CC BY
33
УДК 613.931:616-097
И.Р.Симонова, Е.В.Безуглова, А.Н.Терентьев, А.Н.Наркевич, А.П.Кочеткова, С.З.Валиева
КОНСТРУИРОВАНИЕ ПОЛИМЕРНОГО АНТИГЕННОГО ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА И ВОЗМОЖНОСТЬ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ОЦЕНКИ ДИФТЕРИЙНОГО АНТИТОКСИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА
Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт
Сконструирован новый дифтерийный антигенный препарат на основе полимерных микросфер со стабильными биохимическими свойствами. Препарат получен в лиофилизированном виде, срок хранения составляет 3 года. Постановка реакции агломерации объемной (РАО) с применением полученного диагностикума производится микрометодом в планшетах для иммунологических реакций отечественного производства. Результаты серологической реакции четкие, стабильные, демонстративные, легко учитываемые за счет яркой окраски препарата. Учет производится через 1,5-2 ч. Для оценки иммунологичекого статуса проведен сравнительный анализ сывороток крови вакцинированных лиц различных возрастов с использованием двух серологических методов (РНГА и РАО). Показана возможность использования разработанного полимерного дифтерийного антигенного препарата в системе учреждений санитарно-эпидемической службы.
Ключевые слова: дифтерия, анатоксин, полимерные микросферы, серологические реакции.
Эпидемическая обстановка в России по дифтерии (в 90-е годы) сопровождалась высокими темпами роста заболеваемости (с 1990 по 1995 год в 13 раз), общей инфицированностью токсигенными бактериями (47,5 на 100 тыс. населения), высокой смертностью [1, 5].
Токсические формы течения инфекции, высокие показатели летальности, отмеченные у детей до
2 лет и взрослых старше 40, не привитых от дифтерии, обусловили необходимость проведения полной вакцинации населения. С 1995 г. иммунизация населения приобрела массовый характер, резко возросли объемы лабораторно-диагностических исследований [2, 3, 7].
До настоящего времени основным методом оценки поствакцинального иммунитета (определения уровня антитоксических антител) остается реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) с использованием антигенного эритроцитарного диагностикума, в значительно меньшей степени - иммуно-ферментный метод, что связано с дорогостоящим аппаратурным оснащением и реагентами для ИФА [4]. Коммерческий эритроцитарный препарат выпускается в жидком виде со сроком хранения в течение 1 года. Нестабильность и нестандартные свойства эритроцитарного (биологического) носителя являются основанием для разработки стабильного, демонстративного препарата, применяемого в ускоренном, простом в постановке методе, позволяющем выполнять массовые диагностические исследования в короткие сроки с высокой степенью воспроизводимости результатов [8, 9].
Учитывая сохраняющуюся напряженную обстановку по дифтерии в России, нами разработан дифтерийный антигенный диагностический препарат на основе носителя со стандартными свойствами для серологического обследования и определения уровня антитоксических антител в сыворотках крови больных и контроля вакцинации населения.
Материалы и методы
Методом дисперсионной полимеризации акролеина получены и использованы для конструирова-
ния диагностического препарата частицы сферической формы (ПА-микросферы) диаметром (2±0,5) мкм, окрашенные в сиреневато-розовый цвет с реакционными альдегидными группами на поверхности для ковалентного присоединения иммуноглобулинов или антител [6].
В технологии получения дифтерийного полимерного диагностикума в качестве антигена применяли коммерческий очищенный концентрированный дифтерийный анатоксин с концентрацией 320 Ь17ш1 (1,1 мг белка в 1 мл), производство НПО «Биомед» им. И.И.Мечникова. Сенсибилизирующую дозу анатоксина рассчитывали на сухой носитель. Использовали следующие сенсибилизирующие дозы: 96,0 Lf (0,3 мг/мл), 192,0 Lf (0,65 мг/мл),
384,0 Lf (1,3 мг/мл), 768,0 Lf (2,6 мг/мл).
Для иммобилизации анатоксина на сферических микрочастицах использовали буферные растворы различных значений pH среды (от 7,0 до 9,3.)
Иммобилизацию дифтерийного анатоксина проводили следующим образом: 100 мг носителя (1 мл суспензии микросфер) помещали в центрифужный стакан и дважды отмывали 0,1 М карбонатным буфером по 10 мл pH 9,2+0,1 при (3000+100) об/мин в течение (10+2) мин. Отмытый носитель суспендировали в 1,5 мл 0,1 М карбонатного раствора, к суспензии добавляли 1,5 мл указанного буферного раствора, содержащего 384 Lf (1,3 мг/мл) дифтерийного анатоксина и, перемешивая, оставляли для контакта в течение 2 ч при температуре (20+2)°С.
После 16-18-часового контакта при температуре (7+2) °С к суспензии добавляли 2 мл 1,0 % раствора желатозы на 0,9 % растворе хлорида натрия и оставляли при постоянном перемешивании в течение 2 ч при температуре (20+2) °С. После этого суспензию диагностикума центрифугировали и трижды отмывали 0,9 % раствором хлорида натрия при (3000+100) об/мин в течение (5+2) мин. Отмытый осадок суспендировали в 8 мл 0,1 % раствора желатозы на 0,9 % растворе хлорида натрия и определяли активность и специфичность полученного жидкого препарата.
Для лиофилизации диагностикума применяли
3 % желатозо-сахарозную среду высушивания.
Активность и специфичность препарата оценивали в реакции агломерации объемной (РАО) микрометодом в планшетах для иммунологических реакций (производство «Медполимер», Санкт-Петербург) в объеме 50 мкл 1 % раствора нормальной кроличьей сыворотки (НКС).
В качестве «положительного» контроля использовали коммерческую противодифтерийную сыворотку (производство АООТ «Биомед» им. И.И.Меч-никова, сер. 54), начиная с разведения 1:100 (0,1 МЕ/мл), и антитоксин дифтерийный очищенный ферментолизом и специфической сорбцией (производство НПО «Биомед», Пермь, сер. 42), начиная с разведения 1:1000 (0,5 МЕ/мл).
В качестве «отрицательного» контроля использовали негативные сыворотки человека и гетероло-гичные лошадиные сыворотки, начиная с разведения 1:20.
Сыворотки исследовали в количестве 50 мкл методом 2-кратного последовательного титрования, начиная с разведения 1:10 (с предварительным прогреванием при 56 °С 30 мин). Затем в каждую лунку добавляли по 25 мкл суспензии диагностикума в рабочем разведении. После добавления диагностикума содержимое лунок перемешивали покачиванием планшета и оставляли при температуре (20+2) °С на
1,5-2 ч. Для контроля диагностикума на отсутствие спонтанной агломерации в 2-3 лунки вносили только НКС и диагностикум без исследуемой сыворотки.
Учет реакции производили следующим образом: за положительный результат принимали цветной ярко-розовый агломерат, выстилающий все дно лунки с четко очерченными краями. В случае отрицательного результата диагностикум выпадал в виде колечка или точечного осадка в центре лунки.
В работе использовали коммерческий эритро-цитарный дифтерийный антигенный диагностикум, жидкий, сер. 75, 89.
Результаты и обсуждение
Иммобилизацию дифтерийного анатоксина на частицах носителя осуществляли в диапазоне pH от
7,0 до 9,3 при использовании буферных растворов различной молярности. Оптимальное значение pH оказалось равным 9,0-9,2 карбонатного буферного раствора с концентрацией 0,1 моль/л.
При использовании различных сенсибилизирующих доз оптимальной оказалась доза, равная 384 Lf (1,3 мг/мл) дифтерийного анатоксина на 100 мг носителя. Установлено, что при сенсибилизирующих дозах от 384 Lf (1,3 мг/мл) до 768 Lf (2,б мг/мл) на 100 мг носителя активность диагно-стикума изменялась незначительно (рисунок).
В качестве реагента, блокирующего свободные альдегидные группы, оставшиеся на поверхности сферических частиц после контакта дифтерийного анатоксина с носителем, использовали раствор же-латозы 1 % концентрации.
Диагностический препарат в жидком виде обычно хранили 7-10 дней при температуре (6+4) °С без изменения его активности и специфичности.
В целях повышения стабильности свойств ди-агностикум получен в лиофилизированном виде, используя желатозо-сахарозную среду высушива-
0,б5 мл 1,3 мл 2,б мл
(192,0 Lf) (384,0 Lf) (7б8,0 Lf)
Зависимость активности дифтерийного антигенного полимерного диагностикума от сенсибилизирующей дозы анатоксина.
По оси абсцисс - сенсибилизирующая доза анатоксина в 1 мл (Lf) на 100 мг носителя; по оси ординат - разведение контрольной противодифтерийной сыворотки
ния (3 % желатозы + 3 % сахарозы). Сухой дифтерийный антигенный полимерный препарат в ампулах имеет вид пористой таблетки сиреневаторозового цвета, легко растворимой (в течение 1 мин) при добавлении 15 мл 0,9 % раствора хлорида натрия. Срок хранения лиофилизированного диаг-ностикума - 3 года (срок наблюдения). В течение трех лет контролировали растворимость, активность и специфичность трех серий препарата через 6 мес., 1, 2 и 3 года. Длительность хранения не влияла на физическое состояние (растворимость), активность и специфичность диагностического препарата.
Специфическая активность полученного нами диагностикума составила 1:6400 с коммерческой противодифтерийной сывороткой (сер. 54), начиная с разведения 1:100. С антитоксином дифтерийным очищенным ферментолизом и специфической сорбцией (производство НПО «Биомед», Пермь, сер. 42), содержащим 500 МЕ/мл, активность составила
2,5-10^ МЕ/мл.
Специфическая активность коммерческого дифтерийного эритроцитарного антигенного диагностикума (производство АООТ «Биомед» им. И.И.Меч-никова) с контрольной противодифтерийной сывороткой сер. 54, начиная с разведения 1:100, составила 1:6400 для сер. 89 и 1:3200 для сер. 75.
Специфичность дифтерийного антигенного полимерного диагностикума исследовали, используя следующие гетерологичные сыворотки: противостолбнячную, коклюшную, туляремийную, О-хо-лерную, легионеллезную, Q-риккетсиозную, шигел-лезную поливалентную, эшерихиозную групповую и поливалентную, иерсиниозную поливалентную, лептоспирозную типоспецифическую (мини, циноп-тери, аустралис, помона, каникола), сыворотку человека негативную, начиная с разведения 1:20.
Для исследования степени напряженности иммунитета к дифтерии из Центра госсанэпиднадзора Ростова-на-Дону получена 181 сыворотка вакцинированных лиц разных возрастных групп населения с результатами РНГА (эритроцитарный антигенный диагностикум, сер. 75).
В работе применялись одновременно два дифтерийных диагностических препарата: эритроци-
Определение уровня антитоксических антител в серонегативных сывороточных образцах двумя серологическими методами: РНГА и РАО
Номер сыво- ротки Дата рождения Ревакцинация Титр РНГА Титр РА (п=3)
первая вторая третья сер. 75 сер. 89
1997 01.03.93 - - + 20 320 320
1889 17.10.82 - - + 40 160 160
1896 21.01.83 - - + 10 80 80
1895 26.02.83 - - + 40 160 160
1890 05.03.83 - - + 40 160 160
1892 08.06.83 - - + 40 160 160
1894 16.09.83 - - + 40 320 160
1830 01.05.89 - - + 40 80 160
1987 15.05.90 + + - 20 160 80
1796 27.05.90 + + + 40 160 80
1923 01.01.95 - - - 20 80 60
1807 18.03.95 + + - 40 80 160
1775 17.04.95 + + - 40 320 320
1755 13.10.98 + - - 40 160 320
Примечание. п - число повторностей опыта.
тарный антигенный диагностикум (сер. 89) и полимерный антигенный сухой трех серий (5, 7, 8). Результаты представлены при постановке реакций в трех повторностях. Диагностический титр реакции агломерации - 1:80. При исследовании 181 сыворотки вакцинированного контингента сывороточные образцы были распределены на 5 возрастных групп в соответствии с планом ревакцинации.
Сравнение специфической активности эритро-цитарного дифтерийного антигенного препарата (двух серий) и полимерного дифтерийного антигенного диагностикума на 114 сывороточных образцах показало, что в ряде случаев чувствительность нашего препарата была выше на 2-3 двукратных разведения (в 17 % случаев для сер. 89, в 36 % - для сер. 75). Из 114 исследованных сывороток выявлено 5 серонегативных (с титрами в РНГА и РАО ниже диагностического: 1:20-1:40) от лиц разного возраста: 3 сыворотки - группа 17-18 лет, 1-11 лет, 1-7 лет.
При исследовании 181 сыворотки людей, вакцинированных в разные сроки, особый интерес вызывают показатели антител у группы лиц (14 чел.) серонегативных в РНГА (эритроцитарный диагности-кум сер. 75) (таблица). При сравнительном исследовании степени напряженности иммунитета двумя серологическими методами установлено, что в РНГА с эритроцитарным антигенным препаратом сер. 75 (данные Центра госсанэпиднадзора Ростова-на-Дону) в 14 случаях титр реакции был ниже диагностического (1:20-1:40). При исследовании этих же сывороток в РНГА с эритроцитарным препаратом сер. 89 и в РАО с полимерным диагностикумом титры реакции были выше диагностического (1:80-1:320), таблица. Эти результаты подтверждают данные о нестабильности свойств биологического эритроцитарного носителя и диагностических препаратов на его основе от серии к серии, что может в дальнейшем привести к невыявлению диагностического титра и последующей необоснованной ревакцинации.
Результаты анализа 67 сывороточных образцов возрастной группы старше 35 лет показали, что число серонегативных лиц в данной группе составляет 46,3 % (31 сыворотка). Из них 3-кратную ревакцинацию получили 45,2 % (14 сывороточных образцов), двукратную - 36,1 % (11), однократную -
18,7 % (6). Из общего числа серонегативных результатов (38), выявленных в РНГА, в 7 случаях в РАО определили диагностический титр и выше, что позволяет в данном случае говорить о более высокой чувствительности метода с использованием полимерного препарата.
На основании результатов исследований считаем перспективным применение разработанного нами полимерного дифтерийного антигенного диагно-стикума для определения степени напряженности иммунитета наряду с аналогичным эритроцитарным препаратом.
Таким образом, отработаны условия иммобилизации дифтерийного анатоксина на полимерных сферических частицах носителя. Разработан дифтерийный полимерный антигенный диагностикум. Диагностический препарат получен в лиофилизирован-ном виде. Стабильность свойств диагностикума сохраняется в течение 3 лет, в отличие от эритроцитар-ного коммерческого жидкого со сроком хранения 1 год. По активности полимерный диагностикум соответствует коммерческому эритроцитарному, а в некоторых случаях превосходит его. Разработанный дифтерийный препарат использовали в лабораториях практического здравоохранения для определения уровня антитоксических антител в сыворотках вакцинированного контингента разных возрастных групп населения наряду с препаратами для РНГА.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Васильева К.Г., Лаврюков С.Я. // Журн. эпиде-миол. и инф. бол. - 1998. - № 2. - С. 25-27. - 2. Запорожец Т. С., Беседнова Н.Н., Г ажа А. К. и др. // Журн. эпидеми-ол. и инф. бол. - 1998. - № 2. - С. 30-33. - 3. Луника И.Г. Коллективный иммунитет к дифтерии у населения Приморского края в период массовой иммунизации: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Владивосток, 1999. - 4. Мазурова И.К., Мельник В.Г., Комбарова С.Ю. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции. Руководство. - М.: Информационноиздательский центр Госкомсанэпиднадзора России. - 1995. -5. Маркина С.С., Максимова Н.М., Богатырева Э.Я. и др. // ЗНиСО. - 1998. - № 2. - С. 4-8. - 6. Наркевич А.Н., Безуглова Е.В., Кочеткова А.П. и др. Способ получения носителя иммуноглобулинов. - А.С. № 1443578 от 8.08.1988. -7. Парфенова Е.В., Прокопов Н.В., Черкасов В.Р. // ЖМЭИ. - 1994. - № 6. - С. 97-99. - 8. О мерах по стабилизации и снижению заболеваемости дифтерией. Приказ МЗ и МП РФ,ГКСЭН РФ N 297/112 от 30.10.1995. - М. - 1995. - 9. Фикс Л.И., Иноземцева Л.В., Мусина Л.Т. и др. // ЖМЭИ. -1995. - № 6. - С. 73-74.
I.R.Simonova, E.V.Bezuglova, A.N.Terentiev, A.N.Narkevich, A.P.Kochetkova, S.Z.Valieva
Construction of a Polymer Antigenic Diagnostic Preparation and the Possibility of its Adaptation to the Assessment of Antitoxic Diphtheria Immunity
Rostov-on-Don Anti-Plague Research Institute
A new diphtheria antigenic preparation was constructed on the basis of polymer microspheres with stable biochemical characteristics. The preparation is produced as a lyophilized form with 3-years shelf life. The voluminous agglomeration reaction (VAR) was carried out with the diagnostic preparation using the principle of micro-technique on the home-made immunologic test worksheets. The results of serologic analyses were clear-cut, stable, demonstrative, easily seen due to the bright coloring of the preparation. They were registered in an hour and a half or in two hours. To assess the immunologic status, a comparative analysis of the blood sera was made for vaccinated persons of different age groups using two serologic test procedures (IHA and VAR). The constructed diphtheria antigenic polymer preparation is presented as a promising drug to be used in the system of sanitary-epidemiologic facilities.
Key words: diphtheria, anatoxin polymeric microspheres, serologic reactions.
nocTynu^a 17.09.06.
