CC BY
34
УДК 612.017.1:612.112.31
Иммуномакс - агонист TLR4 - влияет на фенотип легочных макрофагов при респираторно-синцитиальной вирусной инфекции у мышей
А. А. Никонова1,2*, А. В. Пичугин1, М. М. Чулкина1, Е. С. Лебедева1, А. Р. Гайсина1, И. П. Шиловский1, Р. И. Атауллаханов1, М. Р. Хаитов1, Р. М. Хаитов1 Тосударственный научный центр Институт иммунологии ФМБА России, 115478, Россия, Москва, Каширское шоссе, 24
2Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, 105064,
Россия, Москва, Малый Казенный пер., 5А
*E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 06.10.2018
Принята к печати 08.11.2018
РЕФЕРАТ В экспериментах in vitro и in vivo изучено действие Иммуномакса - агониста TLR4 растительного происхождения. В частности, с использованием культуры макрофагов, выделенных из костного мозга мышей, показано, что Иммуномакс переводит макрофаги мыши из состояния МО и М2 в М1 (для определения фенотипа использовали данные об экспрессии мРНК генов ARG1 и iNOS). Профилактическое (противовирусное) действие Иммуномакса изучено как на модели инфекции мышей респираторно-синцитиальным вирусом (РСВ), так и на модели обострения бронхиальной астмы на фоне РСВ-инфекции. В эксперименте с вирусиндуцированным обострением бронхиальной астмы выявили достоверное снижение вирусной нагрузки в гомогенатах легких мышей, обработанных Иммуномаксом, а также тенденцию к снижению уровня ^2-зависимых овальбуминспецифических IgGl-антител в сыворотке крови, преобладание М1-фенотипа макрофагов в легких, повышение РСВ-активированных CD4+ Т-клеток, содержащих внутриклеточный IFN-y (Thl-клетки), и одновременно значительное снижение CD4+ клеток, секретирующих внутриклеточный IL-4 (^2-клетки), определенных в селезенках мышей методом ELISPOT через 1.5 месяца после окончания эксперимента. Эти данные свидетельствуют о том, что применение Иммуномакса поляризует иммунный ответ в сторону Th1 и, по-видимому, может быть использовано в качестве средства для профилактики РСВ-инфекции на фоне иммунного ответа аллергического типа.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА бронхиальная астма, респираторно-синцитиальный вирус, макрофаги, PRR, агонист TLR4.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БА - бронхиальная астма; ОРВИ - острые респираторные вирусные инфекции; IL - интерлейкин; РСВ - респираторно-синцитиальный вирус; TLR - Toll-подобные рецепторы; Мф - макрофаги; IFN - интерферон; БАЛ - бронхоальвеолярный лаваж; ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция с детекцией в режиме реального времени; аМф - альвеолярные Мф.
ВВЕДЕНИЕ
Бронхиальная астма (БА) - это заболевание, в основе которого лежит хроническое воспаление дыхательных путей. Воспаление, обуславливающее гиперреактивность бронхов, развивается под влиянием Т-хелперов второго типа (^2-ответ). За последние 15-20 лет заболеваемость БА среди населения Российской Федерации выросла более чем в 3 раза и составила 902.8 на 100000 населения (2007 г.). Обострения БА у детей и взрослых в большинстве случаев ассоциированы с острыми респираторными
вирусными инфекциями (ОРВИ). Некоторые виды вирусов, такие, как респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), риновирусы, метапневмовирус, вирусы гриппа, парагриппа и коронавирусы, детектированы в секретах дыхательных путей в период обострения БА [1]. В связи с этим разработка новых средств профилактики ОРВИ является важной проблемой системы здравоохранения.
Альвеолярные Мф (аМф) - доминантная популяция клеток бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), отличаются способностью приобретать разнообраз-
ные фенотипы в зависимости от сигналов микроокружения (классически активированные М1, альтернативно активированные М2). Регуляторную роль различных фенотипов Мф in vivo активно изучают, но накапливаются данные, свидетельствующие о том, что Мф могут участвовать в патогенезе БА [2,
3].
Среди рецепторов распознавания молекулярных образов патогенов (pathogen pattern recognition receptors, PRR) наиболее изучены Toll-подобные рецепторы (TLR), активация которых необходима для запуска механизмов врожденного иммунного ответа на инфекцию. В связи с этим считается, что агонисты TLR могут использоваться в качестве иммунотерапевтических препаратов или адъюван-тов вакцин для лечения инфекционных заболеваний. Выделенный из проростков картофеля [4] TLR4-агонист Иммуномакс эффективен в отношении целого ряда патогенов как вирусной (папилломавирус, герпесвирус), так и бактериальной природы, а также обладает потенциальной противоопухолевой активностью [5]. Ранее сообщалось, что иммуномодулятор Иммуномакс активирует моноциты, Мф, NK и дендритные клетки [6].
В данной работе изучена роль М2 Мф при воспалении БА, индуцированной вирусными инфекциями, а также возможность искусственного изменения поляризации Мф из М2 в М1 с помощью агонистов TLR с целью повышения эффективности иммунной защиты от РСВ на фоне иммунного ответа аллергического типа.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Поляризация макрофагов мыши посредством препарата Иммуномакс в экспериментах in vitro Макрофаги (Мф), выделенные из костного мозга мыши, помещали в 24-луночные планшеты в концентрации 105 клеток на лунку и в течение 7 дней культивировали в среде, содержащей гранулоци-тарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF). Через 7 дней клетки в течение 24 ч обрабатывали IL-4 для получения М2 Мф, Иммуномаксом - для получения М1 или питательной средой для М0. Через 24 ч после обработки IL-4 среду заменяли на новую с Иммуномаксом для реполяризации М2 в М1, а также добавляли Иммуномакс в МО для реполяризации в М1. Схема эксперимента представлена на рис. 1А. Через 24 ч после обработки лизаты клеток отбирали, замораживали при -80°C и хранили до момента исследования. Далее образцы анализировали методом ПЦР-РВ, определяя при этом уровень мРНК генов iNOS и ARG1 мыши.
Л
Иммуномакс
М2 > М1
iNOS
н
<и
m
о
О. у
' I *
х Е
1% Ф
н у
с о н
0.10 0.080.06 0.040.02 0.00
I
M0 M1 M2 М2 > М1
ARG1
.
у
£ ?
■I*
0.1
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
M0
M1
ИМИ
M2 М2 > М1
Рис.1. TLR4-aroH^T Иммуномакс поляризует макрофаги мыши в М1-фенотип в условиях in vitro. A - дизайн эксперимента; уровень экспрессии мРНК iNOS (Б) и ARG1 (В), оцененный методом ПЦР-РВ и нормированный по уровню мРНК бета-актина
Эксперименты в условиях in vivo Профилактический эффект Иммуномакса in vivo мы оценивали на двух экспериментальных моделях: РСВ-инфекции у мышей и вирус-индуцированно-го обострения БА у мышей. Схема экспериментов представлена на рис. 2А и 2Б соответственно. В ка-
Б
*
*
*
В
*
*
*
А
+Иммуномакс или + Poly (I:C), PBS
I-
+РСВ 5X106 ТЦД50/ мышь
Некропсия, анализ БАЛ и тканей легкого
ФВД
12 13 Дни
0
7
+РСВ
Некропсия,
+OVA и.п. 20 мкг/мышь+2мг/мышь А1(ОН)з
I-1
5x10 ТЦД /мышь анализ БАЛ и тканей легкого и.н5.0
+Иммуномакс или
+OVA 500 мкг/мышь, и.н.
ФВД
+ Poly (I:C), PBS
1 14
28
32
39 41 42 43 44 45 Дни
Б
Рис.2. Схема экспериментов in vivo. А - модель РСВ-инфекции на мышах, Б - модель обострения бронхиальной астмы (БА) на фоне РСВ-инфекции у мышей. PBS - фосфатно-солевой буфер, и.н. - интраназальное введение, ФВД - оценка функции внешнего дыхания, OVA - овальбумин, и.п. - интраперитонеальное введение, БАЛ - бронхоальвеолярный лаваж. Были сформированы следующие экспериментальные группы животных (на модели РСВ-инфекции): 1) РСВ+Иммуномакс (N = 17); 2) РСВ+Poly (I:C) (N = 17); 3) РСВ (N = 17); 4) интакт-ные мыши (N = 17). На модели обострения БА на фоне РСВ-инфекции:1) БА/РСВ+Иммуномакс (N = 17); 2) БА/РСВ+Poly (I:C) (N = 17); 3) БА/РСВ (N = 17); 4) интактные мыши (N = 17)
честве вирусного агента был выбран РСВ штамм А2. В экспериментах использовали самок мышей линии BALB/c массой 18-20 г из питомника «Столбовая», Россия.
В экспериментах были сформированы по четыре группы животных (N = 17) (рис. 2). По восемь мышей из каждой группы использовали для гистологического исследования и ПЦР-анализа. Часть мышей (N = 4) использовали для анализа фенотипов популяций макрофагов в легких (посредством комплексного клеточного анализа бронхиального лаважа и клеточного инфильтрата легких с помощью многопара-метровой проточной цитометрии). Четырех мышей из каждой группы использовали для идентификации количества РСВ-специфических CD4+ Т-клеток, се-кретирующих IFN-y и IL-4, методом ELISPOT через 1.5 месяца после инфекции.
На основании работы Misharin и соавт. [7] для идентификации популяций клеток миелоид-ного ряда мы выбрали следующее сочетание антител - CD11b Brilliant Violet 510™, CD45 AlexaFluor®, Ly-6C PE, CD11cPE/Dazzle™ 594, CD49bPerCP/Cy5.5, Ly-6GPE/Cy7, F4/80APC, I-A/I-EAPC/Cy7. Для сортировки клеток использовали проточный цитометр FACSAria II. Экспрессию мРНК генов iNOS и ARG1 в отсортированных Мф оценивали методом ПЦР-РВ.
С целью оценки противовирусного эффекта агони-стов TLR методом ПЦР-РВ определяли уровень РНК РСВ в лизатах клеток, выделенных из гомогенатов легких.
Для идентификации секретирующих IFN-y и IL-4 РСВ-специфических CD4+ Т-клеток использовали коммерческие наборы Mouse IL-4 ELISPOT Set и Mouse IFN-y ELISPOT Kit (BD Biosciences, США) согласно инструкции производителя.
Статистическую обработку полученных данных проводили при помощи программного обеспечения GraphPad Prism version 4.0. Данные считали статистически значимыми при P < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Мы изучали возможность Иммуномакса, агониста TLR4, переводить макрофаги мыши из состояния М0 и М2 в М1. Фенотип Мф определяли, используя информацию об экспрессии мРНК генов iNOS и ARG1 -маркеров М1- и М2-фенотипов соответственно [8]. Полученные нами данные подтверждают способность Иммуномакса реполяризовать клетки в состояние М1. В частности, в обработанных Иммуномаксом М0 повышается экспрессия iNOS и снижается экспрессия ARG1. Такой же эффект мы наблюдали в М2-клетках, обработанных Иммуномаксом (повы-
И I i
О 0)
£ (5
I- а
о *
h « „
15
10
о а
Д
5.0x10'
I 4.0x10' Û_
£ 3.0x10' ■¿2.0x10' £ 1.0x10' 0
iNOS Р=0.055'
iNOS
а БА/РСВ+Иммуномакс CD БА/РСВ+Poly (I:C)
БА/РСВ о Интактные мыши
20 15 10
ARG1
И
БА/РСВ+Иммуномакс tu БА/РСВ+Poly (I:C) БА/РСВ
Интактные мыши
ARG1
БА
Îo БА БА
Ин _
°g 50 к a.
О ^
0
Е
2.0x10'
БА/РСВ+Иммуномакс СЭБА/РСВ+Poly (I:C) 1.5x10'-БА/РСВ
□ Интактные мыши 1.0x10'-
0.5x10' 0
ratea
РСВ+Иммуномакс РСВ+Poly (I:C) РСВ
Интактные мыши
РСВ+Иммуномакс аРСВ+Poly (I:C) РСВ
Интактные мыши
РСВ+Иммуномакс i-jPCB+Poly (I:C) РСВ
Интактные мыши
Рис. 3. Экспрессия мРНК iNOS (A, Б) и ARG1 (В, Г) в альвеолярных макрофагах мыши. Д, Е - количество вирусной РНК РСВ на 1 г легочной ткани мышей, определенное методом ПЦР-РВ. A, В, Д — модель обострения бронхиальной астмы (БА) на фоне РСВ-инфекции у мышей. Б, Г, Е — модель РСВ-инфекции на мышах
А
Б
5
0
Г
В
*
5
0
шение уровня мРНК гена iNOS и снижение ARG1 (рис. 1Б, В)).
На следующем этапе мы перешли к изучению in vivo профилактического эффекта от применения Иммуномакса как в экспериментах с РСВ-инфекцией у мышей, так и с обострением БА на фоне РСВ-инфекции (рис. 2). В этой серии мы оценивали целый ряд параметров, таких, как функция дыхания, клеточный состав БАЛ, гистологические изменения, уровень сывороточных овальбуминспецифических антител разных классов (IgE, IgG1 и IgG2). Не выявлено статистически значимых различий в величинах этих показателей у животных экспериментальных групп (данные не представлены).
Однако следует отметить, что в эксперименте с БА+РСВ мы выявили тенденцию к снижению уровня овальбуминспецифических IgGl-антител в сыворотке крови мышей, получавших Иммуномакс (данные не представлены). Классическим носителем свойств антител являются ^2-зависимые IgG1-антитела, содержание которых может увеличиваться при аллергических заболеваниях. Снижение под воздействием Иммуномакса уровня IgGl-антител, наблюдаемое в нашем исследовании, по всей видимости, свидетельствует о развитии иммунных реакций по Thl-типу. Интересно, что эти реакции наблюда-
ются на системном уровне, несмотря на интраназаль-ное введение препарата.
Особый интерес представлял фенотип легочных Мф мышей в разных условиях эксперимента, так как мы предполагаем, что при интраназальном введении Иммуномакс действует на клетки этого типа, переводя их в состояние М1. Чтобы проверить эту гипотезу, мы выделяли Мф из легких посредством сортировки на проточном цитометре FACSAria II и оценивали экспрессию мРНК генов iNOS и ARG1. При анализе данных ПЦР-РВ мы отметили тенденцию к повышению уровня iNOS (рис. 3А) и значимое снижение уровня ARG1 (рис. 3В) в Мф мышей с БА, обработанных Иммуномаксом, на фоне РСВ-инфекции. Это указывает на поляризацию Мф в противовирусное М1-состояние. Однако в эксперименте с РСВ-инфекцией у мышей подобной тенденции не выявлено (рис. 3Б,Г).
При оценке вирусной нагрузки отмечено статистически значимое снижение количества вирусной РНК в легких мышей, обработанных Иммуномаксом, по сравнению с группой животных, не получавших лечение (рис. 3Д). Отмечена также тенденция к снижению вирусной нагрузки в группе, обработанной Poly (I : C) - агонистом TLR3. Эти данные получены в эксперименте с вирус-индуцированным обостре-
о-? и о
0) Ь
i И
О -о
ti ! É
А
6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
EZ3 БА/РСВ+Иммуномакс □ БА/PCB+Poly (I:C) БА/РСВ
4) a? 500
(J с
ID 01 5. с 400
? *
2 о у 1 300
a. m
у. 200
4 í
a ¡Ü 100
í 1
0
БА/РСВ+Иммуномакс БА/PCB+Poly (I:C) БА/РСВ
Рис. 4. Количество ^N-7 (А) и ^-4 (Б) продуцирующих CD4+ Т-клеток в селезенках мышей с моделируемым обострением бронхиальной астмы на фоне РСВ-инфекции. Количество РСВ-специфических CD4+ Т-клеток определяли методом ELISPOT (некропсию мышей проводили через 1.5 месяца после окончания эксперимента)
нием БА. Мы выявили также тенденцию к снижению вирусной нагрузки у мышей с РСВ-инфекцией, получавших исследуемый препарат (рис. 3Е).
На рис. 4 представлены результаты выявления РСВ-специфической дифференцировки ТЫ- и ^2-клеток методом ELISPOT. В эксперименте с моделированием обострения БА на фоне РСВ-инфекции мы наблюдали значимое повышение РСВ-активированных CD4+ Т-клеток, секретирую-
щих IFN-y (Thl-клетки) (рис. 4А), и одновременно значительное снижение содержания CD4+ клеток, се-кретирующих IL-4 (№2-клетки) (рис. 4Б) в селезенках мышей, обработанных Иммуномаксом. У мышей с РСВ-инфекцией, обработанных Иммуномаксом, выявлена тенденция к повышению содержания активированных CD4+ Т-клеток, секретирующих IFN-y (Thl-клеток), при этом не обнаружено CD4+ клеток, секретирующих IL-4 (№2-клетки) (данные не представлены).
Таким образом, в ходе экспериментов in vitro и in vivo показано, что агонист TLR4 Иммуномакс способен реполяризовать ^2-ответ в противовирусный Th1. Эффект от применения Иммуномакса наблюдали на модели БА, осложненной РСВ-инфекцией, где у мышей изначально посредством сенсибилизации модельным аллергеном овальбумином формировали выраженный №2-ответ. Главной концепцией в терапии аллергических заболеваний является инверсия иммунного №2-ответа в сторону Th1. Этот подход особенно актуален при ОРВИ у пациентов с БА, так как многочисленные данные свидетельствуют от том, что пациенты с БА переносят ОРВИ в более тяжелой форме [9]. Это связывают с доминирующим №2-ответом, который, возможно, вызван преобладанием в легких больных активированных М2 Мф [3]. В связи с этим, полученные нами данные свидетельствуют о том, что обработка Иммуномаксом, агони-стом TLR4, оказывает влияние на фенотип легочных Мф, поляризуя иммунный ответ в сторону Th1, и поэтому обладает потенциалом для использования в качестве средства для профилактики РСВ-инфекции, в том числе на фоне аллергического типа иммунного ответа.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 16-14-10188).
*
Б
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Царев С.В., Хаитов М.Р. // Рос. мед. журн. 2009. № 2. С. 136-139.
2. Никонова А.А., Хаитов М.Р., Хаитов Р.М. // Мед. иммунология. 2017. Т. 9. № 6. С. 657-672.
3. Melgert B.N., ten Hacken N.H., Rutgers B., Timens W., Postma D.S., Hylkema M.N. // J. Allergy Clin. Immunol. 2011. V. 127. № 3. P. 831-833.
4. Атауллаханов Р.И., Пичугин А.В., Мельникова Т.М., Хаитов Р.М. Патент, RU2013151824A, Россия, A61P 37/02, 2013.
5. Ghochikyan A., Pichugin A., Bagaev A., Davtyan A., Hovakimyan A., Tukhvatulin A., Davtyan H., Shcheblyakov D., Logunov D., Chulkina M., et al. // J. Transl. Med. 2014. V. 29. № 12. P. 322.
6. Bagaev A., Pichugin A., Nelson E.L., Agadjanyan M.G., Ghochikyan A., Ataullakhanov R.I. // J. Immunol. 2018. V. 200. № 8. P. 2656-2669.
7. Misharin A.V., Morales-Nebreda L., Mutlu G.M., Budinger G.R., Perlman H. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2013. V. 49. № 4. P. 503-510.
8. Murray P. J., Wynn T.A. // J. Leukoc. Biol. 2011. V. 89. № 4. P. 557-563.
9. Corne J.M., Marshall C., Smith S., Schreiber J., Sanderson G., Holgate S.T., Johnston S.L. // Lancet. 2002. V. 359. № 9309. P. 831-834.
