CC BY
47
ИММУНОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОЛИМЕРНЫХ И ОЛИГОМЕРНЫХ ФРАКЦИЙ СТОЛБНЯЧНОГО АНАТОКСИНА
Э.Г. Кравцов, И.Б. Карсанова, А.В. Ермолаев
Кафедра микробиологии Российский университет дружбы народов Ул. Миклухо-Маклая, 8, 117198 Москва, Россия
Из производственных серий столбнячного анатоксина (СА) методом ступенчатой ультрафильтрации выделены олигомерная (м.м. 150 кД) и полимерные (м.м. 400-500-600 кД) фракции. При их изучении в серологических реакциях найдено, что каждая из этих фракций несет как минимум два основных эпитопа (А и В), различающихся по специфической активности. В случае полимерных фракций эпитопы В частично экранированы складчатостью молекулы СА и недоступны антителам. В случае олигомера СА эпитопы А и В на поверхности молекулы полностью открыты для антител в равных пропорциях. Обнаруженные закономерности использованы при создании латексных антигенных диагностикумов, для оценки токсинсодержащего начала в культуральных фильтратах С1де1аш.
Одним из критериев оценки антигенной активности столбнячного анатоксина (СА) в современном отечественном производстве служит реакция титрования специфической активности на мышах по Бехеру [1], которая при всех своих достоинствах требует значительных материальных и временных затрат. Другой метод -— простая реакция флокуляции в данном случае не применяется, поскольку не дает результатов, коррелирующих с данными титрования по Бехеру [1].
Целью настоящего исследования было выяснить, не обусловлено ли описанное явление молекулярной гетерогенностью специфического антигена в производственных препаратах СА, описанной нами в ряде предыдущих сообщений [2; 3].
Материалы и методы.
Производственные серии СА получены на базе ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова.
Полимерная и олигомерная фракции СА выделены на установках для ультрафильтрации АУФ-0,1 Нижегородского НИЦ «Биоавтоматика» укомплектованных половолоконными ультрафильтрационными колонками («картриджами») ВПУ-50 и ВПУ-100 мытищинского предприятия «Химволокно», с пределом исключения по молекулярной массе соответственно 50 и 100 кД [2]. Для выделения высокомолекулярной фракции анатоксина дополнительно использовали ультрафильтрационные системы Аш1Соп, укомплектованные плоскими мембранами фирмы 01аАо (США) марки ХМ-300 с эксклюзионным пределом 300 кД [3].
Наработку молекулярно однородных фракций СА осуществляли методом экс-клюзионной хроматографии, на установке Иуюогс! И с использованием колонок (11=1,0 м), заполненных гелем Тоуореаг! Н\У-60 [4].
Антигенные свойства выделенных фракций оценивали в реакции преципитации по Оухтерлони и реакции нейтрализации антител по общепринятым методикам
[5]. При конструировании антигенных диагностикумов на основе полимерных и олигомерных фракций СА в качестве носителя нами были использованы полисти-рольные частицы, полученные путем затравочной полимеризации, стабилизированные поливинилпирролидоном и содержащие на своей поверхности реакционноактивные альдегидные группы.
Статистическая обработка проводилась с использованием программы «БИОСТАТ».
Результаты и обсуждение.
В процессе хроматографического разделения образцов СА, очищенных путем ультрафильтрации, были получены олигомерные фракции с молекулярной массой 150 кД и полимеры с молекулярной массой 600, 500 и 400 кД [4]. В реакции преципитации исследуемые образцы с различными разведениями антитоксической сыворотки образовывали две полосы преципитации (рис. 1).
А
Рис. 1. Реакция преципитации олигомерной и полимерных фракций СА с высокотитражной антитоксической сывороткой в разведении 1:8:
а — несорбированная сыворотка;
1 — фракция с молекулярной массой 600 кД;
2 — фракция с молекулярной массой 430 кД;
3 — фракция с молекулярной массой 150 кД.
По конфигурации этих полос можно заключить, что в олигомере и полимерах имеется, по крайней мере, два эпитопа «А» и «В», определяемые как идентичные во всех исследуемых образцах. Фракции различались по количественному соотношению этих компонентов. Так, в полимерах с молекулярной массой 600 кД эпитоп «В» формировал тонкую полосу преципитации с сывороткой, разведенной 1:8, а компонент «А» — размытую полосу. С этой же сывороткой олигомер давал две выраженные полосы преципитации. Следует отметить, что эпитопы «А» и «В» обнаруживаются в образцах, полученных из разных серий анатоксина.
При иммобилизации на полистирольных частицах оказалось, что минимальная и оптимальная сенсибилизирующая дозы зависели от размера иммобилизируемых молекул (табл. 1). Это явление легко можно интерпретировать, если обратиться к гипотетической модели двух форм анатоксина, представленной на рис. 2.
В случае полимерной формы СА может быть представлен в виде одной крупной молекулы, где эпитопы «В» частично закрыты и не доступны антителам. В случае же олигомера эквивалентное количество белка представлено молекулами, на которых эпитопы А и В полностью открыты в равных пропорциях. Это значит, что представление одинакового количества эпитопов достигается при меньшем количестве белка олигомерной фракции по сравнению с полимерной, что отражено в минимальной сенсибилизирующей дозе (см. табл. 1).
. А А А. А ±А±АЛ.±-С> \ к оу
СГТЇТЇТЇТТТТПЗ
-ТО \ ^
"V®
Полимерная форма СА Олигомерная форма СА
Рис. 2. Модель полимерной и олигомерной фракции столбнячного анатоксина:
эпитоп А ;эпитоп В Р
Действительно, при сенсибилизации полистирольных частиц (когда реакционно-активные альдегидные группы носителя, полностью связываются сенситином), требуется большее количество олигомерной фракции по сравнению с СА в полимерной форме.
Из этого следует, что активность диагностикума на основе полимера должна быть выше, а для того, чтобы достигнуть такой же активности диагностикума на основе олигомера, надо иммобилизовать на поверхности носителя больше белка.
Как видно из приведенных в табл. 1 данных, оптимальная сенсибилизирующая доза для молекул с массой 150 кД оказалась выше, чем для полимерных фракций.
Таблица 1
Активность фракций столбнячного анатоксина
Молекулярная масса фракций СА, (кД) Минимальная сенсибилизирующая доза, м кг/мл Оптимальная сенсибилизирующая доза, мкг/мл Тормозящая активность по гомолог, диаг., мкг/мл
Полимер (600 кД) 2,9 15 1,35
Олш омер( 150 кД) 0,7 25 0,6
Из предлагаемой модели следует, что антигенные детерминанты олигомера более доступны для связывания антител, поэтому такая форма анатоксина должна более активно связывать антитоксическую сыворотку. Для подтверждения этого были поставлены опыты по нейтрализации стандартного количества антител различными формами СА. Предварительно антитоксическая сыворотка была оттитрована диагностикумами, приготовленными на основе олигомерной и полимерных фракций СА. По результатам титрования было выбрано разведение сыворотки соответствующее 3 АЕ (агглютинирующим единицам). Затем в ряд разведений олигомерной и полимерной фракций был введен равный объем сыворотки в дозе 3 АЕ. После внесения в систему гомологичного диагностикума была определена концен-
трация антигена (по белку), необходимая для связывания ЗАЕ сыворотки. Из приведенных в таб. 1 данных следует, что для связывания стандартного количества антител необходимо существенно меньше белка олигомерной формы СА, чем полимерной.
Для выяснения вопроса о том, какие эпитопы полимера экранированы была проведена сорбция антитоксической сыворотки микросферами с иммобилизированным на них полимером с молекулярной массой 600 кД. Была выбрана заведомо высокотитражная сыворотка (3000 МЕ). Мы рассчитывали на то, что при введении сорбирующего диагностикума полного истощения сыворотки достигнуто не будет. Сорбция была проведена частицами, сенсибилизированными полимерной формы СА. В параллельной раститровке сорбированной и несорбированной сывороток определяли их тигр по двум диагностикумам. В одном случае это был препарат на основе полимера, а в другом — на основе олигомера. Установлено, что после сорбции сыворотки полимерной фракцией при последующем разрешении реакции ди-агностикумом на основе полимера в дозе 0,13 мкг/мл белка происходит связывание 3 АГЕ, в то время как фракция на основе олигомера при разрешении реакции диаг-ностикумом связывает 3 АГЕ в дозе только 1560 мкг белка/мл.
Приведенные материалы позволяют заключить, что при использовании для сорбции полимерной формы СА из сыворотки максимально были элиминированы антитела к доступным эпитопам «А» (см. рис. 2.), в то время как антитела со специфичностью «В» не могли быть удалены, поскольку соответствующие им эпитио-пы в полимере оказываются экранированы.
Подтверждением сказанному могут служить результаты реакции двойной диффузии по Оухтерлони, в которых нативная сыворотка с полимером и олигомером формировала 2 полосы преципитации, соответствующие детерминантам «А» и «В» (как это было показано на рис. 1), но после этапа сорбции олигомер образовывал только одну полосу преципитации, соответствующую эпитопу «В» (рис. 3).
;,«Г£
Чу
в
Рис. 3. Реакции преципитации олигомерной и полимерных фракций СА с сорбированной антитоксической сывороткой в разведении 1:8:
Ь- сорбированная полимером сыворотка;
1 — фракция с молекулярной массой 600 кД;
2 — фракция с молекулярной массой 430 кД;
3 — фракция с молекулярной массой 150 кД.
Следует отметить, что в опыт была взята не полностью истощенная сыворотка, поэтому полимер продолжал образовывать обе полосы преципитации, но антител со специфичностью «А» в сыворотке было столь мало, что формирование полосы
преципитации происходило не в зоне эквивалентности. В то же время концентрация антител со специфичностью «В» оставалась в эквивалентных соотношениях с плотностью соответствующих детерминант в полимере и олигомере.
Таким образом, конформационные особенности олигомерной и полимерной форм СА ассоциируются с изменением плотности расположенных на поверхности молекул эпитопов.
В технологии производства СА основным методом контроля токсинообра-зования является титрование по Бехеру in vivo. Попытки использовать тесты in vitro для оценки токсинопродукции не оказывались успешными, поскольку в большей мере отражают антигенные свойства препарата, а не его токсичность. В связи с этим нами решался вопрос — насколько реакция латекс агглютинации (РЛА) может быть информативна и адекватно отражает результаты классического теста на мышах. Кроме того, решался вопрос о том, какой из вариантов сенситина (олигомер или полимер СА) может быть использован для приготовления диагностикума.
В реакции торможения PJIA были изучены образцы токсина с различной активностью. Ее определяли на мышах путем титрования по Бехеру и выражали в летальных дозах Lt. Исследовали образцы токсина с активностью от 10 до 30 Lt. Реакцию торможения РЛА разрешали диагностикумами на основе полимеров 600 кД и олигомера 150 кД. Результаты этого опыта представлены в табл. 2, откуда следует, что в том случае, когда торможение РЛА разрешалось диагностикумами на основе полимерных фракций СА, зависимость величины ее торможения от токсической активности образцов слабая (г = 0,13). В то же время в отношении диагностикума на основе олигомерной фракции связь токсичности и глубины торможения РЛА была более выражена (г = 0,25).
Таблица 2
Результаты реакции торможения латексной агглютинации в зависимости от активности токсина
L, Полимер 600 кД М±ш Олигомер 150 кД М±т
20 7,0 ±0,45 5,7 ±0,2
15 7,9 ±0,3 5,7 ± 0,2
10 6,8 ±0,2 5,5 ± 0,2
Примечание. М — среднее значение количества токсина (мг белка азога), блокирующее 1 АЕ; т —• ошибка средней; Ц — летальная доза токсина.
Таким образом, применение диагностикумов на основе олигомерной формы С А в большей степени приближает РТЛА к тесту нейтрализации токсина. 1 ^скольку олигомерная фракция СА иммобилизированная на носителе наиболее полно представляет эпитопы токсина, диагностикум на ее основе может быть более репрезентативным при оценке токсинопродукции, чем с диагностикумом на основе исходного (нефракционированного) или полимерного СА.
ЛИТЕРАТУРА
1. Руководство по вакцинному и сывороточному делу / Под ред. Бургасова П.Н. — М., 1978,— 150 с.
2. Ермолаев А.В., Долин М.В., Якушевич Ю.Е. и др. Способ получения полимерной и олигомерной фракции столбнячного анатоксина. Патент №2065765 от 27 августа 1996 г.
3. Ермолаев А.В., Закгейм ДА., Кулак В.Г. и др. Получение и перспективы использования полимерной фракции столбнячного анатоксина // Биопрепараты. — 2002. — Т. 8. — № 4. — С. 5-9.
4. Кирсанова И.Б., Ермолаев А.В., Долин М.В. и др. Использование реакции нейтрализации антител для контроля токсинообразования Clostridium tetani // Биомедицинские технологии. — 2000. — № 13. — С. 32-36.
5. Никитин В.М. Справочник серологических реакций. — Кишинев, 1977. — 206 с.
IMMUNOCHEMICAL ANALYZING OF POLYMERIC AND OLIGOMEROUS FRACTIONS OF TETANUS ANATOXIN
E.G. Kravtsov, I.B. Karsanova, A.V. Ermolaev
The Department of Microbiology Peoples’ Friendship University of Russia Miklukho-Maklaya St., 8, 117198 Moscow, Russia
Oligomerous (MW 150 kDa) and polymeric (MW 400-500-600 kDa) fractions were isolated by the methode of graduated ultrafiltration from the industrial series of tetanus anatoxin. Using serological reactions it was shown that each of these fractions carries at least 2 main epitopes (A and B) that differ by specific activity. In case of polymeric fractions the epitopes B are partially closed because of the structural particularities of tetanus anatoxin molecule and are not accessible to antibodies. In case of oligomerous fractions the epitopes A and B on the molecule surface are completely opened to antibodies in equal proportions. These regularities were used during elaboration of latex agglutination test and for the evaluation of active substance in Cl tetani cultural filtrates.
