CC BY
47
Журнал фундаментальной медицины и биологии оригинальные статьи
УДК 616-053.31+616-053.36:612.017.1+619.9
Л.В. Кравченко, А.А. Афонин, М.А. Левкович, М.В. Демидова, А.Ю. Левкович
ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОРОЖДЕННЫХ ДЕТЕЙ С ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии
Цель: изучение костимулирующих молекул CD28, CD40 на лимфоцитах периферической крови у новорожденных с клиническими проявлениями герпесвирусной инфекции.
Материалы и методы: проведено клинико-лабораторное обследование 154 новорожденных с герпесвирусной инфекцией (ЦМВИ инфекция, инфекция, вызванная вирусом простого герпеса, Эпштейна-Барр вирусная инфекция). Контрольную группу составили 15 условно здоровых детей в возрасте до одного месяца, не инфицированных герпесвирусами.
Результаты: проведена сравнительная оценка относительного и абсолютного содержания лимфоцитов с рецепторами СД3+, CD20+, клеток с маркерами костимуляции CD3+CD28+, CD20+CD40+ в периферической крови у новорожденных с герпесвирусной инфекцией. У детей с тяжелой формой ЦМВИ отмечалось достоверное снижение клеток с маркерами активации CD3+CD28+.
Выводы: тяжелая форма ЦМВИ характеризовалось достоверным снижением экспрессии CD3+CD28+ и повышением экспрессии CD20+CD40+ , что явилось одной из причин более тяжелого течения заболевания у пациентов этой группы по сравнению с другими группами больных.
Ключевые слова: новорожденные, герпесвирусная инфекция, лимфоциты.
L.V. Kravchenko, A.A. Afonin, M.A. Levkovich, M.V. Demidova , A.J. Levkovich
IMMUNOLOGICAL CHARACTERISTICS OF NEWBORNS WITH
HERPESVIRUS INFECTION
Rostov Research Institute of Obstetrics and Pediatriss
Purpose: studying of kostimulating molecules CD28, CD40 on the lymphocyte peripheral blood at newborns with clinical displays herpesvirus infection
Materials and Methods: Clinical and laboratory examination of the 154 newborns with herpesvirus infection (cytomegalovirus, herpes simplex virus infections, Epstein-Barr virus infections) were done. Control group consisted of 15 healthy newborns.
Results: It was determined a significant increase a level of of the lymphocyte surface antigen CD3+CD28+, CD20+CD40+ in all groups children. Serious form of the herpesvirus infection was characterized by low level of T-lymphocyte CD3+CD28+ antigen.
Summary: Heavy form cytomegalovirus infection was characterised by authentic decrease in expression CD3+CD28 + and increase of expression CD20+CD40 +, that was one of the reasons of heavier current of disease at patients of this group in comparison with other groups of patients.
Key words: newborns, herpesvirus infections, lymphocyte.
Введение
Актуальность изучения герпесвирусной инфекции обусловлена широкой циркуляцией герпесви-русов в популяции и высокой частотой передачи их от матери к плоду [1,2]. Герпетическая инфекция рассматривается как одна из ведущих причин мерт-ворождаемости, самопроизвольных выкидышей, преждевременных родов, заболеваемости новорож-
денных и младенческой смертности [3,4]. Значимое место в защите новорожденного от герпесвирусной инфекции занимает иммунная система. Достаточно мощным механизмом связывания и нейтрализации герпесвирусов являются противовирусные антитела, генерируемые В-лимфоцитами. Исследование молекулярных основ болезней связано с идентификацией путей передачи клеточных и межклеточных сигналов [5,6]. В настоящее время расшифрованы
76
№ 1 2012
оригинальные статьи
Журнал фундаментальной медицины и биологии
молекулярные основы костимуляции, осуществляемые с участием молекул CD28 и CD 40 [7].
Цель данной работы — изучение костимулиру-ющих молекул CD28 и CD40 на лимфоцитах периферической крови у новорожденных с клиническими проявлениями герпесвирусной инфекции.
Материалы и методы
Изучены иммунологические показатели у 154 новорожденных с герпесвирусной инфекцией (цитомегаловирусная инфекция, инфекция, вызванная вирусом простого герпеса, Эпштейна-Барр вирусная инфекция), находившихся на стационарном лечении в отделении патологии новорожденных ФГУ «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
В зависимости от этиологии заболевания дети были разделены на группы:
1.1 — Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ), типичная генерализованная форма (тяжелая) — 54 человек;
1.2 — ЦМВИ, типичная генерализованная форма с неполной клинической симптоматикой (сред-нетяжелая) — 52 человек.
Вторую группу (2) составили дети с инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа, -22 человека.
Третью группу (3) — дети с Эпштейна-Барр вирусной инфекцией -26 человек.
Во второй и третьей группах заболевание протекало в генерализованной форме.
Контрольную группу составили 15 условно здоровых детей обоего пола в возрасте до одного месяца, не инфицированных герпесвирусами.
Всем детям на первом месяце жизни проводили комплексное клинико-лабораторное обследование, включавшее использование молекуляр-но-биологического (ПЦР) метода определения вируса цитомегалии, вируса простого герпеса, вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ). В качестве материала для исследования пациентов служили периферическая кровь и моча. Использовали набор реагентов производства «АмплиСенс» (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ) и оборудования, включающего многоканальный амплификатор ДНК «Терцик» (производство ДНК-Технология г. Москва) с компьютером и программным обеспечением «Sigma-gel» (Швеция). Определение специфических антител классов IgG и IgM в сыворотке крови к вирусам простого герпеса (HSV I, II), цитомегаловирусу (CMV) проводилось непрямым твердофазным им-муноферментным методом с использованием стандартных наборов реактивов фирмы «Вектор-Бест», г. Новосибирск. Определение антител класса IgM к капсидному антигену (VCA) и IgG к ядерному антигену (EBNA) вируса Эпштейна-Барр (EBV) в сыворотке крови проводилось непрямым твердофазным иммуноферментным методом с использованием стандартных наборов реактивов фирмы "BCM DIAGNOSTIC" (LLC USA). Диагностика герпесвирусной инфекции основывалась на ком-
плексной оценке клинической картины заболевания и результатах лабораторных исследований. Диагноз герпесвирусной инфекции ставился при выявлении ДНК вирусов (вирусы простого герпеса 1, 2, типов, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр) в крови и в моче и нарастании титров специфических антител класса IgG в сыворотке крови к вирусам простого герпеса 1, 2 типов, ЦМВ, ВЭБ в динамике в последующие сроки наблюдения; при наличии специфических антител IgM в сыворотке крови у ребенка либо при выявлении специфических IgG и/или IgM в цереброспинальной жидкости. Содержание лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих СД3+, СД20+, СД28+, СД40+ определяли на проточном лазерном ци-тофлуориметре «Beckman COULTER» Epics XL II (США) с помощью моноклональных антител к кластерам дифференцировки СД3+, СД20+, СД28+, СД40+ фирмы IMMUNOTECH (Франция).
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ «STATISTICA -6». В связи с тем, что распределение данных не подчинялось нормальному закону, для оценки статистической значимости различий между сравниваемыми группами использовался непараметрический критерий Вилкоксона. Для представления результатов использованы медиана и интерквартильный размах. Различия сравниваемых величин признавались статистически достоверными при уровне значимости р<0,05. Пересечение интерквартильных интервалов не говорит об отсутствии достоверных различий сравниваемых групп [8].
Результаты
Проведена сравнительная оценка содержания абсолютного и относительного количества лимфоцитов с маркерами костимуляции СD3+CD28+, CD20+CD40+ в периферической крови на первом месяце жизни у детей с различными формами герпесвирусной инфекции. У детей с тяжелой формой ЦМВИ отмечалось достоверное (p<0,04) снижение относительного количества активированных клеток с маркерами активации CD3+CD28+ (табл. 1) на фоне достоверного снижения CD 28 в общей популяции в сравнении с детьми контрольной группы. Наряду с этим достоверно возрастало (p<0,01) количество CD3+CD28- (табл. 2). Обращает внимание, что только в этой группе уровень CD3-CD28+ оставался на уровне контрольных значений и не снижался как в других группах больных. При среднетяжелой форме ЦМВИ также отмечалось снижение относительного и абсолютного количества лимфоцитов с маркерами костимуляции CD3+CD28+ при снижении количества лимфоцитов, экс-прессирующих CD 28 в общей популяции, при этом не отмечалось возрастания числа Т-лимфоцитов без маркеров костимуляции CD28 (CD3+CD28-). Изменения иммунологических показателей при инфекции, вызванной вирусом простого герпеса, характеризовались достоверным снижением числа лимфоцитов с маркерами кости-муляции CD3+CD28+ и увеличением числа клеток без маркеров костимуляции CD3+CD28-. При иммунологическом обследовании детей с Эпштейна-Барр вирусной инфекцией обнаружено незначительное повышение, в отличие от других групп больных, относительного числа CD3+CD28+.
№ 1 2012
77
Динамика показателей клеточного иммунитета у детей с герпесвирусной инфекцией (СО 28 и СО 3+ СО 28+)
Показатели СО 28 СО 3+ СО 28+
■—^^^ Сроки обследования Группы — 1 мес. 3 мес. 1 мес. 3 мес.
/о 109/л /о 109/л /о 109/л /о 109/л
ЦМВИ, тяжелая форма (1.1) п- 54 Медиана 1,70 (0,64-3,45) ** 0,09 (0,03-0,18) 1,6 (0,20-2,80) 0,07 (0,01-0,15) 50,55 (46,80-60,20) 2,79 (1,70-3,75) 54,20 (27,15-60,20) 1,88 (1,21-3,39)
* 0,0002 0,001 - - 0,04 0,46 - -
Р 1.1.-1.2 0,35 0,37 0,19 0,15 0,01 0,001 0,16 0,07
Р 1.1.-2 0,15 0,12 0,29 0,29 0,37 0,002 0,04 0,11
Р 1.1.-3 0,25 0,22 0,01 0,01 0,41 0,01 0,27 0,008
ЦМВИ, среднетяжелая форма (1.2) п- 52 Медиана 1,70 (0,40-3,59) 0,06 (0,01-0,19) 0,64 (0,14-1,73) 0,03 (0,01-0,09) 52,35 (47,18-59,95) 1,87 (1,67-3,30) 59,15 (47,15-66,03) 1,95 (1,44-2,65)
Р 1.2-2 0,31 0,23 0,39 0,25 0,16 0,31 0,15 0,45
Р 1.2-3 0,45 0,4 0,07 0,15 0,07 0,25 0,15 0,3
* 0,0002 0,0004 0,002 0,0008 - -
Инфекция, вызванная вирусом простого герпеса (2) п- 22 Медиана 0,44 (0,20-0,83) 0,01 (0,01-0,04) 0,35 (0,28-1,25) 0,01 (0,01-0,02) 64,60 (59,10-78,43) 1,96 (1,29-2,23) 60,10 (49,90-69,88) 2,12 (1,73-2,95)
Р 2-3 0,3 0,3 0,11 0,44 0,38 0,15 0,05 0,33
* 0,0001 0,0001 - - 0,03 0,002 - -
Эпштейна-Барр вирусная инфекция (3) п—26 Медиана 0,40 (0,25-1,20) 0,02 (0,01-0,05) 0,75 (0,23-1,00) 0,003 (0,001-0,06) 68,20 (54,50-75,30) 2,59 (1,79-3,46) 61,40 (54,53-67,20) 2,34 (2,00-2,75)
* 0,0001 0,0001 - - 0,03 0,02 - -
Контрольная группа п—15 Медиана 3,70 (2,25-6,60) 0,15 (0,09-0,24) - - 68,10 (42,05-85,50) 2,93 (1,38-3,17) - -
N
^
И
£
"С ¡X
£ §
л &э
Ьа Т
И
О
я<
л Й к с к
I т
о» и о й
о -
3
- достоверность различий показателей от контрольной группы в возрасте 1 месяца; н/д не достоверно; ** - в скобках даны значения 1-3 квартиля; Р - достоверность между группами.
0 §
1 Й"
I
Гн П
Й5
Динамика показателей клеточного иммунитета у детей с герпесвирусной инфекцией СО 3- СО 28+ и СО 3+С028-
Показатели СО 3- СО 28+ СО 3+ СО 28-
^^^^^^^^^ Сроки обследования Группы ^^^^^^^^^ 1 мес. 3 мес. 1 мес. 3 мес.
/о 109/л /о 109/л /о 109/л /о 109/л
ЦМВИ, тяжелая форма (1.1) п=54 Медиана 2,01 (0,34-5,40) ** 0,13 (0,02-0,35) 1,80 (0,40-9,20) 0,10 (0,02-0,70) 6,70 (2,87-22,45) 0,49 (0,15-1,41) 6,65 (1,75-14,05) 0,31 (0,08-1,11)
* 0,28 0,16 - - 0,01 0,0001 - -
Р 1.1.-1.2 0,0001 0,0001 0,01 0,0008 0,0002 0,0001 0,003 0,001
Р 1.1.-2 0,0001 0,0001 0,004 0,004 0,0002 0,0001 0,13 0,008
Р 1.1.-3 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001
ЦМВИ, среднетяжелая форма (1.2) п=52 Медиана 1,00 (0,49-5,13) 0,08 (0,02-0,37) 1,00 (0,20-10,23) 0,05 (0,01-0,21) 5,35 (3,38-10,,3) 0,27 (0,12-0,42) 6,00 (1,75-11,90) 0,19 (0,07-0,56)
Р 1.2-2 0,15 0,15 0,47 0,48 0,26 0,21 0,19 0,3
Р 1.2-3 0,42 0,40 0,04 0,09 0,24 0,39 0,002 0,001
* 0,0002 0,0009 - - 0,1 0,19 - -
Инфекция, вызванная в. простого герпеса(2) п=22 Медиана 0,25 (0,16-0,61) 0,01 (0,001-0,003) 0,90 (0,25-1,48) 0,05 (0,03-0,09) 4,50 (2,93-6,93) 0,13 (0,06-0,19) 7,05 (3,63-10,70) 0,28 (0,11-1,57)
Р 2-3 0,14 0,11 0,14 0,14 0,45 н/д0,37 0,0003 0,02
* 0,0001 0,0001 - - 0,04 0,05 - -
Эпштейна-Барр вирусная инфекция (3) п=26 Медиана 0,70 (0,25-2,70) 0,03 (0,01-0,07) 1,12 (0,71-1,96) 0,04 (0,03-0,08) 2,19 (1,20-5,20) 0,15 (0,04-0,36) 2,09 (1,30-4,33) 0,10 (0,04-0,17)
* 0,0001 0,0001 - - 0,01 0,07 - -
Контрольная группа п=15 Медиана 4,20 (2,40-8,70) 0,22 (0,09-0,66) - - 3,10 (1,50-7,80) 0,012 (0,04-0,22) - -
Й5
3
1 й-1
£ £
Гн П
I
э-
Й5
N
^
И
£
Ьа £
"С
к
£ §
Л
&э
Ьа Т
И
О
я<
л Й к с
- достоверность различий показателей от контрольной группы в возрасте 1 месяца; ** - в скобках даны значения 1-3 квартиля; Р - достоверность между группами.
т
И о» и о й
о -
3
Динамика показателей гуморального звена иммунной системы у детей с герпесвирусной инфекцией (СО 40+,СО 20+С0 40+ )
Показатели СО 40+ СО 20+ СО 40+
Сроки обследования 1 мес. 3 мес. 1 мес. 3 мес.
Группы
/о 109/л /о 109/л /о 109/л /о 109/л
ЦМВИ, тяжелая форма (1.1) п-54 Медиана 0,90 (0,26-1,56) ** 0,05 (0,02-0,11) 0,80 (0,21-1,90) 0,04 (0,01-0,14) 18,20 (10,60-27,95) ** 0,85 (0,52-1,24) 16,00 (3,80-27,20) 0,75 (0,21-1,58)
* 0,006 0,005 - - 0,0001 0,0001 - -
Р 1.1.-1.2 0,09 0,25 0,37 0,11 0,001 0,0007 0,38 0,009
Р 1.1.-2 0,11 0,18 0,44 0,28 0,0001 0,0001 0,37 0,05
Р 1.1.-3 0,23 0,35 0,018 0,018 0,0001 0,0001 0,0004 0,0001
ЦМВИ, среднетяжелая форма (1.2) Медиана 0,40 (0,13-0,84) 0,03 (0,01-0,07) 0,63 (0,20-0,92) 0,01 (0,0001-0,07) 18,30 (11,85-23,60) 0,66 (0,32-1,36) 18,95 (10,25-28,00) 0,52 (0,42-1,13)
Р 1.2-2 0,49 0,38 0,45 0,38 0,22 0,19 0,48 0,48
п-52 Р 1.2-3 0,30 0,35 0,04 0,19 0,22 0,27 0,0006 0,005
* 0,0003 0,0006 - - 0,0003 0,0001 - -
Инфекция, вызванная в. простого герпеса(2) п-22 Медиана 0,35 (0,20-0,73) 0,01 (0,01-0,02) 0,58 (0,38-0,63) 0,02 (0,01-0,04) 10,95 (6,88-13,05) 0,32 (0,24-0,38) 15,05 (9,88-26,05) 0,82 (0,30-1,13)
Р 2-3 0,28 0,25 0,03 0,14 0,42 0,32 0,001 0,08
* 0,001 0,001 - - 0,14 0,06 - -
Эпштейна-Барр вирусная инфекция (3)п—26 Медиана 0,40 (0,20-0,82) 0,03 (0,01-0,06) 0,40 (0,22-1,28) 0,02 (0,01-0,05) 7,20 (4,86-14,20) 0,32 (0,15-0,44) 14,00 (8,55-23,05) 0,51 (0,26-0,81)
* 0,0006 0,0006 - - 0,18 0,09 - -
Контрольная группа п-15 Медиана 1,27 (0,30-5,80) 0,06 (0,01-0,22) - - 5,90 (3,15-11,45) 0,22 (0,11-0,38) - -
N
^
И
£
Ьа £
"С
к
й
£ §
Л
&э
Ьа Т
И
О
я<
л Й к с к
I т
о» и о й
о -
3
- достоверность различий показателей от контрольной группы в возрасте 1 месяца; н/д - не достоверно; ** - в скобках даны значения 1-3 квартиля; р - достоверность между группами.
0 §
1 Й"
I
Гн П
Й5
оригинальные статьи
Журнал фундаментальной медицины и биологии
В наших исследованиях с целью более глубокого понимания нарушений в гуморальном звене иммунитета было проведено определения молекул CD 40 на В-лимфоцитах (табл. 3). Полученные данные сравнивались с данными контрольной группы и между клиническими группами. При этом в группе детей с ЦМВИ, генерализованной формой, в сравнении с пациентами других групп, необходимо отметить достоверное увеличение активированных лимфоцитов с маркерами костимуляции CD20+CD40+. В группах детей с Эпштейна-Барр-вирусной инфекцией и инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса, уровень лимфоцитов с маркерами CD20+CD40+ был сопоставим с контрольными значениями.
Обсуждение
Таким образом, при ЦМВИ в тяжелой форме отмечался более высокий, чем в других группах больных, уровень абсолютного и относительного количества лимфоцитов без маркеров костимуля-ции СD3+CD28- и более выраженное снижение числа клеток с маркерами CD3+CD28+, через которые проводятся в клетку костимулирующие сигналы, необходимые для активации Т-хелперов, что вызывает угнетение клеточного звена иммунитета на внедрения патогена. Это являлось одной из причин более тяжелого течения заболевания у пациентов этой группы по сравнению с другими группами больных. Высокая значимость опреде-
ления повышенного содержания В-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности рецепторы CD 40 - (CD20+CD40+), отражает также важность прямого контакта между Т- и В-клетка-ми, которые осуществляются через эту молекулу. Сигнал, возникающий в результате участия клеток CD20+CD40+, является основным костимулирую-щим сигналом при включении ответа В-лимфоци-тов. Как и при взаимодействии антигенпредставля-ющей клетки с Т-хелперами, при Т-В кооперации имеется двусторонняя направленность сигналов, однако преобладающее направление их в этом случае происходит от Т к В клетке, поскольку при этом активируется В-лимфоцит.
Выводы
1. Развитие герпесвирусной инфекции у детей обусловлено нарушением в Т-клеточном (снижениеCD3+CD28+) и в В-клеточном (увеличение CD20+CD40+) звеньях иммунной системы.
2. Тяжелая форма ЦМВИ характеризуется достоверно более выраженным снижением экспрессииCD3+CD28+ и увеличением CD20+CD40+.
3. В группе детей с инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса, и с Эпштейна-Барр вирусной инфекцией число клеток с маркерами CD20+CD40+ не отличается от контрольных значений.
1. Орджоникидзе Н.В., Агаронян Н.Г. Современные ты внутриутробной инфекции. Журнал Российского общества акушеров-гинекологов. 2005; 1: 8 - 12.
2. Сенчук А.Я., Дубоссарская З.М. (ред.) Перинатальные инфекции / под ред. А.Я. Сенчука, З.М. Дубоссарской. -М.: Медицинское информационное агентство, 2005. -318 с.
3. Володин Н.Н (ред.) Неонатология: национальное руководство / под ред. Н.Н. Володина. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 848 с.
4. Бочарова И.И., Аксенов А.Н., Башкин Н.Ф. и др. Итоги и перспективы научных исследований по проблеме внутриутробной инфекции новорожденных. Российский вестник акушера-гинеколога. 2007; 5: 60 - 63.
Р.М., Манько В.М. Физиологические особенности активации и торможения функций клеток иммунной системы. Рецепторные структуры и внутриклеточные сигнальные пути макрофагов и естественных клеток-киллеров. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2006; 92(6): 662 - 667.
6. Gaytant M.A., Rours G.I. , Steegers E.A. et al Congenital cytomegalovirus infection after recurrent infection: case reports and review of the literature. Eur. J. Pediatr. 2003; 162(34): 248 - 253.
7. Рабсон А, Ройт. А., Далвз П. Основы медицинской иммунологии - М. : Бином, 2006. - 320 с.
8. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA -М. : МедиаСфера, 2002.- 312 с..
ЛИТЕРАТУРА
аспек- 5. Хаитов
№ 1 2012
81
