и микроэлементов [10].
Одним из таких представителей является минеральная биологически активная добавка - цеолитсодержащий трепел (ЦТ). Открытие и разработка месторождения ЦТ в Чувашской Республике, первые попытки успешного применения трепела в ветеринарии выдвинули задачу его всестороннего изучения.
Тимус, являясь центральным органом иммуногенеза, посредством биологически активных пептидов обеспечивает формирование естественного и приобретенного иммунитета [1]. Иммунорегуляторными факторами, реализующими функции тимуса, наряду с цитокинами и тимическими гормонами являются биогенные амины [14]. Поэтому детальное изучение морфологии тимуса и показателей крови при приеме цеолитсодержащего трепела позволит выяснить морфологические аспекты его действия.
Цель исследования — изучение морфофункционального состояния тимуса и показателей крови крыс через 2, 3 и 4 недели кормления цеолитсодержащим трепелом для оценки возможных иммуномодулирующих свойств препарата.
Материалы и методы исследования. Эксперименты проведены на 170 белых нелинейных крысах-самцах массой 200-250 г, 20 из которых были интакт-ными. Все процедуры по уходу осуществлялись по нормам и правилам обращения с лабораторными животными. Опытные животные разделены на 3 группы, каждая из которых включала по 50 крыс, в ежедневный рацион которых вводился ЦТ из расчета 5% общей массы корма в течение двух, трех и четырех недель. Эксперименты проводились в осенний период. Объектом исследования служили тимус и кровь. Материал забирали под глубоким эфирным наркозом через 2,3 и 4 недели после начала кормления трепелом во второй половине дня. Изготавливали криостатные срезы тимуса толщиной 10 мкм.
В работе использовались общегистологические методы исследования -окраска гематоксилином-эозином с последующей морфометрией коркового и мозгового вещества тимуса, окраска полихромным толуидиновым синим по Унна для качественной и количественной характеристики тучных клеток тимуса, окраска мазков крови методом Романовского-Гимза для подсчета лей-коформулы крови; люминесцентно-гистохимические - метод Фалька-Хил-ларпа в модификации Е.М. Крохиной [9] для избирательного выявления кате-
холамин- (КА) и серотонинсодержащих (СТ) структур тимуса и крови, метод Кросса, Эвена, Роста [13] с целью идентификации гистаминсодержащих (ГСТ) структур, метод цитоспектрофлуориметрии [8] для количественного определения уровня КА, СТ и ГСТ в аминосодержащих структурах крови и тимуса. С целью оценки иммунного статуса определялись следующие показатели: количество иммуноглобулинов класса G, M и А методом радиальной иммунодиффузии [7], активность системы комплемента по 50% гемолизу, уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови, фагоцитарная активность нейтрофилов с латексом [11].
Развернутый анализ крови выполнялся с помощью автоматического гематологического анализатора «Sysmex» (Япония). Определение мочевины, креа-тинина, мочевой кислоты, холестерина, кальция, общего белка проводилось на автоматическом биохимическом анализаторе «Dimension AR» фирмы Du Pont (США).
Цифровые данные обрабатывались статистически по специально поставленной программе. Статистическую достоверность определяли критерием Стьюдента (t). Использовался корреляционный анализ Пирсона для нахождения связей (зависимостей) между нормально распределенными количественными признаками.
Результаты собственных исследований. У интактных крыс дольки тимуса четко разделяются междольковыми соединительнотканными септами. Центральную часть дольки составляет светлое мозговое вещество, которое окружено более темным корковым веществом. При люминесцентной микроскопии тимуса интактных крыс мозговое вещество ограничено непрерывным рядом люминесцирующих гранулярных клеток (ЛГК), условно названных «премедуллярными клетками» [4]. Эти клетки содержат компактно расположенные гранулы, обладающие яркой беловато-желтой люминесценцией. По периферии долек, кнаружи от клеток внутренней кортикальной зоны располагаются более мелкие хаотично разбросанные «субкапсулярные клетки» c гранулами зеленовато-желтого свечения.
С помощью цитоспектрофлуориметрии установлено, что гранулы люми-несцирующих клеток, а также тимоциты коркового и мозгового вещества содержат биогенные амины (БА): ГСТ, СТ и КА, преобладающим среди них является гистамин.
Прием ЦТ приводит к достоверному увеличению ширины коркового, диаметра и площади мозгового вещества дольки уже через 2 недели кормления. Максимальное увеличение размеров долек тимуса наблюдается через 3 недели приема ЦТ, затем размеры коркового и мозгового вещества несколько уменьшаются, однако остается больше, чем у интактных крыс. Мы полагаем, что такие изменения долек в первые 3 недели кормления ЦТ происходят за счет активации процессов пролиферации и дифференцировки лимфоцитов. Через 4 недели течение этих процессов, вероятно, несколько замедляется.
При люминесцентной микроскопии срезов тимуса через 2 недели кормления ЦТ выявляются полигональные, в том числе округлые, дольки больших, чем в норме, размеров. Через 3 недели премедуллярные клетки располагаются
хаотическими скоплениями вокруг мозгового вещества, которое приобретает неправильную амебовидную форму. Общее количество люминесцирующих гранулярных клеток (ЛГК) в тимусных дольках увеличивается, максимально через 3 недели приема ЦТ (в 1,4 раза по сравнению с интактными крысами), за счет субкапсулярных гранулярных клеток. Через 4 недели кормления ЦТ обнаруживаются крупные дольки тимуса неправильно овальной формы с плотным рядом достаточно крупных премедуллярных клеток. Интенсивность люминесценции снижена.
Прием ЦТ приводит к изменениям уровня БА в люминесцирующих структурах тимуса. На примере клеток субкапсулярной зоны (рис. 1) демонстрируются постепенное увеличение уровня СТ и КА до 3-недельного срока и уменьшение уровеня ГСТ. По истечении 4 недель кормления уровень БА в структурах тимуса по сравнению с уровнем в предыдущие сроки и нормой резко снижен.
400
350
300
250
у.е. 200 150 100 50
норма
2 нед
3 нед
4 нед
■ СТ □ ГСТ Ш КА Рис.1. Интенсивность свечения биогенных аминов (у.е.) в субкапсулярных клетках тимуса у интактных крыс и после приема ЦТ
0
Известно, что КА активируют иммунокомпетентные клетки за счет стимуляции генной транскрипции и увеличения синтеза РНК, повышают хелперный эффект Т-лимфоцитов, являются модуляторами продукции ИЛ-1, ИЛ-8 и фактора некроза опухоли [6]. Поэтому можно полагать, что увеличение уровня КА в первые 3 недели приема ЦТ в биоаминсодержащих структурах тимуса косвенно доказывает его иммуностимулирующий эффект. Обсуждая снижение уровня ГСТ в люминесцирующих структурах тимуса, следует принять во внимание, что ГСТ, действуя через цАМФ, подавляет пролиферацию и дифференцировку лимфоцитов в эффекторные клетки [3]. Поэтому снижение ГСТ способствует усилению этих процессов.
Для характеристики суммарно направленного действия БА измерялось соотношение (СТ+ГСТ)/КА, увеличение которого косвенно свидетельствует о подавлении активности клетки, снижение - о ее стимуляции [12]. Во всех структурах тимуса, в частности в тимоцитах коркового и мозгового вещества,
при приеме ЦТ этот показатель уменьшается (рис. 2), что говорит об активации клеток этих зон.
Изменение содержания БА в тимусе сопровождается сдвигом в тучноклеточной популяции. Уже через 2 недели приема трепела намечается тенденция к увеличению количества тучных клеток. Абсолютное число тучных клеток максимально возрастает через 3 недели кормления ЦТ, в основном за счет частично или полностью дегранулированных Т-2 и Т-3 форм, затем число тучных клеток несколько уменьшается.
Как известно, тучные клетки многофункциональны и являются активными участниками иммунных процессов [2], а потому увеличение их количества и изменение функциональной активности в виде дегрануляции говорят об активации протекания иммунных реакций. Важной особенностью тучных клеток является их способность инактивировать высокие уровни БА путем связывания с гликозаминогликанами и гепарином [3], что может быть одной из причин наблюдаемого резкого снижения уровня биоаминов во всех структурах тимуса через 4 недели приема ЦТ. Инактивация БА сопровождается резким снижением люминесценции биоаминсодержащих структур, что и наблюдается в наших исследованиях через 4 недели.
-♦ - КВ —МВ
Рис.2. Изменение соотношения (СТ+ГСТ)/КА в тимоцитах коркового (КВ) и мозгового (МВ) вещества при кормлении ЦТ
В лимфоцитах периферической крови отмечается постепенное снижение уровня СТ, и через 4 недели приема ЦТ это снижение более чем в 2 раза по сравнению с интактной группой (рис.3).
Поскольку известно, что серотонинергическая система активирует супрессорную активность, влияя на численность Т-супрессоров, уменьшая выработку ^М и В-лимфоцитами, активируя миграцию супрессоров в костный мозг, а также контролируя скорость пролиферации иммунокомпетентных клеток [6], можно полагать, что снижение этого биоамина в лимфоцитах будет способствовать иммунопролиферативным процессам.
Необходимо обратить внимание на увеличение уровня ГСТ в лимфоцитах более чем в 2 раза через 2 недели кормления трепелом. Мы предполагаем, что
это приводит к росту количества лимфоцитов. Поскольку лимфопоэтические клетки экспрессируют на своей мембране рецепторы к ГСТ, то, связываясь с ними, ГСТ стимулирует деление этих клеток на ранних этапах дифференци-ровки [5]. Все это может привести к повышению количества лимфоцитов, что и подтверждается проведенными анализами крови.
у.е.
норма
2 нед
3 нед
4 нед
I серотонин □
гистамин
1 КА
Рис. 3 Интенсивность свечения биогенных аминов (у.е.) в лимфоцитах периферической крови у интактных крыс и через 2,3 и 4 недели кормления ЦТ
Соотношение (СТ+ГСТ)/КА в гранулоцитах крови изменяется волнообразно, его значение через 4 недели приема трепела достоверно ниже нормы, что говорит об усилении функциональной активности этих клеток. Увеличение фагоцитарной активности клеток крови, выявленное нами, подтверждает это.
Наиболее значимые изменения в анализах крови наблюдаются со стороны лейкоцитарного ростка. Количество лейкоцитов нарастает за счет увеличения абсолютного содержания лимфоцитов до 3-недельного срока, затем их процентное содержание несколько снижается, а количество нейтрофилов растет. Наблюдаемое увеличение числа лейкоцитов периферической крови может быть связано с увеличением содержания КА в плазме, которые способны стимулировать клеточный цикл, усиливать синтез предшественников гемопоэза и увеличивать выход зрелых клеток костного мозга в периферическую кровь [15].
Из показателей иммунограммы следует отметить, что уже через 2 недели приема ЦТ в крови увеличивается уровень ^А, а через 4 недели резко увеличивается уровень (рис. 4), что отражает повышение функциональной ак-
тивности В-клеток и позволяет судить об усилении гуморальных факторов защиты под действием изучаемого фактора.
Проведенный корреляционный анализ 92 линейных корреляционных пар, в состав которых входят изученные показатели, выявил усиление силы взаимосвязей к 4 неделям кормления ЦТ. Это свидетельствует о направленном включении различных биоаминсодержащих структур в иммунный ответ, а также о взаимозависимости и взаимообусловленности процессов, происходящих в тимусе и крови под действием трепела.
2,5
2
г/л 1,5 1
0,5
0
норма 2 нед 3 нед 4 нед
■ ■ ДО
Рис. 4. Иммуноглобулины крови (г/л) крыс в норме и при приеме ЦТ
Таким образом, отмеченное в эксперименте увеличение размеров долек тимуса, рост количества люминесцирующих гранулярных и тучных клеток, снижение уровня ГСТ и возрастание КА в структурах тимуса, уменьшение соотношения (СТ+ГСТ)/КА в структурах тимуса и гранулоцитах крови, увеличение числа лимфоцитов, повышение фагоцитарной активности крови, увеличение концентрации ^А и свидетельствуют о том, что ЦТ оказывает
существенное влияние на иммунную систему, причем наиболее выраженный стимулирующий эффект наблюдается через 3 недели приема препарата.
Литература
1. Акмаев И.Г. Нейроиммуноэндокринология: факты и гипотезы / И.Г. Акмаев // Проблемы эндокринологии. 1997. Т. 43, № 1. С. 3-9.
2. Бережная Н.М. Тучные клетки и гистамин: физиологическая роль / Н.М. Бережная, Р.И. Сепиашвили // Аллергология и иммунология. 2003. Т. 4, № 3. С. 29-38.
3. Быков В.Л. Развитие и гетерогенность тучных клеток / В.Л. Быков // Морфология. 2000. № 2. С. 86-92.
4. Гордон Д.С. Нейромедиаторы лимфоидных органов / Д.С. Гордон, В.Е. Сергеева, И.Г. Зеленова. Л.: Наука, 1982. 182 с.
5. Гущин Г.В. Проблема локальных механизмов взаимодействий нервной и иммунной систем / Г.В. Гущин // Взаимодействие нервной и иммунной систем: тез. докл. Всесоюз. симпоз. Ростов н/Д., 1990. С. 66.
6. Девойно Л.В. Биогенные амины в регуляции иммунных реакций / Л.В. Девойно // Химия и биология иммунорегуляторов. Рига: Знание, 1985. С. 206-221.
7. Иммунологические методы / под редХ. Фримель. М.: Медицина, 1987. 472 с.
8. Калмыков В.Л. Современные методы количественного определения катехоламинов и серотонина / В.Л. Калмыков // Лаб. дело. 1982. № 7. С. 31-36.
9. Крохина Е.М. Симпатический (адренергический) компонент эффекторной иннервации сердечной мышцы / Е.М. Крохина, П.Н. Александров // Кардиология. 1969. Т. 9, № 3. С. 97-102.
10. Кульбачинский В.В. Использование биологически активных добавок для первичной и вторичной профилактики различных заболеваний / В.В. Кульбачинский // Натуральная фармакология и косметология. 2005. № 6 . С. 27-31.
11. Медицинские лабораторные технологии: в 3 т. / под ред. А.И. Карпищенко. СПб.: Интермедика, 1998-1999.
12. Стручко Г.Ю. Морфофункциональное исследование тимуса и иммунобиохимических показателей крови после спленэктомии и иммунокоррекции: дис. ... докт. мед. наук / Г.Ю. Стручко. Саранск, 2003. 236 с.
13. Cross S.A. A study of methods available for cyto-chemical localization of histamine by fluorescence induced with o-phtaldehyde or acetaldehyde / S.A. Cross, S.W. Ewen, F.W. Rost // Histo-chem. V. 3, № 6. P. 471-476.
14. Hadden J.W. Thymic endocrinology / J.W. Hadden // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1998. V. 840. P. 352-358.
15. Maestroni G.I.M. Sympathetic regulation of hemopoisis. Direct noradrenergic modulation of myelocyte and lymphocyte progenitor cells in mouse bone marrow / G.I.M. Maestroni, A. Conti, E. Pedrinis // Acta med. rom. 1991. V. 29, № 3. Р. 295-310.
АГАФОНКИНА ТАТЬЯНА ВСЕВОЛОДОВНА родилась в 1978 г. Окончила Чувашский государственный университет. Кандидат медицинских наук, ассистент кафедры функциональной и лабораторной диагностики Чувашского университета. Область научных интересов - гистология, функциональная диагностика. Автор 20 научных работ.
МЕРКУЛОВА ЛАРИСА МИХАИЛОВНА родилась в 1940 г. Доктор медицинских наук, заслуженный работник высшей школы РФ, заслуженный деятель науки ЧР, профессор, заведующая кафедрой функциональной и лабораторной диагностики Чувашского государственного университета. Область научных интересов - радиобиология, гистология, физиология. Автор более 200 научных работ.
СТРУЧКО ГЛЕБ ЮРЬЕВИЧ родился в 1974 г. Окончил Чувашский государственный университет. Доктор медицинских наук, профессор кафедры функциональной и лабораторной диагностики Чувашского университета. Область научных интересов - гистология, иммунология, физиология. Автор более 100 научных работ.
