CC BY
47
УДК 579.852.11-097:615.371
В.И. Дубровина, С.В. Лукьянова, Ж.А. Коновалова, О.Б. Колесникова, Е.В. Кравец,
С.А. Витязева, Т.П. Старовойтова, Т.А. Иванова, Е.Ю. Марков, О.В. Юрьева
ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЭКСТРАКТА ПОВЕРХНОСТНЫХ АНТИГЕНОВ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА
Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» (Иркутск)
Получен экстракт антигенов Bacillus anthracis, изучены его иммунобиологические свойства. Установлено, что экстракт, обладает, способностью повышать неспецифические факторы, иммунитета с участием кислородзависимых и нитроксидзависимых бактерицидных систем, фагоцитов, стимулировать иммунологическую перестройку в тимусе, селезенке и лимфатических узлах животных, обеспечивая, таким, образом, устойчивость организма к сибирской язве.
Ключевые слова: Bacillus anthracis, антигены, иммунокомпетентные клетки
STUDY OF IMMUNOBIOLOGICAL PROPERTIES OF BACILLUS ANTHRACIS SURFACE ANTIGENS EXTRACT
V.I. Dubrovina, S.V. Lukjanova, Zh.A. Konovalova, O.B. Kolesnikova, E.V. Kravetz,
S.A. Vitjazeva, T.P. Starovojtova, T.A. Ivanova, E.Ju. Markov, O.V. Jurieva
Irkutsk Scientific Research Antiplague Institute of Siberia and Far East, Irkutsk
Extract of Bacillus anthracis antigens was prepared. Its immunobiological properties and influence on immu-nophagocytic system, were studied. It was established, that the extract increases non-specific immune factors by stimulation, of oxygen-dependent and. nitric oxide-dependent bactericidal systems and. results in tolerance of a live organism, to Bacillus anthracis.
Key words: Bacillus anthracis, immunocompetent cell, surface antigen
Сибирская язва, являющаяся особо опасным инфекционным заболеванием людей и животных, остается важной проблемой для здравоохранения и ветеринарии.
Необходимость изучения этой особо опасной инфекции связана еще и с тем, что B. anthracis остается в списке объектов бактериологического оружия и средств биологического терроризма, что особенно наглядно проявилось событиями 2001 г. в США. В связи с этим, продолжение детального изучения иммунологии сибирской язвы и протек-тивных свойств ее возбудителя в настоящее время весьма актуально.
Предполагают, что существенная роль в формировании противобактериального иммунитета принадлежит антигенам оболочки бактериальной клетки. Установлено, что белки S-слоя возбудителя сибирской язвы обладают вакцинным потенциалом и их можно использовать как дополнительные им-муногенные факторы, а также в диагностических целях [8, 11].
Очевидно, что выделение сибиреязвенных антигенов, изучение их иммуногенных и протективных свойств позволит полнее оценить роль отдельных антигенных компонентов микробной клетки в процессе формирования иммунитета.
Цель данной работы состояла в получении экстрактов антигенов B. anthracis СТИ—1 и изучении их иммунобиологических свойств.
МЕТОДЫ
Экспериментальными моделями в опытах (заражение, иммунизация, получение фагоцитов и
т. д.) служили беспородные, но стандартные по условиям содержания и массе морские свинки (массой 250 — 300 г) и белые мыши (18 — 20 г) обоих полов. Всего в опытах использовали 155 животных: 105 морских свинок, 50 белых мышей. Животных выводили из эксперимента воздушной эмболией сосудов сердца или под наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Минздрава СССР от 12.08.1997 г. № 755).
В работе использовали вирулентный штамм B. anthracis И-9 (музей живых культур Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока, доза испытуемого агента, вызывающая гибель 50 % взятых в опыт животных (ЛД50) для белых мышей — 50 спор) и вакцинный безкапсульный штамм B. anthracis СТИ-1 (Государственный институт стандартизации и качества им. Л.А. Тарасевича).
Экстракт антигенов сибиреязвенного микроба получали по методу, описанному в работе И.А. Барковой [1] из микробной массы вакцинного безкапсульного штамма B. anthracis СТИ-1 (Государственный институт стандартизации и качества им. Л.А. Тарасевича). Микробную массу штамма B. anthracis СТИ-1 выращивали на пластинах агара Хоттингера или казеиново-дрожжевого агара (рН 7,2) (Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока) при температуре 37 °С в течение 18 ч.
Для контроля специфической стерильности экстракт антигенов сеяли на агар Хоттингера, инкубировали 48 ч в термостате при 37 °С согласно
методическим указаниям [6]. Электрофоретический анализ экстракта антигенов проводили в 10% полиакриламидном геле в вертикальной камере (Hoefer mini VE Vertical Electrophoresis System) при силе тока 50 мА в течение 5 часов по методу U.K. Laemmli, M. Favre [4]. Для определения молекулярной массы белков применяли маркеры фирмы «Combithek» (молекулярная масса 12,5, 25, 45, 68, 100 кДа). Наличие антигенов в экстрактах
B. anthracis определяли в реакции иммунодиффузии в 1% агаровом геле с использованием сывороток: против экстрагируемого антигена ЕА-1 [1, 2, 8] сибиреязвенного микроба (Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока) и коммерческого сибиреязвенного лошадиного иммуноглобулина (Россия, Научно-исследовательский институт микробиологии Мин. обороны РФ, г. Киров). Гель окрашивали кумаси ярко-синим [4].
Количественное определение белка проводили по методу Лоури на спектрофотометре «КФК — 3 — 01 — «ЗОМЗ» при X = 750 нм, в качестве стандарта использовали альбумин сыворотки крупного рогатого скота «Реахим» [9]. Нуклеиновые кислоты и углеводы определяли по методу Р. Хансон, Дж. Филлипс [7]. Острую токсичность препарата определяли на 50 белых беспородных мышах при однократном подкожном введении в иммунизирующих дозах от 12,5 до 100 мкг по белку. Учет результатов проводили в течение 7 суток после инъекции.
Влияние экстракта антигенов на функциональную активность фагоцитов исследовали в условиях in vitro на перитонеальных макрофагах [3]. В опытах использовали 25 беспородных морских свинок. Перитонеальные макрофаги (107 фагоцитов в мл) интактных морских свинок премировали экстрактом антигенов в дозах 25, 50 и 75 мкг — по содержанию белка, и искусственным антигенным комплексом, созданным на основе протективного антигена, клеточных стенок и экстрагируемого антигена ЕА-1 сибиреязвенного микроба, конъюгированных дигидразидом адипиновой кислоты и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбадиимид в дозе 25 мкг [2] в течение 30 мин при 37 °С, с последующим определением активности НАДФ-Н-оксидазы и NO-синтазы [3].
Экспериментальной моделью при изучении морфологических изменений в органах служили 25 морских свинок, 5 животных составили контрольную группу. Интактных морских свинок премировали экстрактом антигенов в дозе 50 мкг, подкожно в левую заднюю лапу. Забор материала для исследования (регионарный и паховый лимфатические узлы, селезенка, тимус, место введения препарата, печень и почки) проводили на 3-е, 7-е, 14-е и 21-е сутки с момента иммунизации. Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в целлоидин. Тканевые срезы толщиной 6 мкм окрашивали гематоксилин-эозином, метиловым зеленым — пиронином и тионином [5]. В работе использовали методы обзорной микроскопии. Количественную оценку пиронинофильных
клеток (плазматических) лимфатического узла и селезенки проводили с использованием морфоме-трии, измерение площади лимфоидного фолликула и его реактивного центра — с помощью компьютерной программы «Motic Images Plus» (версия 2). Автоматический анализ изображения производили с помощью светового микроскопа «Zeiss» (Германия) с видеокамерой «Moticam 2000», разрешение 1392 х 1040 пикселей, об. 100.
С целью изучения протективной активности 50 морских свинок иммунизировали подкожно экстрактом антигенов (12,5, 25 и 50 мкг). Для сравнения другую группу животных иммунизировали искусственным антигенным комплексом с известными протективными свойствами (50 мкг) [2]. Через 21 сутки иммунизированных морских свинок заражали штаммом B. anthracis И-9 (музей живых культур Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока) в дозе 1000 спор (ЛД50 для белых мышей — 50 спор). Контролем служили 10 интактных животных.
Все полученные материалы обработаны статистически стандартными параметрическими методами с использованием t-критерия Стьюдента и с применением стандартного пакета программ «Statistica», версия 6 (Copyright©Stat Soft, Inc 1984 — 2001, Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока, 31415926535897) и программы Microsoft Excel (2003) корпорации Microsoft. Различия принимали как достоверные при уровне значимости p < 0,05, p < 0,01.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Электрофоретический анализ экстракта антигенов показал, что его преобладающим компонентом является полипептид с молекулярной массой 91 кДа. Антигенные свойства и клеточная локализация полипептида с подобной молекулярной массой последнее время активно изучаются. Установлено, что этот белок является компонентом S-слоя клеточной облочки [1, 8].
Содержание углеводов в выделенном препарате составляло 0,07 мкг/мл и 1,8 мкг/мл, нуклеиновых кислот — 0,05 мкг/мл и 0,13 мкг/мл, белка — 10 и 20 мкг/мл, соответственно.
В реакции иммунодиффузии полученный экстракт, также как и искусственный антигенный комплекс, образовывал линию преципитации с поливалентной сибиреязвенной сывороткой и с антисывороткой к антигену ЕА-1, имуногенные свойства которого ранее были изучены [2].
Показано, что экстракт в дозах от 12,5 до 100 мкг не токсичен для белых мышей и не вызывает их гибель.
Установлено, что полученный экстракт антигенов B. anthracis СТИ — 1 обладает протективным действием для морских свинок. Однократная вакцинация препаратом в дозах 12,5, 25 и 50 мкг защищала 40, 80 и 80 % животных, соответственно, при последующем (через 21 сутки) внутрибрюшин-ном заражении спорами вирулентного штамма В.
аnthracis И-9 в дозе 20 ЛД50 (1000 спор). Следует отметить, что искусственный антигенный комплекс (препарат с известными протективными свойствами) в оптимальной дозе 50 мкг защищал 60 % инфицированных животных. Интактные животные погибали на 2 — 3 сутки после заражения. Летальность в контрольной группе составила 70 %.
Было изучено влияние экстракта антигенов сибиреязвенного микроба (в дозах 25, 50, 75 мкг) на показатели функционального состояния иммуно-компетентных клеток in vitro. Экстракт антигена, также как искусственный антигенный комплекс, стимулировал активность НАДФ-Н-оксидазы пе-ритониальных макрофагов. Активность фермента в клетках, обработанных препаратом в 1,2 — 1,5 раза (p < 0,05) превышала таковую в интактных клетках.
Экстракт антигена и искусственный антигенный комплекс стимулировали продукцию монооксида азота in vitro перитонеальными макрофагами морской свинки. Наибольшей стимулирующей способностью на продукцию монооксида азота обладал антиген в концентрации 25 и 50 мкг/мл фагоцитов (рис. 1). Более высокая концентрация экстракта (75 мкг) оказывала ингибирующее влия-
ние на активность NO-синтазы, что выражалось в более низких показателях продукции монооксида азота.
В иммунокомпетентных органах морских свинок опытной группы регистрировали незначительные кровоизлияния, более выраженное увеличение площади фолликулов и герминативных центров на ранних сроках исследования (к 3 суткам в 1,3 и в 6 раз соответственно выше, чем в контроле). Эти значения заметно увеличивались к 7 суткам (в 3,0 и в 18,0 раз превышая данные интактных животных), сохраняя высокие показатели и на 14 — 21 сутки (в 2,0 — 3,0 и в 5,0 — 20,0 раз выше соответственно) (табл. 1). Процентное содержание клеток плазмоцитарного ряда достигало максимального значения к 7—14 суткам (в 35,9 — 41,1 раза превышая показатели контрольной группы). К 21 суткам количество плазмоцитов снижалось, но было в 18,0 раз выше, чем у интактных животных (табл. 2). В паховых лимфатических узлах иммунизированных животных изменения отсутствовали.
Таким образом, изменения микроанатомиче-ской организации (увеличение площади фолликула и реактивного центра) и повышение числа плазматических клеток в селезенке и лимфатических
о
а
СТ
о
Иммунизирующая доза, мкг
ШАнтигенный комплекс ИЭкстракт антигенов ШКонтроль Рис. 1. Активность NO-синтазы фагоцитов, примированных экстрактами антигенов сибиреязвенного микроба (М ± т)
Таблица 1
Площадь фолликула и реактивного центра в селезенке и регионарном лимфатическом узле морских свинок,
иммунизированных экстрактом антигенов B. Anthracis
Препарат Органы Зоны Сроки исследования (сутки)
3 7 14 21
Экстракт селезенка S ф. 2,05 ± 0,02 4,97 ± 0,08* 5,96 ± 0,08** 3,02 ± 0,08*
S р. ц. 0,57 ± 0,03** 1,69 ± 0,03** 1,93 ± 0,05** 1,53 ± 0,04**
Контроль селезенка S ф. 1,53 ± 0,13
S р. ц. 0,09 ± 0,01
Экстракт лимфатический узел S ф. 2,36 ± 0,09* 4,37 ± 0,08* 4,53 ± 0,12* 3,05 ± 0,11*
S р. ц. 0,68 ± 0,03** 1,98 ± 0,05** 2,04 ± 0,07** 1,93 ± 0,08**
Контроль лимфатический узел S ф. 1,61 ± 0,02
S р. ц. 0,10 ± 0,00
Примечание: * - р < 0,05; ** - р < 0,01 статистическая значимость различий по отношению к контролю; S ф. - общая площадь фолликула в мкм; S р. ц. - площадь реактивного центра в мкм.
Таблица 2
Количество плазматических клеток в иммунокомпетентных органах морских свинок, иммунизированных экстрактом антигенов B. Anthracis
Препарат Органы Сроки исследования (сутки)
3 7 14 21
Экстракт антигенов селезенка 0,58 ± 0,09 15,32 ± 0,14** 16,09 ± 0,15** 8,04 ± 0,14**
лимфатический узел 0,82 ± 0,06* 16,05 ± 0,11** 15,94 ± 0,15** 6,78 ± 0,14**
Контроль селезенка 0,42 ± 0,05
лимфатический узел 0,39 ± 0,02
Примечание: * - р < 0,05; ** - р < 0,01 статистическая значимость различий по отношению к контролю.
узлах у животных, иммунизированных экстрактом антигенов свидетельствует об активизации В-зависимых зон иммунокомпетентных органов и, следовательно, о развитии иммунологических реакций гуморального типа в ответ на введение исследуемого антигенного комплекса [7].
Макро- и микроскопически с 3 — 14 суток в печени экспериментальных животных отмечали полнокровие органа и признаки умеренно выраженной зернистой дистрофии. В почках — умеренное неравномерное полнокровие и зернистая дистрофия эпителия извитых канальцев. Данные изменения нивелировались к 21 суткам. Выявленные изменения допустимы при вакцинальных процессах [8]. Следует отметить, что перестройка лимфоузлов и селезенки происходила не по пути гипертрофии органа и повышения функциональной активности всех структурно-функциональных зон, а по пути избирательного увеличения структур, принимающих участие в регуляции функционирования органа. По мнению ряда авторов, изменения в соотношении структур являются главной внутренней характеристикой иммунной системы при адаптации [10, 11].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Резюмируя представленный экспериментальный материал, можно заключить, что полученный экстракт антигенов сибиреязвенного микроба обладает протективной активностью, способностью повышать неспецифические факторы иммунитета за счет активации кислородзависимых и нитрок-сидзависимых бактерицидных систем фагоцитов экспериментальных животных.
Реакция со стороны иммунокомпетентных органов животных опытной группы, выявленная на 7 сутки, значительно усиливалась к 14 суткам и сохраняла высокие показатели иммунной перестройки в лимфатическом узле и селезенке до 21 суток. Повышение числа плазматических клеток в исследуемых органах опытной группы свидетельствует о формировании гуморальной иммунной реакции у экспериментальных животных в ответ на введение экстракта антигенов сибиреязвенного микроба.
Таким образом, выделенный экстракт поверхностных антигенов не токсичен (в дозе до 50 мкг) при парентеральном введении экспери-
ментальным животным (морские свинки, белые мыши) обладает иммуногенной и протективной активностью, а также способствует повышению неспецифической резистентности организма экспериментальных животных в отношении сибиреязвенного микроба.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баркова И.А. и др. Продукция белков S-слоя разными штаммами Bacillus anthracis // Проблемы особо опасных инфекций. — 2008. — Т. 4 (98). —
С. 29-32.
2. Безносов М.В. Выделение и изучение специфических антигенов Bacillus anthracis с целью конструирования диагностических и профилактических препаратов : автореф. дис. ... канд. биол. наук : 03.00.07 / Всесоюзн. НИПЧИ «Микроб». -Саратов, 1997. — 22 с.
3. Дубровина В.И. и др. Определение функционального состояния фагоцитов в качестве показателя неспецифической защиты организма: метод. рек. — Иркутск, 2008. — 11 с.
4. Кондратьева И.А., Ярилина А.А. Практикум по иммунологии: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений. — М. : Академия, 2004. — 2-е изд., испр. и доп. — 272 с.
5. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. — Л. : Медицина, 1969. — 423 с.
6. Методические указания по контролю обсе-мененности воздуха и помещений лабораторий, где проводятся работы с вакцинными и вирулентными штаммами сибиреязвенного микроба, а также по контролю специфической стерильности бактериальных препаратов, полученных из штаммов B. anthracis. — Иркутск, 1987. — С. 4 — 6.
7. Методы общей бактериологии / под ред. Ф. Герхардта и др. — М. : Мир, 1984, — С. 295 — 296.
8. Микшис Н.И. и др. Продукция белков S-слоя штаммами Bacillus anthracis // Биотехнология. — 2004. — № 5. — С. 22 — 35.
9. Практическая химия белка / под ред. А. Дар-бре. — М. : Мир, 1989. — С. 605.
10. Pezard C. et al. Protective immunity induced by Bacillus anthracis toxin-deficient strains // Infect. Immun. — 1995. — Vol. 63. — P. 1369 — 1372.
11. Turnbull P.C. Anthrax vaccines: past, present and future // Vaccine. — 1991. — Vol. 9. — P. 533 — 539.
Сведения об авторах
Дубровина Валентина Ивановна - доктор биологических наук, старший научный сотрудник, зав. лабораторией патофизиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (факс: 8 (3952) 22-01-40, тел.: 8 (902) 510-00-04; e-mail: dubrovina-valya@mail.ru).
Лукьянова Светлана Владимировна - младший научный сотрудник лаборатории патофизиологии Иркутского научноисследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, д. 78: тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40).
Коновалова Жанна Анатольевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории патофизиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, д. 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40).
Колесникова Ольга Борисовна - кандидат биологических наук, научный сотрудник отдела зоонозных инфекций Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, д. 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40).
Кравец Елена Владимировна - кандидат биологических наук, научный сотрудник отдела зоонозных инфекций Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, д. 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40).
Витязева Светлана Александровна - кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории патофизиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, д. 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40).
Старовойтова Татьяна Пантелеевна - научный сотрудник лаборатории патофизиологии Иркутского научноисследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, д. 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40).
Иванова Татьяна Александровна - заведующая лабораторией экспериментальных животных Иркутского научноисследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, д. 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40).
Марков Евгений Юрьевич - доктор биологических наук, старший научный сотрудник, заведующий биохимическим отделом Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, д. 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40).
Юрьева Ольга Викторовна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории патофизиологии Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (664047, г. Иркутск, ул. Трилиссера, д. 78; тел.: 8 (3952) 22-01-35, факс: 8 (3952) 22-01-40).
