CC BY
114
ДЕЙСТВИЕ ИНТЕРФЕРОНОВ И ИНДУКТОРОВ ИНТЕРФЕРОНОВ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ РЕЦЕПТОРОВ TLR/RLR И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ОПУХОЛЕВЫХ ЛИНИЙ
КЛЕТОК ТНР-1 И НСТ-116
Т.М. Соколова1, В.В. Полосков1, О.С. Бурова2, А.Н. Шувалов1, З.А. Соколова2, А.Н. Иншаков2,
Ю.В. Шишкин1, Ф.И. Ершов1
1ФГБУ«ФНИЦэпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России; Россия, 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18; 2 ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478,
Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Татьяна Михайловна Соколова [email protected]
Цель исследования — изучение действия известных препаратов интерферонов (ИФН) 1-го типа и ИФН-индукторов с разной химической структурой на дифференцировку и экспрессию генов паттернраспознающихрецепторов ТЕЯ/ЯЕЯ. Материалы и методы. Линии опухолевых клеток ТНР-1 (острый моноцитарный лейкоз) и НСТ-116 (аденокарцинома толстой кишки) обрабатывалирекомбинантными ИФН 1-го типа (альтевир, реаферон, генфаксон, инфибета 105—106 МЕ), ИФН-ин-дукторами (ридостин 102—103 мкг/мл, циклоферон 625 мкг/мл) и иммуномодулятором (иммуномакс 2 МЕ); препараты добавляли к клеткам на 24 и 96 ч при 37 °С. Экспрессию генов определяли методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией на приборе СЕХ-96, СБ-фенотипы клеток ТНР-1 — методом проточной цитометрии с меченными Е1ТС или РЕмоноклональными антителами. Измерение делали на проточном цитофлуориметре ЕЛСБСаШо II. Результаты. Показано, что линии опухолевых клеток ТНР-1 и НСТ-116 имеют на протяжении 5пассажей низкие и нестабильные уровни экспрессии генов паттернраспознающих рецепторов Т1Б/Я1Я. Такой генный статус, возможно, связан с нарушением процессинга зрелых форм мРНК. В клетках ТНР-1 преимущественно активируются гены ТЕЯ4, ТЕЯ8 и фактор ШЕкЕ, а в клетках НСТ-116 — гены ТЕЯ7, ТЕЯ8, ТЕЯ9 и фактор ШЕкЕ. Наиболее сильным стимулятором ТЕЯ/ЯЕЯ-рецепторов является ридостин.
Ридостин повышает уровень экспрессии маркера макрофагов СБ11Ь, циклоферон и иммуномакс — раннего Т-клеточного антигена СБ7, реаферон — И1Л-БЯ. Препараты циклоферон, иммуномакс, реаферон снижают уровень экспрессии миелоид-ного маркера СБ38.
Выводы. Исследованные препараты ИФН и ИФН-индукторов по-разному регулируют экспрессию генов группы паттернраспознающих рецепторов ТЕЯ/ЯЕЯ в опухолевых линиях клеток ТНР-1 и НСТ-116. В клетках острого моноцитарного лейкоза активация генной активности Т1Я/Я1Я сопровождается изменением СБ-фенотипов дифференцировки.
Ключевые слова: экспрессия генов Т1Я/Я1Я, СБ-фенотип, препараты ИФН и ИФН-индукторов, клетки ТНР-1, НСТ-116
DOI: 10.17650/1726-9784-2016-15-3-28-33
ACTION INTERFERONS AND IFN-INDUCTORS ON TLR/RLRS GENES EXPRESSION AND DIFFERENTIATION OF TUMOR CELL LINES THP-1 AND HCT-116
T.M. Sokolova1, V. V. Poloskov1, O.S. Burova2, A.N. Shuvalov1, Z.A. Sokolova2, A.N. Inshakov2, Yu. V. Shishkin1, F.I. Ershov1
'N. F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology; 18 Gamaleya str., Moscow, 123098, Russia; 2N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; 24 Kashyrskoye shosse, Moscow, 115478, Russia
Objective. To study of known interferons (IFN) type I and IFN-inductors drugs different chemical structure on cell differentiation and expression group of genes of TLR/RLRs, referring to group of pattern-recognition receptors.
Materials and methods. Cellular lines ТНР-1 (acute monocytic leukemia) u HCT-116 (colon adenocarcinoma) were treated by interferons drugs Reaferon, Altevir, Genfakson, Infibeta 105—106 МЕ, IFN-inductors Ridostin 102—103 ^g/ml, Cycloferon 625 ^g/ml and Imunomax 2 МЕ during 24 h or 96 h at 37 V. Gene expression were estimated by method qRT-PCR (CFX-96, Bio-Rad). CD-immuno-phenotypes of THP-1 cells were detected by flow cytometric fluorescence method with FITC and PE monoclonal antibodies (FACSCanto II, Becton Dickinson).
Results. It was shown that tumor cells THP-1 and HCT-116 have low and variable constitutive levels gene expression of TLR-receptors 2, 3, 4, 7, 8, 9 during passages. This gene status may be connected with incorrect processing of mature mRNA forms. Genes TLR4, TLR8 and factor NFkB are stimulated by interferons and IFN-inductors more high in THP-cells and genes TLR7, TLR8, TLR9 and NFkB — in HCT-cells. Ridostin (mix ssRNA and dsRNA S. cerevisiae) is the best activator of TLR/RLRs receptors. Ridostin increases
Оригинальные статьи
29
macrophage marker CD11b, Cycloferon, Imunomax stimulate levels of early T-cell antigen CD7, interferons results in growth of HLA DR. The drugs Cycloferon, Imunomax and Reaferon decrease levels of myeloid suppressor CD38.
Conclusion. Group of recombinant IFNs and IFN-inductor drugs various chemical structures regulate TLR/RLRs genes expression differently in THP-1 and HCT-116. TLR/RLRs genes activation are accompanied by CD-phenotypes changes in THP-1 monocytic cell line.
Key words: TLR/RLRs gene expression, CD-phenotype, interferons, IFN-inductors drugs, human tumor cell lines THP-1 and HCT-116
Введение
У человека известны 10 видов толлподобных рецепторов, которые инициируют клеточные иммунные ответы к разным молекулярным структурам: микробным липопептидам (ТЬЯ1, ТЬЯ2, ТЬЯ6), липополи-сахаридам (ТЬЯ4), флагеллину (ТЬЯ5) и нуклеиновым кислотам (ТЬЯ3, ТЬЯ7, ТЬЯ8, ТЬЯ9) [1]. Последние имеют эндосомальную локализацию. Дополнительно существуют 2 цитоплазматических сенсора ЯЮ1 и МБЛ5 для вирусных и клеточных осРНК и дсРНК. Перечисленные рецепторы являются паттернраспоз-нающими. Они широко представлены в иммуноком-петентных клетках и ткани эпителия. В реализации рецепторных ТЬЯ- и ЯЬЯ-сигналов ключевую роль играет универсальный фактор транскрипции КБкВ — активатор промоторов генов воспалительных цито-кинов [2].
В отношении регуляции транскрипции генов ТЬЯ/ЯЬЯ-рецепторов опухолевых клеток известно крайне мало. В промоторах ТЬЯ-генов имеется нуклео-тидный полиморфизм, ассоциированный с риском развития ряда форм рака [3]. При этом способность ТЬЯ-рецепторов опухолевых клеток к специфическому взаимодействию с химическими структурами лигандов сохраняется.
Роль ТЬЯ/ЯЬЯ-рецепторов в процессах канцерогенеза рассматривается неоднозначно. Их активация может оказывать на развитие опухоли как положительное, так и отрицательное влияние [4]. Клетки лейкозов, меланомы, рака предстательной железы и рака молочной железы имеют повышенное количество рецепторов, которые рассматриваются как маркеры воспаления [5, 6]. В какой мере это свойственно трансформированным клеточным линиям и может регулироваться препаратами интерферонов (ИФН) и лигандами ТЬЯ/ЯЬЯ-рецепторов, остается неизвестным.
ИФН стимулируют транскрипцию сотен клеточных генов, участвующих в антивирусном и пролифера-тивном ответах. В числе ИФН-регулируемых находится группа ТЬЯ-генов [7]. Стимуляция наблюдается в нормальных типах клеток, чувствительных к ИФН. Рекомбинантные ИФН а-2 - наиболее применяемые в противоопухолевой терапии [8]. Исследованные нами препараты ридостин, циклоферон и иммуно-макс сочетают в себе свойства ИФН-индукторов и ТЬЯ-лигандов [9]. Они имеют широкое примене-
ние в медицине как противовирусные и иммуномо-дулирующие средства [10]. Ридостин (смесь дсРНК и осРНК киллерных штаммов грибков Sacharomyces cerevisiae) является агонистом рецепторов TLR3, TLR8 и MDA5. Циклоферон (N-метилглюкаминовая соль акридонуксусной кислоты) взаимодействует с клеточными ДНК и РНК, модифицирует их структуры и делает их «узнаваемыми» TLR3- и TLR9-рецепто-рами. Иммуномакс (растительный пептидогликан) проявляет лигандсвязывающие свойства в отношении TLR4-рецептора; возможно, является активатором и других сигнальных путей [11].
Взаимодействие TLR/RLR-рецепторов со специфическими агонистами активирует процессы апо-птоза, иммунного распознавания и клеточной диф-ференцировки опухолевых клеток [12].
Нами исследована экспрессия генов 6 видов TLR и 2 видов RLR в разных линиях опухолевых клеток: ТНР-1 и HCT-116. Клетки THP-1 (острый моноци-тарный лейкоз) — известная модель in vitro для изучения процессов превращения моноцитов в макрофаги и испытания активности иммунопрепаратов [13]. Представляют интерес анализ CD-фенотипа в этих клетках под действием препаратов и сопоставление его с реакцией генов паттернраспознающих рецепторов TLR/RLR. Клетки НСТ-116 (аденокарцинома толстой кишки) были изучены нами ранее в отношении экспрессии генов системы ИФН и апоптоза; согласно полученным данным они имеют существенные нарушения в регуляции рецепторных механизмов и экспрессии генов системы ИФН [14].
Материалы и методы
Препараты ИФН:
альтевир — субстанция ИФН a-2b, 100 млн МЕ/мл («Фармапарк», Россия);
реаферон — ИФН a-2b, ампула 1 млн ME («Вектор», Россия);
генфаксон — ИФН В-1а, шприц 0,5 мл, содержащий 22 мкг 6 млн МЕ (Laboratorio TUTEUR S.A.C.I.F.I.A., Аргентина);
инфибета — ИФН B-1b, флакон 8 млн МЕ/мл (ЗАО «Генериум», Россия);
ридостин — рибонуклеат натрия, смесь осРНК и дсРНК (~10 %) киллерных штаммов грибков Sacharomyces cerevisiae, ампула 5 мг («Диафарм», Россия);
циклоферон — N-метилглюкаминовая соль акри-донуксусной кислоты, 12,5 % раствор, ампула 2 мл («Полисан», Россия);
иммуномакс — растительный пептидогликан, иммуномодулятор, флакон 200 ЕД («Иммафарма», Россия).
Клетки
НСТ-116 (аденокарцинома толстой кишки из АТСС-коллекции) и THP-1 (острый моноцитарный лейкоз из АТСС-коллекции) были предоставлены лабораторией экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Бло-хина» Минздрава России.
Клетки культивировали в среде RPMI-1640 c 10 % эмбриональной сывороткой телят и антибиотиками. Постановку опытов с препаратами осуществляли в культуральных флаконах 25 см2. Плотность клеток суспензионной культуры ТНР-1 составляла 1 млн/мл. Клетки инкубировали с препаратами ИФН 24 ч при 37 °С в опытах по определению экспрессии генов методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ—ПЦР) и 96 ч при 37 °С в опытах по определению CD-фенотипа методом проточной цитометрии.
Анализ экспрессии генов методом ОТ—ПЦР
в реальном времени
Клетки в количестве 1 млн, промытые 0,1 М фосфатного буфера pH 7,2, лизировали реагентом Trizol (Invitrogen, США) согласно инструкции производителя и замораживали при —20 °С. Выделенную суммарную ДНК/РНК осаждали изопропанолом и обрабатывали ДНКазой из набора «DNA-free» (Ambion, США). В реакции ОТ с праймерами oligo (dT) 15 или «случайными» (random) получали кДНК. Использовали реактивы (фермент MMuLV, RNAsin, 4 вида dNTP) (Promega (США). В количественной ПЦР анализировали кДНК в разведении 1:5. Добавляли пары специфических праймеров и 2-кратную смесь SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, США). Структуры праймеров на исследованные гены рецепторов TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, TLR9 описаны нами ранее [9, 11, 14]. Дополнительно в программе Primer 3 Blast были рассчитаны пары праймеров к мРНК TLR2: прямой 5'— tgcctggccctctctacaaa и обратный 5'— gt-gtcttgggaatgcagcct. ПЦР ставили на приборе CFX-96 (Bio-Rad, США) в режиме реального времени. Протокол ПЦР: 96 °С 2 мин, далее 55 циклов — 94 °С 10 с, 50—54 °С 20 с, 72 °С 30 с. Пороговые циклы (Cq) логарифмической фазы синтеза регистрировали по нарастанию флуоресцентного сигнала красителя EvaGreen, интеркалирующего в ДНК. Анализ экспрессии генов выполняли с помощью программы Date analysis CFX-96. В конечной точке ПЦР по тем-
пературным пикам плавления устанавливали специфичность ДНК-амплификатов, которые анализировали электрофорезом в 1,5 % агарозном геле с бромистым этидием. В отдельных случаях ДНК-ам-плификаты подвергали секвенированию. В программе Bioedit устанавливали гомологию их первичных структур с имеющимися в GenBank NCBI данными транскриптов мРНК.
Иммуноцитофлуометрическое определение
CD-антигенов
Ставили реакцию иммунофлуоресценции с меченными FITC или PE моноклональными антителами и проводили измерение на проточном цитофлуо-риметре FACSCanto II (Becton Dickinson, США).
Результаты и обсуждение
Экспрессия TLR-генов
TLR/RLR-рецепторы — важные пусковые регуляторы клеточного иммунного ответа. Показано, что активность TLR-рецепторов влияет на рост опухолей и их метастазирование [4]. Сегодня роль иммунных рецепторов рассматривается в более широком плане и включает процессы клеточной дифференци-ровки [12, 15]. Молекулярные механизмы гематологических заболеваний связаны с функциональным состоянием сигнальных путей иммунного ответа. Комбинация TLR-лигандов с препаратами ИФН оказывает синергичные эффекты на сигнальные клеточные реакции [12].
В табл. 1 представлены конститутивные уровни транскрипции генов рецепторов TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, TLR9, фактора NFkB и 18S рибосо-
Таблица 1. Сравнение конститутивной транскрипционной активности генов ТЬЯ-рецепторов и фактора ЫНкВ в культурах опухолевых клеток и цельной крови здоровых доноров
Гены/ мРНК Специфический ПЦР-продукт Клетки
крови* Cq ТНР-1 Cq* НСТ-116 Cq*
TLR2 224 пн, 79 °С 30 37* 42*
TLR3 149 пн, 79 °С 34 > 45 > 45*
TLR4 177 пн, 86 °С 25 37* > 45*
TLR7 150 пн, 80 °С 33 > 45 > 45
TLR8 133 пн, 80 °С 25 37 38
TLR9 231 пн, 88 °С 35 > 45 > 45
NFkB 113 пн, 78 °С 27 37* 40*
рибРНК 151 пн, 82 °С 20 27 28
Примечание. Сд — пороговые циклы амплификации. 'Культура клеток цельной крови здоровых доноров. * Дополнительные ПЦР-продукты.
Оригинальные статьи 31
мальной РНК в культурах клетках ТНР-1 и НСТ-116. Для сравнения приведены данные определения уровней экспрессии 18S рибосомальной РНК и мРНК TLR-генов в культуре клеток цельной крови здоровых доноров — модели, наиболее приближенной к норме иммунного ответа in vitro [11]. Видно, что в 2 типах опухолевых клеток уровни экспрессии исследованных генов значительно ниже, чем в клетках крови. При этом разница Cq между 18S рибосомальной РНК и мРНК TLR-рецепторов и фактора транскрипции NFkB больше в опухолевых клетках. Практически не выявляемыми на протяжении 45 циклов и более амплификации в обоих типах клеток оказались транскрипты генов рецепторов TLR3, TLR7, TLR9 и, дополнительно, TLR4 в клетках НСТ-116. Все эти рецепторы важны для противовирусного иммунитета и инициируют сигнальные пути, ведущие к синтезу ИФН [1, 9, 12]. Экспрессия генов ре-
ТНР-1 Рид Иммун К
Инф Цикл М
TLR4 224 пн
NFkB 113 пн
TLR8 133 пн
300
150 300 150 50
300
150 50
Рис. 1. Электрофорез ПЦР-продуктов генов ТЬЯ4, ЫЕкЕ, ТЬЯ8 клеток ТНР-1, стимулированных препаратамиридостин (Рид), иммуно-макс (Иммун), инфибета (Инф), циклоферон (Цикл). Дозы препаратов: ридостин — 1000мкг/мл, иммуномакс — 2 МЕ/мл, инфибета — 1 МЕ/мл, циклоферон — 625 мкг/мл. М — ДНК-маркеры с известными размерами пар нуклеотидов. Слева — название генов и размеры специфических ПЦР-продуктов
цепторов ТЬЯ2 и ТЬЯ4, а также фактора КБкБ была выше в клетках острого моноцитарного лейкоза ТНР-1. Ген рецептора ТЬЯ8 был активным в обоих типах опухолевых клеток (см. табл. 1). Между клеточными линиями выявлены определенные различия в конститутивной регуляции транскрипции рецеп-торных генов, которые, возможно, отражают индивидуальные особенности источников получения клеток.
Данные электрофореза ПЦР-продуктов в агарозных гелях, представленные на рис. 1 и 2, демонстрируют наряду со специфическими ДНК-амплификатами появление в опухолевых линиях ДНК-амплификатов меньшего размера. Следует отметить нестабильную транскрипционную активность исследованных генов в пассажах опухолевых клеток. Стимулирующий эффект препаратов ИФН и ИФН-индукторов в опухолевых клетках был выше при низком или не выявляемом уровне экспрессии ТЬЯ-генов. Препараты ИФН и индукторов ИФН были эффективными в высоких дозах (генфаксон и инфибета 105—106 МЕ, ридостин 102—103 мкг/мл, циклоферон 625 мкг/мл, иммуномакс 2 МЕ). Они индуцировали в клетках ТНР-1 и НСТ-116 синтез специфических ПЦР-продуктов. При этом в клетках ТНР-1 ридостин, циклоферон, инфибета и иммуномакс сильнее активировали гены ТЬЯ4, ТЬЯ8 и КБкБ. В клетках НСТ-116 реакция генов рецепторов ТЬЯ7, ТЬЯ8, ТЬЯ9 и КБкБ на препараты также была положительной, но менее выраженной (см. рис. 2). Низкая и нестабильная активность рецепторных генов в пассажах этих опухолевых линий клеток, по-видимому, согласуется с другими известными нарушениями в рецепторных свойствах [15]. Обнаружение в составе ПЦР-продуктов опухолевых клеток наряду со специфическими дополнительных ДНК-амплификатов меньшего размера дает основание предполагать нарушения в образовании
К Генф Рид
М
TLR7 150 пн
TLR8 133 пн
НСТ
300
150 50
300
150 50
К Иммун М
NFkB 113 пн
Реаф
TLR9 231 пн
М
300
150 50
300 150 50
Рис. 2. Электрофорез ПЦР-продуктов генов ТЬЯ7, ТЬЯ8, ЫЕкЕ, ТЬЯ9 клеток НСТ-116, стимулированных препаратами генфаксон (Генф), ридостин (Рид), иммуномакс (Иммун), реаферон (Реаф). Дозы препаратов: генфаксон — 1 МЕ/мл, ридостин — 1000мкг/мл, иммуномакс — 2 МЕ/мл, реаферон — 1 МЕ/мл. М—ДНК-маркеры с известными размерами пар нуклеотидов. Слева название генов и размеры специфических ПЦР-продуктов.
К
К
зрелых форм мРНК. Такие аномальные ПЦР-про-дукты отсутствовали в пробах мРНК ТЬЯ/ЯЬЯ генов клеток крови здоровых доноров при использовании тех же пар праймеров [9, 11].
Действие ридостина изучено более подробно. Препарат по химической структуре представляет собой смесь осРНК и дсРНК грибков Заскагошусвз сегеу1ъ1а и является ИФН-индуктором и стимулятором транскрипции фактора КБкБ. Ридостин — активатор транскрипции генов иммунных рецепторов ТЬЯ3, ТЬЯ8 в эндосомах и в цитоплазме (МБЛ5) [9]. В опухолевых клетках ТНР-1 и НСТ-116 препарат показал себя эффективным стимулятором этих рецеп-торных генов (табл. 2). В клетках моноцитарного лейкоза ТНР-1 препарат индуцировал широкий спектр генов рецепторов ТЬЯ2, ТЬЯ4, ТЬЯ8, КЮ1, МБЛ5 и фактор транскрипции КБкБ, не активированным оставался только ген рецептора ТЬЯ3. В клетках аденокарциномы толстой кишки НСТ-116 ридостин также оказывал стимулирующее действие на широкий спектр генов, но эффект был несколько слабее. В составе активированных генов в этом случае был ген рецептора ТЬЯ3, но отсутствовал ген рецептора ТЬЯ9. Таким образом, в 2 линиях клеток разных типов опухолей имелись определенные различия — как в конститутивных, так и в индуцированных спектрах ТЬЯ-генов. Тем не менее исследованные препараты ИФН и ИФН-индукторов в опухолевых клетках являлись активаторами иммунных рецепторов на транскрипционном уровне.
Таблица 2. Стимулирующее действие ридостина на экспрессию генов паттернраспознающихрецепторов ТЬЯ/ЖЬЯ в клетках ТНР-1 и НСТ-116
Гены/мРНК THP-1 Cq* HCT-116 Cq*
Контроль Ридостин Контроль Ридостин
TLR2 39 34| 43 42
TLR3 > 45 > 45 > 45 42t
TLR4 40 33T > 45 39t
TLR7 > 45 43 > 45 38t
TLR8 40 34| 45 36t
TLR9 42 40 > 45 > 45
RIG1 > 45 38t 42 37t
MDA5 45 34| 40 38t
NFkB 43 35t 43 41
Примечание. *Сд — пороговый цикл амплификации. Представлены результаты 5-го пассажа клеток. Дополнительно исследованы клетки 3-го и 10-го пассажей. Различия в Сд исследованных генов имели подобную закономерность. Стандартная ошибка повторных измерений ПЦР ЗБ ± 1Сд.
Таким образом, впервые показано стимулирующее действие группы препаратов ИФН (реаферон, инфибета, генфаксон), ИФН-индукторов (ридостин и циклоферон) и иммуномодулятора иммуномакс в опухолевых линиях клеток ТНР-1 и НСТ-116 на гены паттернраспознающих рецепторов. Позитивная регуляция транскрипции ТЬЯ/КЬЯ-генов демонстрирует возможность коррекции ими нарушений сигнальных механизмов иммунного ответа в опухолевых клетках ТНР-1 и НСТ-116.
Характеристика CD-фенотипа
клеток ТНР-1
Анализ СБ-антигенов на поверхности клеток ТНР-1 характеризует их как полиморфную популяцию (табл. 3). В ее составе доминируют (70—90 %) СБ3-, СБ5-, СБ13 -, СБ14 -, СБ23 -, СБ45-лимфоциты и моноциты. Популяция имеет низкое содержание клеток с фенотипом СБ11Ь дифференцированных макрофагов и комплекса НЬЛ-БЯ. В то же время в популяции выявляются клетки СБ38+, свойственные моноцитарному лейкозу.
Под действием реаферона, циклоферона и имму-номакса уровень экспрессии миелоидного антигена
Таблица 3. Влияние исследуемых препаратов на СБ-кластеры дифференцировки клеток ТНР-1
Иммуно-фенотип Контроль Реаферон Ридостин Цикло-ферон Иммуно-макс
CD3+ 85 85 92 91 94
CD5+ 98 94 98 96 87
CD7+ 66 62 77 76 80
CD13+ 86 82 92 89 93
CD14+ 73 71 85 84 85
CD23+ 99 92 96 95 98
CD38+ 74 36 67 28 32
CD45+ 87 81 88 86 93
CD4+ 45 39 58 24 31
CD95+ 30 27 37 14 11
CD8 0 0 0 0,1 0,1
CD11b 2,2 1,1 55 1,0 1,3
CD25 8,0 15 6,4 2,0 11
HLA-DR 2,2 16,3 3,8 2,2 3,5
Примечание. Показатели иммунофенотипов клеток ТНР-1 выражены в % содержания. Подчеркиванием выделены изменения СО. Представлены результаты типичного эксперимента. Средняя стандартная ошибка измерения в 3 независимых исследованиях не превышала 10 %. Достоверность оценивали по критерию Стьюдента прир < 0,05.
Оригинальные статьи
33
CD38 снижается. Антиген CD38 рассматривают как прогностический показатель при Т- и В-лейкозах и мишень для терапии моноклональными антителами [15]. Пока остается неясным, в какой мере снижение его экспрессии связано с активацией генов иммунных TLR/RLR-рецепторов. Для ответа на этот вопрос требуются дополнительные исследования c разными TLR-агонистами и мутантными клетками [12].
Реаферон повышает уровень экспрессии главного комплекса гистосовместимости II класса HLA-DR, эффект ридостина проявляется небольшим ростом числа клеток CD11b+ и CD4+. Иммуномакс, циклоферон и ридостин повышают в составе клеточной популяции уровень CD7+ клеток. Все препараты, кроме ридостина, незначительно снижают содержание CD25+-лимфоцитов, а циклоферон и иммуномакс понижают уровень экспрессии антигена CD95.
Заключение
Эффекты препаратов ИФН и ИФН-индукторов на СБ-антигены показывают их способность изменять процессы клеточной дифференцировки. В дальнейшем необходим поиск более эффективных комбинаций препаратов рекомбинантных ИФН 1-го типа с TLR/RLR-лигандами, которые сегодня уже применяются как специфические агонисты [1, 12]. Более детальный анализ их действия на СБ-фенотипы линий опухолевых клеток позволит подбирать препараты с аддитивными эффектами. Дифференцировка клеток ТНР-1 и НСТ-16 регулируется как на транскрипционном уровне с участием фактора КБкВ, так и на посттранскрипционном (созревание мРНК). В дальнейшем необходимо изучить препарат ридостин, сочетающий свойства ИФН-индуктора и лиганда нескольких рецепторов (^Ю, TLR8, МБА5) на клетках, полученных из образцов опухолей и их микроокружения.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Paul-Clark M.J., George P.M., Catheral T. et al. Pharmacology and therapeutic potential of pattern recognition receptors. Pharmacol Ther 2012;135(2): 200-15. DOI: 10.1016/j.pharmthera. 2012.05.007. PMID: 22627269.
2. Kawai T., Akira S. Signaling to NF-kappaB by toll-like receptors. Trends Mol Med 2007;13(11):460-9. DOI: 10.1016/ j.molmed.2007.09.002. PMID: 18029230.
3. Kutikhin A.G. Association of polymorphisms in TLR genes and in genes
of the toll-like receptors signaling pathway with cancer risk. Hum Immunol 2011;72:1095-116. DOI: 10.1016/j. humimm.2011.07.307. PMID: 21872627.
4. Pandey S., Singh S., Anang V. et al. Pattern recognition receptors in cancer progression and metastasis. Sanjay Cancer Growth Metastasis 2015;8:25-34. DOI: 10.4137/CGM.S24314. PMID: 26279628.
5. Li T.T., Ogino S., Qian Z.R., World J. Toll-like receptor signaling in colorectal cancer: carcinogenesis
to cancer therapy. Gastroenterol 2014;20 (47):17699-708. DOI: 10.3748/ wjg.v20.i47.17699. PMID: 25548469.
6. Cannova J., Breslin S.J. P., Zhang J. Toll-like receptor signaling in hematopoietic
homeostasis and the pathogenesis of hematologic diseases. Front Med 2015;9 (3):288-303. DOI: 10.1007/ s11684-015-0412-0. PMID: 26297301.
7. Khoo J.J., Forster S., Mansell A. Toll-like receptors as interferon-regulated genes and their role in disease. J Inteferon and Cytokine Res 2011;31(1):13-25. DOI: 10.1089/jir.2010.0095. PMID: 21198355.
8. Zitvogel L., Galluzzi L., Kepp O. et al. Type I interferons in anticancer immunity. Nat Rev Immunol 2015;15(7):405-14. DOI: 10.1038/nri3845. PMID: 26027717.
9. Соколова Т.М., Шувалов А.Н., Полосков В.В., Ершов Ф.И. Стимуляция генов сигнальной трансдукции препаратами Ридостин, Циклоферон
и Ингавирин. Цитокины и воспаления 2015;2:26-34.
10. Ершов Ф.И. Антивирусные препараты. Справочник. 2-е изд. М., 2006.
11. Соколова Т.М., Шувалов А.Н., Шаповал И. М. и др. Активация генов сигнальных путей иммунитета: различная индивидуальная чувствительность клеток крови человека к препаратам интерферонов и индукторов ИФН. Медицинская иммунология 2015;1:7-18. DOI: 10.15789/1563-0625-2015-1-7-18.
12. Kaczanowska S., Joseph A.M., Davila E. TLR agonists: our best frenemy in cancer immunotherapy. Cellular & Molecular Immunology 2011;8:341-47. DOI: 10.1189/jlb.1012501.
PMID: 23475577.
13. Chanput W., Mes J.J., Wichers H.J. THP-1 cell line: an in vitro cell model for immune modulation approach. Int Immunopharmacol 2014;23(1):37-45. DOI: 10.1016/j.intimp.2014.08.002. PMID: 25130606.
14. Соколова Т.М., Кособокова Е.Н., Шувалов А. Н. и др. Активность генов системы интерферона в клетках адено-карциномы толстого кишечника НСТ-116: регуляция рекомбинантными интерферонами альфа-2 из бактериальных и растительных продуцентов. Российский биотерапевтический журнал 2013;3:39-44.
15. Nguyen-Pham T-N., Lim M-S., Nguyen T.A. et al. Type I and II interferons enhance dendritic cell maturation and migration capacity by regulating CD38 and CD74 that have synergistic effects with TLR agonists. Cell Mol Immunol 2011;8(4): 341-7. DOI: 10.1038/cmi. 2011.7. PMID: 21423200.
