CC BY
57
УДК 577.852.11
Е.В. Кравец, С.В. Лукьянова, О.В. Юрьева, В.И. Дубровина, О.Б. Колесникова, К.Ю. Козулина,
А.В. Корнева, Н.М. Андреевская
ИММУНО- И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСТРАКТА ПОВЕРХНОСТНЫХ АНТИГЕНОВ BACILLUS ANTHRACIS СТИ-1
Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока (Иркутск)
Получен экстракт антигенов Bacillus anthrncis СТИ-1, изучены его иммуно- и физико-химические свойства. В реакции диффузионной преципитации, экстракт, образует, линию с сывороткой, полученной при. иммунизации кроликов экстрактом, антигенов, поливалентной сибиреязвенной сывороткой и. с иммуноглобулином, к антигену ЕА-1. Электрофоретический анализ экстракта показал, что преобладающим, его компонентом, является, полипептид с молекулярной массой 97 кДа.
Ключевые слова: Bacillus anthracis, S-слой, белки Sap и ЕА-1
IMMUNO- AND PHYSICAL-CHEMICAL CHARACTERIZATION OF BACILLUS ANTHRACIS STI-1 SURFACE ANTIGEN EXTRACT
E.V. Kravets, S.V. Lukyanova, O.V. Yurteva, V.I. Dubrovina, O.B. Kolesnikova,
K.Yu. Kosulina, A.V. Korneva, N.M. Andreevskaya
Irkutsk Antiplague Research Institute for Siberia and Far East, Irkutsk
The extract of Bacillus anthracis STI-1 antigens is prepared; its immuno- and physical-chemical properties are studied. In diffusion precipitation reaction the extract forms a line of precipitation with the serum, obtained, after immunization of rabbits with antigen extracts, polyvalent anthrax serum, and. immunoglobulin, to antibody to ЕА-1antigen. Electrophoretic analysis of this extract indicated that its prevailing component is a polypeptide of B. anthracis surface structures.
Key words: Bacillus anthracis, S-layer, Sap, ЕА-1 proteins
Сибирская язва, являющаяся особо опасным инфекционным заболеванием людей и животных, остается важной проблемой для здравоохранения и ветеринарии. Потенциальная возможность заражения человека Bacillus anthracis поддерживается не только периодически возникающими эпизоотиями болезни, но и существованием множественных почвенных очагов, распространенных на всех континентах и не регистрирующихся лишь на немногих островных территориях [8].
Необходимость изучения этой особо опасной инфекции связана еще и с тем, что B. anthracis остается в списке объектов бактериологического оружия и средств биологического терроризма [14].
Известно, что существенная роль в формировании противобактериального иммунитета к сибирской язве принадлежит поверхностным антигенам бактериальной клетки. Установлено, что белки S-слоя B. anthracis обладают протектив-ным потенциалом и их можно использовать как дополнительные иммуногенные компоненты, а также в диагностических целях [1, 2, 6, 7]. Ранее нами установлено, что экстракт поверхностных антигенов обладает протективной активностью и способностью повышать неспецифические факторы иммунитета [4].
Очевидно, что выделение сибиреязвенных антигенов, изучение их иммуногенных и физикохимических свойств позволит полнее оценить роль отдельных антигенных компонентов микробной клетки в процессе формирования иммунитета.
Целью работы явилось изучение иммуно- и физико-химических свойств экстракта поверхностных антигенов B. anthmcis СТИ-1.
МЕТОДЫ
При выполнении работы использовали вирулентный штамм B. anthracis И-9, содержащий рХО1+/рХО2+ (музей живых культур Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока), ЛД50 для белых мышей — 50 спор и вакцинный бескапсуль-ный штамм B. anthracis СТИ-1 (рХО1+/рХО2‘), полученный из Государственного института стандартизации и качества им. Л.А. Тарасевича.
Микробную массу штамма B. anthracis СТИ-1 выращивали на пластинах агара Хоттингера или казеиново-дрожжевого агара (рН 7,2) (Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока) при температуре 37 ± 1 °С в течение 18 часов. Затем культуру смывали 0,9% раствором хлористого натрия, центрифугировали в течение 15 мин при 2000 об./мин, осадок трехкратно отмывали тем же раствором. Для увеличения выхода бактериальной массы (в 1,5 раза) использовали метод повторного подращивания на агаровых пластинах.
Получение экстракта поверхностных антигенов сибиреязвенного микроба проводили по методике И.А. Барковой [1, 2] в нашей модификации.
В связи с тем, что белок ЕА-1 прочно связан с клеточной стенкой, антигены экстрагировали
лизирующем буфером pH 9,8, состоящим из 5 мМ трис-гидрохлорида, 5 мМ 2-меркаптоэтанола, 1% додецилсульфата натрия (ДСН) [1, 7]. Лизирую-щую смесь добавляли из расчета 10 мкл на 1 мг осадка, инкубировали при 70 °С на водяной бане в течение 30 мин. Полученный экстракт антигенов B. anthracis СТИ-1 диализовали при 4 ± 1 °С в полиэтиленовых мешках с порами, пропускающими биополимеры с молекулярно массой (м.м.) 1 — 10 кДа в соотношении с внешним раствором 1 : 200 (объем/ объем). В качестве внешнего раствора использовали проточную воду.
Для контроля специфической стерильности полученный экстракт антигенов B. anthracis СТИ-1 высевали на агар Хоттингера, инкубировали 48 часов в термостате при 37 ± 1 °С согласно методическим указаниям [5]. Специфически стерильный препарат лиофильно высушивали и хранили при -20 ± 1 °С.
Антигенную активность полученного экстракта B. anthracis СТИ-1 оценивали в реакции диффузионный преципитации (РДП) в 1% агаровом геле с иммуноглобулином к экстрагируемому антигену ЕА-1 сибиреязвенного микроба (Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока), сывороткой, отобранной при иммунизации кроликов полученным экстрактом антигенов B. anthracis СТИ-1 и сывороткой сибиреязвенной преципитирующей (Россия, 48 ЦНИИ Мин. обороны РФ, г. Киров) по методу
O. Ouchterlony [11].
Электрофоретический анализ при изучении белков экстракта проводили в блоках 12% полиакриламидного геля (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) по методу U.K. Laemmli и M. Favre [10], сила тока составляла 25 мА, время прохождения 80 минут. После проведения электрофореза гель фиксировали в 20% трихлоруксусной кислоте, окрашивали ярко-синим красителем Coo-massie R-250 [9]. В качестве эталонов молекулярной массы использовали наборы белков — SDS-PADE molecular weight standards, Broad range, фирмы Bio-Rad (США). Гели анализировали на гельдо-кументирующей системе Gel Doc XR + Imaging System, Bio-Rad (США), программой ImageLab. Ink, по калибровочной кривой методом регрессии Point-to-Point.
Для получения сыворотки против экстракта антигенов B. anthracis СТИ-1 использовали четырех кроликов (2,0 — 2,5 кг) обоих полов. Животных выводили из эксперимента под наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1997 г. № 755).
Иммунизацию кроликов проводили по схеме: экстракт антигенов B. anthracis СТИ-1 вводили пятикратно с интервалом 7 суток в возрастающих дозах (0,3 — 0,6 — 3,0 — 5,0 мг белка в 0,5 мл физиологического раствора) на инъекцию. Первую иммунизацию проводили в лимфатические узлы, повторную — в подушечки передних лап,
затем препарат вводили внутривенно. Забор крови проводили на 20-е сутки после последней иммунизации.
Обнаружение антигенных фракций в препарате проводили методом иммуноблоттинга с иммуноглобулином к антигену EA-1 сибиреязвенного микроба и антисывороткой к экстракту антигенов B. anthracis СТИ-1 на приборе Hoefer mini VE Vertical Electrophoresis System (Amer-sham Biosciensces) по H. Towbin с соавт. [13] c предварительным разделением в 12% ПAAГ и переносом на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad, OmA).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получен экстракт поверхностных антигенов сибиреязвенного микроба с помощью модифицированного нами метода. Изучены его иммуно- и физико-химические свойства. Показано, что экстракт антигенов B. anthracis СТИ-1 в РДП образовывал линии преципитации со всеми тремя сыворотками, взятыми в эксперимент. Так, титр иммуноглобулина к антигену EA-1 (A) и сывороткой сибиреязвенной преципитирующей (В) к экстракту антигена B. anthracis СТИ-1 составлял 1 : 32, с антисывороткой к полученным экстрактам антигенов
B. anthracis СТИ — 1 (Б) — 1 : 16 (рис. 1). Полученные в ходе эксперимента данные свидетельствуют о специфичности и иммунологической активности исследуемого экстракта.
Рис. 1. Реакция диффузионной преципитации в геле с сыворотками: А - иммуноглобулин к антигену ЕА 1; 1 - экстракт антигенов B. аnthrаcis СТИ-1; 2 - цельная сыворотка; 3 - в разведении 1 : 2; 4 - в разведении 1 : 4; 5 - в разведении 1 : 8; 6 - в разведении 1 : 16; 7 - в разведении 1 : 32. Б - кроличья сыворотка к экстракту антигенов B. anthracis СТИ-1; 1 - экстракт антигенов B. anthracis СТИ-1; 2 - цельная сыворотка; 3 - в разведении 1 : 2; 4 - в разведении 1 :4;5 - в разведении 1 : 8; 6 - в разведении 1 : 16; 7 - в разведении 1 : 32. В - сыворотка сибиреязвенная пре-ципитирующая: 1 - экстракт антигенов B. anthracis СТИ-1; 8 - в разведении 1:10.
Электрофоретический анализ экстракта антигенов B. anthracis СТИ-1 в 12% ПААГ геле показал, что данный препарат является гетерогенным по составу и содержит белки с м.м. 26; 29,9; 38,5; 45,2; 53,1; 63,9; 97,2 кДа. Преобладающим компонентом экстракта является полипептид с м.м. - 97 кДа (рис. 2).
Рис. 2. Электрофореграмма экстракта антигенов B. anthracis СТИ-1. 1 - экстракт антигенов; 2 - маркеры: 200 кДа - миозин, 116 кДа - р-галактозидаза, 97 кДа - фосфорилаза В, 66,2 кДа - бычий сывороточный альбумин, 45 кДа - овальбумин, З1 кДа - карброангидраза, 21,5 кДа - ингибитор трипсина.
Иммуноблотинг с иммуноглобулином к экстрагируемому антигену ЕА-1 сибиреязвенного микроба и антисывороткой кроличьей к экстракту антигенов B. аnthrаcis СТИ-1 выявил одну иммунохимически активную полосу соответствующую молекулярной массе приблизительно 97 кДа (рис. 3).
Рис. 3. Иммуноблотинг экстракта антигенов B. anthracis СТИ-1. 1 - с иммуноглобулином к антигену ЕА 1; 2 - с кроличьей сывороткой к экстракту антигенов B. anthracis СТИ-1.
Резюмируя представленный фактический материал, можно сделать вывод, что полученный с помощью модифицированного нами метода
ИА. Барковой экстракт поверхностных антигенов сибиреязвенного микроба является иммунологически активным.
Для получения гомологичной сыворотки к экстракту антигенов B. anthracis СТИ-1 разработана схема иммунизации кроликов. Установлено, что препарат специфически реагирует в РДП с иммуноглобулином к антигену EA-1, сывороткой сибиреязвенной преципитирующей и антисывороткой к экстракту антигенов B. anthracis СТИ-1.
Электрофоретическое разделение белков экстракта антигенов B. anthracis СТИ-1 показало, что преобладающим компонентом являлся полипептидом с м.м. -97 кДа, который по электрофоретической подвижности сходен с белком EA-1, экстрагированным из клеток B. anthracis СТИ, что может свидетельствовать о принадлежности белков экстракта к антигенам S-слоя (Sap — м.м. 94 кДа и EA-1 — м.м. 100 кДа) [2, 7, 15], антигенные свойства и иммунодиагностическая значимость которых активно изучается в последнее время [6,
7, 12].
Показано преимущественное содержание в экстракте антигенов B. anthracis СТИ-1 белков с м.м. от 22 до 40 кДа. Выявленный нами на электро-фореграмме полипептид с м.м. 30 кДа ранее охарактеризован как антиген поверхностных структур
B. anthracis [3].
С помощью метода иммуноблоттинга подтверждено специфическое взаимодействие экстракта B. anthracis СТИ-1 с гомологичной антисывороткой и иммуноглобулином к антигену EA-1 сибиреязвенного микроба, что свидетельствует о специфичности данного экстракта и наличие в исследуемом препарате антигена EA-1.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баркова ИА. Иммунодиагностическая оценка белков, продуцируемых штаммами Bacillus anthracis с разным профилем плазмид вирулентности: автореф. дис. ... канд. мед. наук. — Волгоград, 2007. - 34 с.
2. Баркова ИА. и др. Продукция белков S-слоя разными штаммами Bacillus anthracis // Проблемы особо опасных инфекций. — 2008. — № 4 (98). —
C. 29 — 32.
3. Безносов М.В. Выделение и изучение специфических антигенов Bacillus anthracis с целью конструирования диагностических и профилактических препаратов: автореф. дис. . канд. биол. наук. — Саратов, 1997. — 22 с.
4. Дубровина В.И. и др. Изучение иммунобиологических свойств экстракта поверхностных антигенов сибиреязвенного микроба // Бюлл. ВСНЦ СО РAМН. — 2010. — № 6, Ч. 1. — С. 164—169.
5. Методические указания по контролю обсе-мененности воздуха и помещений лабораторий, где проводятся работы с вакцинными и вирулентными штаммами сибиреязвенного микроба, а также по контролю специфической стерильности бактериальных препаратов, полученных из штаммов
B. anthracis: метод. рек. — Иркутск, 1987. — С. 4 — 6.
208
пинм iiiiiiiii п 11 и 11 urn □ II і її I iiii □ nIi 111 и
6. Микшис Н.И. и др. Иммуногенность белков S-слоя Bacillus anthracis // Молекулярная медицина и биобезопасность: матер. I Международной конф. — М., 2004. — С. 130—131.
7. Микшис Н.И. и др. Роль компонентов S-слоя в иммуногенности возбудителя сибирской язвы // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 2006. — № 1. — С. 29 — 32.
8. Рязанова А.Г. и др. Эпидемиологическая ситуация по сибирской язве в Российской Федерации: анализ заболеваемости в 2010 г., прогноз на 2011 г. // Проблемы особо опасных инфекций. — 2011. — № 1 (107). — С. 42 — 44.
9. Fairbanks G., Steck T.L., Wallach D.F.H. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane // Biochemistry. — 1971. — Vol. 10, N 13. — P. 2606 — 2617.
10. Laemmli U.K., Favre M. Maturation of the head of bacteriophage T4. I. DNA packaging events // J. Mol. Biol. — 1973. — Vol. 80. — P. 575 — 599.
11. Ouchterlony O. Diffusion-in-gel methods for immunological analysis // Prog. Allergy. — 1962. — Vol. 6. - P. 3-15.
12. Pezard C. et al. Protective immunity induced by Bacillus anthracis toxin-deficient strains // Infect. Immun. - 1995. - Vol. 63. - P. 1369-1372.
13. Towbin H., Stachelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1979. - Vol. 76, N 9. - P. 4350 -4354.
14. Weiss M.M. et al. Anthrax vaccine and public health policy // Public Health. - 2007. - Vol. 97, N 11. - P. 1945-1951.
15. Williams D.D., Turnbough C.L. Surface layer protein EA1 is not a component of Bacillus anthracis spores but is a persistent contaminant in spore preparations // J. Bacteriol. - 2004. - Vol. 186, N 2. -P. 566-569.
Сведения об авторах
Кравец Елена Владимировна - к. б. н., научный сотрудник отдела зоонозных инфекций Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40; e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru)
Лукьянова Светлана Владимировна - м.н.с. лаборатории патофизиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40; e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru)
Юрьева Ольга Викторовна - к.б.н., ст.н.с. лаборатории патофизиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40; e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru)
Дубровина Валентина Ивановна - д.б.н., зав. лабораторией патофизиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40; e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru)
Колесникова Ольга Борисовна - к.б.н., научный сотрудник отдела зоонозных инфекций Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40; e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru)
Козулина Ксения Юрьевна - м.н.с. биохимического отдела Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 2201-40; e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru)
Корнева Александра Владимировна - лаборант-исследователь биохимического отдела Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40; e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru)
Андреевская Нина Михайловна - к.б.н., ст.н.с. научно-производственного отдела Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40; e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru)
