CC BY
28
УДК 571.27+576.32/.36+615.371
В.С. Половинкина, А.В. Корнева, К.Ю. Козулина, Ж.А. Коновалова, В.И. Дубровина,
Е.Ю. Марков, В.Б. Николаев, Т.А. Иванова, М.В. Афанасьев
ВЛИЯНИЕ СУБКЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЙ ЧУМНОГО МИКРОБА НА ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫМИ КЛЕТКАМИ БЕЛЫХ МЫШЕЙ
Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири Дальнего Востока (Иркутск)
Изучено влияние экспериментальных препаратов на основе F1-антиrена, клеточных оболочек (F1+КО) и тотальной ДНК (тДНК) Yersinia pestis, а так же синтетического мурамилдипептида (МДП) на продукцию цитокинов иммунокомпетентными клетками экспериментальных животных. Показано, что исследованные препараты, в сочетании с адъювантами оказывают, стимулирующее действие на синтез медиаторов иммунного ответа. Полученные результаты свидетельствуют о возможности применения F+КО, тДНК Y. pestis в сочетании с МДП для. конструирования химических вакцин. Ключевые слова: FI-антиген, ДНК, мурамилдипептид, цитокины
INFLUENCE OF YERSINIA PESTIS SUBCELLULAR FRACTIONS ON CYTOKINES PRODUCTION IN IMMUNE CELLS OF MURINE
V.S. Polovinkina, A.V. Korneva, K.Yu. Kozulina, Z.A. Konovalova, V.I. Dubrovina,
E.Yu. Markov, V.B. Nikolayev, Т.А. Ivanova, M.V. Afanas ev
Irkutsk Antiplague Research Institute of Siberia and Far East, Irkutsk
The main goal of this study was to determine and compare levels of cytokines in a murine blood plasma samples before and after stimulation by F1-antigen, components of membrane fractions and. total DNA of Yersinia pestis and. synthetic muramyl dipeptide (MDP). We observed significant cytokine produce stimulation, effects for all preparations and. their combinations.
Key words: F1-antigen, DNA, muramyldipeptide, cytokines
ВВЕДЕНИЕ
Чума — особо опасная инфекция, которая в соответствии с Международными медико-санитарными правилами (2005 г.), включена в список инфекционных болезней, способных вызывать чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения, имеющие международное значение (по информации Роспотребнадзора приказ от 08.05.2008 г. № 152). В связи с чем, необходимость надежных и безопасных средств профилактики чумы остается актуальной проблемой здравоохранения [27].
При разработке современных препаратов и вакцин против чумы необходимо учитывать особенности развития инфекции, способность чумного микроба уклоняться от иммунологического надзора организма или подавлять реакцию врожденного иммунитета хозяина [1, 3, 18]. В связи с этим, перспективным направлением специфической профилактики чумы является использование препаратов, несущих так называемые патоген-ас-социированные молекулярные структуры (pathogen associate molecular patterns — PAMPs), которые распознаются специфическими рецепторами — образ распознающими рецепторами (pattern recognition receptors — PRRs), участвующими в активации компонентов врожденного иммунитета [2, 3, 9, 14, 18, 24].
С учетом того, что часть протективных антигенов локализована в поверхностных структурах клеток чумного микроба, ранее нами был получен комплексный препарат, состоящий из Б1-антигена,
клеточных оболочек (КО) Yersinia pestis, которые содержат в своем составе липополисахарид, пепти-догликан и другие PAMPs, который обладал высокой протективной активностью для белых мышей [4, 6, 7,
16, 25]. Адъюванты тДНК и МДП, вошедшие в состав нашего препарата, являются лигандами PRRs: TLRs и NLRs подобных рецепторов [8, 10, 19, 21, 20, 26, 28].
Цели исследования: изучить действие препарата F1+KO Y. pestis EV на продукцию цитокинов разного профиля иммунокомпетентными клетками экспериментальных животных.
МЕТОДИКА
В качестве источника F1-антигена, клеточных оболочек (КО) и ДНК использовали штамм Y. pestis EV НИИЭГ (музей живых культур Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока). F1-антиген и клеточные оболочки получали как описано ранее [4, 6, 16]. Через 72 часа инкубации проводили контроль специфической стерильности. Антигенный комплекс (КО+ F1) получали путем механического смешивания клеточных стенок и F1-антигена Y. pestis EV в соотношении 1 : 1 (по сухому весу) (Патент на изобретение № 2248217 RU, МПК7 A 61 K 39/02, C 12 P 21/00. 2005) [4, 6, 16]. В качестве адъюванта использовали синтетический МДП («Calbiochem», США) и суммарную ДНК, полученную нами из клеток Y. pestis EV по методу, описанному ранее [5].
Опыты проводили на 72 сертифицированных (НПО «Вектор», г. Новосибирск) белых беспород-
П1111111111111111111ПIIIIII 1111ГП □ I I I I I I III □ П11 I I I I I I
217
ных мышах массой 18 — 20 г. Животных выводили из эксперимента в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», Приложение № 4 (2003).
Подопытных животных распределили на восемь групп. Белым мышам шести опытных групп подкожно вводили следующие препараты: КО + F1 (2,5 мкг/0,2 мл забуференного физиологического раствора, ЗФР); тДНК (по 2,5 мкг/0,2 мл ЗФР); МДП (по 2,5 мкг/0,2 мл ЗФР); КО + F1+тДНК (по 2,5 мкг + 2,5 мкг/0,2 мл ЗФР соответственно); КО + F1+МДП (по 2,5 мкг + 2,5 мкг/0,2 мл ЗФР соответственно); КО + F! +тДНК + МДП (по 2,5 мкг + 2,5 мкг + 2,5 мкг/0,2 мл ЗФР соответственно). Контролем служили две группы: К1 — интактные животные, К2 — мышам подкожно вводили ЗФР в объеме 0,2 мл. Забор крови у экспериментальных животных всех групп осуществлялся на 3-е, 7-е и 21-е сутки, после инокуляции препаратов. Плазму крови получали центрифугированием при 13000 об./мин при 4 °С в течение 10 мин.
Содержание IL-1a, IL-ф, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-
10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-15 , IL-18, TNFa, IFNy, M-CSF, GM-CSF, Basic FGF, LIF, PDGF-BB, VEGF, М1Р-2, MIG в плазме крови оценивали на 3-е, 7-е и
21-е сутки после инокуляции животным исследуемых препаратов, методом проточной флюориме-трии на двулучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex 200 System, Bio-Rad, США). В работе использовали коммерческие тест-системы: Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Standard Group I 23-Plex, Bio-Plex Pro Mouse Cytokine Standard Group II 9-Plex, Calibration Bead Set. Обработку данных проводили с помощью программы Bio-Plex Manager 5.0 Properties.
Анализ содержания цитокинов в плазме крови проводили в трех повторах, при этом значения цитокинов в стандартных калибровочных разведениях, в контрольных и тестируемых образцах, были воспроизводимы. Концентрацию цитокинов в плазме крови выражали в пкг/мл.
Статистическую обработку данных проводили при помощи стандартного пакета прикладных программ «Statistica», версия 6 (Copyright©StatSoft, Inc 19842001, ИПЧИ 31415926535897) с использованием U-критерия Манна-Уитни. Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Согласно полученным данным уровень цито-кинов в сыворотке крови мышей контрольных групп К1 и К2 достоверно не различался. Также не наблюдалось достоверных различий в уровне цитокинов IL-1a, М№-2, LIF, Basic FGF, IL-15 в сыворотках крови мышей контрольных и опытных групп.
В настоящем исследовании показано, что экспериментальный препарат КО + F! достоверно оказывает стимулирующее влияние на продукцию следующих цитокинов: IFN-y (p = 0,049) (на 3-и сутки после инокуляции препарата) MIG (p = 0,046), TNF-a (p = 0,049) (на 7-е сутки); VEGF
(p = 0,049), IL-1P (p = 0,049) (на 21-е сутки); IL-12 (p70) (p = 0,046, p = 0,033), GM-CSF (p = 0,046, p = 0,046) (на 7-е и 21-е сутки, соответственно).
Препарат тДНК чумного микроба достоверно оказывает стимулирующее влияние на продукцию цитокинов: IL-18 (p = 0,049), MIG (p = 0,049) (на 7-е сутки); VEGF (p = 0,049), IL-ф (p = 0,049), IL-12 (p70) (p = 0,036), GM-CSF (p = 0,049), IFN-y (p = 0,049) (на 21-е сутки).
Синтетический МДП достоверно оказывает стимулирующее влияние на продукцию цитокинов: M-CSF (p = 0,049), VEGF (p = 0,046), IL-12 (p40) (p = 0,049) (на 3-и сутки); MIG (p = 0,049), TNF-a (p = 0,049) (на 7-е сутки); IL-10 (p = 0,049), GM-CSF (p = 0,049), IFN-y (p = 0,049) (на 21-е сутки); IL-12 (p70) (p = 0,049, p = 0,036) (на 7-е и 21-е сутки, соответственно).
Комплексный препарат КО + F1 +тДНК достоверно оказывает стимулирующее влияние на продукцию цитокинов: PDGF-bb (p = 0,049), IFN-y (p = 0,049) (на 3-и сутки); MIG (p = 0,049, p = 0,049) (на 3-и и 7-е сутки); IL-12 (p70) (p = 0,036), GM-CSF (p = 0,049) (на 21-е сутки); VEGF (p = 0,049, p = 0,049) (на 7-е и 21-е сутки, соответственно).
Комплексный препарат КО + F1 +МДП достоверно оказывает стимулирующее влияние на продукцию цитокинов: IL-18 (p = 0,046), IL-12 (p40) (p = 0,049) (на 3-и сутки); VEGF (p = 0,046) (на 7-е сутки); IL-12 (p70) (p = 0,036), GM-CSF (p = 0,049), TNF-a (p = 0,046) (на 21-е сутки).
Комплексный препарат КО + F1+ тДНК + МДП достоверно оказывает стимулирующее влияние на продукцию цитокинов: PDGF-bb (p = 0,049) (на 3-и сутки); VEGF (p = 0,049) (на 7-е сутки); M-CSF (p = 0,046), IL-12 (p70) (p = 0,036), GM-CSF (p = 0,049) (на 21-е сутки).
Особо стоит отметить тот факт, что уровни цитокинов IL-12 (p70) и GM-CSF достоверно увеличивались после инокуляции всех перечисленных выше экспериментальных препаратов.
Таким образом, результаты, полученные в ходе эксперимента, свидетельствуют о стимулирующем эффекте всех исследованных препаратов на продукцию цитокинов IL-1 р, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 (p40), IL-12 (p70), IL-18, TNFa, IFNy, M-CSF, GM-CSF, PDGF-BB, VEGF, MIG.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Способность уклоняться от иммунологического надзора организма, подавлять реакцию врожденного иммунитета хозяина, присущая чумному микробу, во многом определяется структурой его липополисахарида (ЛПС). Так, при 37 °C, Y. pestis синтезирует дефектный тетраацелированный ЛПС, который индуцирует снижение продукции моноцитами, макрофагами и дендритными клетками организма хозяина различных цитокинов, таких как TNF-a, IL-1 р, IL10, IL-12, ингибирует стимуляцию TLR2, TLR4, TLR9 зависимых сигнальных путей. Таким образом чумной микроб подавляет активацию иммунной системы на ранних стадиях инфекции [18, 23, 24].
218
пмимппииимп ммпммгп □ I i i i ii iii □ nil iiiii
Стимуляция TLR2, TLR4, TLR9 рецепторов соответствующими лигандами (PAMPs), приводит к активации синтеза провоспалительных цитокинов IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-a, INF-y, колониестимулирующих факторов, и, в конечном итоге, к эффективному провоспалительному антибактериальному ответу [9, 11, 18, 22, 24].
Таким образом, полученный нами комплексный препарат на основе F1-антигена и клеточных оболочек в сочетании с адъювантами (тДНК чумного микроба, МДП) способствует стимуляции TLR2, NLR2, TLR9 и TLR4 рецепторов, которые являются активаторами сигнальных путей синтеза цитоки-нов [12, 13, 15, 17].
Полученные нами результаты позволяет рассматривать данный экспериментальный препарат в качестве возможного кандидата для создания безопасной и эффективной вакцины, обладающей способностью активировать врожденный иммунитет и стимулировать формирование адаптивного иммунного ответа организма.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бывалов А.А., Гаврилов К.Е., Крупин В.В. Биологические и физико-химические свойства культур бактерий Yersinia pseudotuberculosis, несущих fra-оперон Yersinia pestis // Молекул. генетика. - 2008. - № 1. - С. 14-18.
2. Козлов И.Г., Тимаков М.А. Иммунотерапия: вчера, сегодня, завтра // Педиатрия. - 2009. -Т. 87, № 4. - С. 140-149.
3. Кутырев В.В., Девдариани З.Л., Саяпина Л.В. Современное состояние научных исследований в области вакцинопрофилактики особо опасных бактериальных инфекций // Проблемы особо опасных инфекций. - 2006. - T. 92. - Р. 18-24.
4. Марков Е.Ю. и др. Протективная активность субклеточных фракций Yersinia pestis при экспериментальной чуме у белых мышей // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. - 2004. - Т. 2, № 1. - С. 123-127.
5. Нактинис В.И., Малеева Н.Е., Санько Д.Ф. Два простых метода выделения ДНК из различных источников с применением цетавлона // Биохимия. - 1977. - Т. 42, № 10. - С. 1783-1789.
6. Половинкина В.С. и др. Получение микро-корпускулярного антигенного комплекса, способного формировать напряженный иммунитет против чумы на фоне экстренной неспецифической профилактики // Журнал инфекционной патологии. - 2009. - Т. 16, № 3. - С. 178-179.
7. Серебряная Н.Б., Новик А.А. ДНК как иммуностимулятор // Медицинская иммунология. -2001. - Т. 3, № 1. - С. 27-34.
8. Amemiya K. et al. CpG oligodeoxynucleotides augment the murine immune response to the Yersinia pestis F1-V vaccine in bubonic and pneumonic models of plague // Vaccine. - 2009. - Vol. 27, N 16. -P. 2220-2229.
9. Barton G.M., Kagan J.C. A cell biological view of Toll-like receptor function: regulation through compartmentalization // Nature Reviews. Immunology. - 2009. - Vol. 9. - P. 535-542.
10. Beutler B.A. TLRs and innate immunity // Blood. - 2009. - Vol. 113. - P. 1399-1407.
11. Heit A. et al. Protective CD8 T cell immunity triggered by CpG-protein conjugates competes with the efficacy of live vaccines // J. Immunol. - 2005. -Vol. 174, N 7. - P. 4373-4380.
12. Jin M.S., Lee J.O. Structures of the Tolllike receptor family and its ligand complexes // Immunity. - 2008. - Vol. 29. - P. 182-191.
13. Jurk M., Vollmer J. Therapeutic applications of synthetic CpG oligodeoxynucleotides as TLR9 agonists for immune modulation // BioDrugs. -2007. - Vol. 21, N 6. - P. 387-401.
14. Kawai T., Akira S. The roles of TLRs, RLRs and NLRs in pathogen recognition // Int. Immunol. -2009. - Vol. 21, N 4. - P. 317-337.
15. Kumar H., Kawai T., Akira S. Toll-like receptors and innate immunity // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2009. -Vol. 388. - P. 621-625.
16. Markov E.Yu. et al. Protective activity of Yersinia pestis EV antigenic complex with the im-munostimulators and combined use of doxycyclin // Scientific Journal of Center for Infectious Diseases with Natural Foci. - 2005. - P. 176-184.
17. Medvedev A.E., Lentschat A., Kuhns D.B. Distinct mutations in IRAK-4 confer hyporesponsiveness to lipopolysaccharide and interleukin-1 in a patient with recurrent bacterial infections // J. Exp. Med. -2003. - Vol. 798. - P. 521-531.
18. Montminy S.W. et al. Virulence factors of Yersinia pestis are overcome by a strong lipopolysac-charide response // Nat. Immunol. - 2006. - Vol. 7, N 10. - P. 1066-1073.
19. Nod2 is required for the regulation of commensal microbiota in the intestine // PNAS. -2009. - Vol. 106, N 37. - P. 15813-15818.
20. O'Neill L.A. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer / L.A. O'Neill, C.E. Bryant, S.L. Doyle // Pharmacol. Rev. - 2009. - Vol. 61. - №. 2. -P. 177-197.
21. Petnicki-Ocwiejaa T. et al. Medzhitov R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response // Nature. - 2007. - Vol. 449. -P. 819-826.
22. Ringwood L., Li L. The involvement of the interleukin-1 receptor-associated kinases (IRAKs) in cellular signaling networks controlling inflammation // Cytokine. - 2008. - Vol. 42, N 1. - P. 1-7.
23. Samulowitz U. et al. A Novel Class of Immune-Stimulatory CpG Oligodeoxynucleotides Unifies High Potency in Type I Interferon Induction with Preferred Structural Properties // Oligonucleotides. - 2010. -Vol. 20, N 2. - P. 93-101.
24. Telepnev M.V. et al. Tetraacylated lipopolysaccharide of Yersinia pestis can inhibit multiple Tolllike receptor-mediated signaling pathways in human dendritic cells // J. Infect. Dis. - 2009. - Vol. 200, N 11. - P. 1694-1702.
25. Uddowla S., Freytag L.C., Clements J.D. Effect of adjuvants and route of immunizations on the
niiiimiiiiiiiiiiiin 11 iii 11 inn □ 11 I i □ nil I II111
219
immune response to recombinant plague antigens // Vaccine. - 2007. - Vol. 25, N 47. - P. 79847993.
26. Vollmer J., Krieg A.M. Immunotherapeutic applications of CpG oligodeoxynucleotide TLR9 agonists // Advanced Drug Delivery Reviews. - 2009. -Vol. 61. - P. 195-204.
27. Wren B.W. The yersiniae - a model genus to study the rapid evolution of bacterial pathogens // Nat. Rev. Microbiol. - 2003. - Vol. 1. - P. 55-64.
28. Yu P. Nucleic acid recognizing Toll-like receptors as therapeutic targets: a focus on autoimmunity and cancer // Journal of Receptor, Ligand and Channel Research. - 2009. - Vol. 2. - P. 19-28.
Сведения об авторах
Половинкина Валерия Сергеевна - научный сотрудник биохимического отдела ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, 8 (3952) 22-01-38, факс: 8 (3952) 22-01-40; e-mail: valerisa@list.ru, adm@chumin.irkutsk.ru)
Корнева Александра Владимировна - лаборант-исследователь биохимического отдела ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера. 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, 8 (3952) 22-01-38, факс: 8 (3952) 22-01-40)
Козулина Ксения Юрьевна - м.н.с. биохимического отдела ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, 8 (3952) 22-01-38, факс: 8 (3952) 22-01-40)
Коновалова Жанна Анатольевна - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории патофизиологии Иркутского научноисследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40; e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru)
Дубровина Валентина Ивановна - д.б.н., с. н.с., зав. лабораторией патофизиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (тел.: 89025100004; e-mail: dubrovina-valya@mail.ru)
Марков Евгений Юрьевич - д-р биол. наук, заведующий биохимическим отделом ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора (e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru) Николаев Валерий Борисович - к.м.н., с.н.с. биохимического отдела, ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.:
22-01-35; e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru)
Афанасьев Максим Владимирович - к.б.н., старший научный сотрудник отдела эпидемиологии ФГУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора (664047, г Иркутск, ул. Трилиссера, 78; тел.: 22-01-35; e-mail: adm@chumin.irkutsk.ru)
220
питмиинммп ммпмигп □ i i i ii i i □ nni ii ii
