Научная статья на тему 'Иммуногенные свойства ДНК вакцины, кодирующей ВИЧ-1 полиэпитопный Сtl иммуноген в составе аттенуированного штамма Salmonella enteritidis e23'

Иммуногенные свойства ДНК вакцины, кодирующей ВИЧ-1 полиэпитопный Сtl иммуноген в составе аттенуированного штамма Salmonella enteritidis e23 Текст научной статьи по специальности «Пептиды, белки»

128
53
Поделиться
Ключевые слова
ВИЧ / аттенуированная сальмонелла / ДНК вакцины / ВИЧ-1 полиэпитопный СTL иммуноген

Аннотация научной статьи по химии, автор научной работы — Даниленко А. В., Карпенко Л. И., Бажан С. И., Даниленко Е. Д., Бабенко О. А., Батенева А. В., Каплина О. Н., Ильичев А. А.

Был получен аттенуированный рекомбинантный штамм Salmonella enteritidis E23/ pcDNA-TCI, несущий ДНК-вакцину, содержащую ген искусственного ВИЧ-1 полиэпитопного CTL-иммуногена под контролем CMV промотора. Полученный штамм был использован для перректальной иммунизации мышей линии BALB/с. Показано, что обнаруживаемые после иммунизации в сыворотке иммунизированных мышей ВИЧ-специфические антитела узнавали как рекомбинантные, так и нативные белки ВИЧ-1. Двукратная иммунизация была более эффективной по сравнению с однократным введением. Наблюдали формирование специфического CTL-ответа в реакции ELISpot. Результаты показали, что рекомбинантный штамм Salmonella enteritidis E23/pcDNATCI, может быть перспективным в качестве системы доставки кандидатной анти-ВИЧ-1 ДНК-вакцины.

The recombinant attenuated strain Salmonella enteritidis E23/ pcDNA-TCI which carrying DNAvaccine containing gene of CTL-polyepitope HIV-1 immunogen under the control of CMV promoter was constructed. The strain was used for perrectal immunizations of BALB/c mice. Detected after immunization in sera of immunized mice HIV-specific antibodies were demonstrated to recognize both recombinant and native HIV-1 antigens. Double immunization was more effective compared to unitary injection. The results obtained showed that recombinant attenuated Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI could be perspective for delivery the candidate HIV-1 DNA vaccine.

Похожие темы научных работ по химии , автор научной работы — Даниленко А.В., Карпенко Л.И., Бажан С.И., Даниленко Е.Д., Бабенко О.А., Батенева А.В., Каплина О.Н., Ильичев А.А.,

Текст научной работы на тему «Иммуногенные свойства ДНК вакцины, кодирующей ВИЧ-1 полиэпитопный Сtl иммуноген в составе аттенуированного штамма Salmonella enteritidis e23»

УДК 577.112

А.В. Даниленко, Л.И. Карпенко, С.И. Бажан, Е.Д. Даниленко, О.А. Бабенко, А.В. Батенева, О.Н. Каплина, А.А. Ильичев

Е-mail: dalx@ngs.ru

ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ДНК ВАКЦИНЫ, КОДИРУЮЩЕЙ ВИЧ-1 ПОЛИЭПИТОПНЫЙ CTL ИММУНОГЕН В СОСТАВЕ АТТЕНУИРОВАННОГО ШТАММА SALMONELLA ENTERITIDIS E23

ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, пгт. Кольцово Новосибирской области

ВВЕДЕНИЕ

В мире заболевание СПИДом стоит на 4-м месте среди причин смертности. Согласно оценкам ВОЗ, в мире 14000 человек ежедневно инфицируются вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). В связи с этим создание безопасной, эффективной и дешевой анти-ВИЧ вакцины является одной из приоритетных задач современной вакцинологии. Подходы к созданию вакцины против ВИЧ, основанные на использовании в качестве иммуногена рекомбинантных гликопротеинов оболочки вируса, не дали желаемого результата [1]. Очевидно, что для успешного получения анти-ВИЧ вакцины требуется использование новых подходов. Одна из наиболее перспективных стратегий основывается на идентификации Т- и В-клеточных эпитопов в вирусных белках и дальнейшем использовании этих эпитопов как основы для синтетических полиэпитопных вакцин [2, 3, 4].

Как известно, восприимчивость к ВИЧ-инфекции и развитие СПИД существенным образом зави-50

сит от интенсивности и продуктивности клеточного иммунного ответа организма хозяина. Ранее в ГНЦ ВБ «Вектор» была получена полиэпитопная конструкция TCI (Т Cell Immunogene), содержащая более 80 CD8+ CTL эпитопов и CD4+ Т-хелперных эпитопов из главных вирусных белков Env, Gag, Pol, Nef, высококонсервативных у трех главных субтипов ВИЧ-1 (А, В, С) [5]. Ген, кодирующий TCI, был клонирован в составе векторной плазмиды pcDNA-3.1. Было показано, что ДНК-вакцина pcDNA-TCI индуцирует вирус-специфический T-клеточный и гуморальный иммунный ответ [5, 6].

Одним из перспективных способов доставки ДНК-вакцин является использование аттенуированных штаммов сальмонелл. Принципиальная возможность применения в качестве таких систем клеток граммотрицательных бактерий была показана в работе Darji с соавт. [7], которые использовали сальмонеллу для доставки ДНК-вакцины, кодирующей листериолизин. При иммунизации животных клетками рекомбинантного штамма наблюдалась индукция протективного Т-клеточного ответа, который защищал мышей от последующего заражения Listeria monocytogenes. При этом стимулировались как CD8, так и CD4 Т-лимфоциты, продукция специфических антител также была на высоком уровне. Дальнейшие эксперименты по доставке ДНК вакцин с помощью аттенуированных штаммов бактерий продемонстрировали перспективность данного направления [8, 9].

Цель настоящей работы - исследование иммуно-генных свойств ДНК вакцины, кодирующей ВИЧ-1 полиэпитопный С^ иммуноген в составе аттенуированного штамма Salmonella enteritidis Е23.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы, плазмиды и среды

Штамм Salmonella enteritidis E-23 (Acya, Acrp) любезно предоставлен проф. Бойченко М.Н. (Медицинская академия им. И.М. Сеченова, г. Москва) [10]. Конструирование плазмиды pcDNA-TCI, несущей

ген, кодирующий последовательность белка TCI под контролем CMV промотора, было описано ранее [4]. Получение рекомбинантного белка TCI описано в работе [5]. Все манипуляции с плазмидными ДНК проводили согласно [11]. В работе использовались среды YT, St х I [11]. Плазмиду pcDNA-TCI нарабатывали в клетках E.coli JM103 и через промежуточный штамм S. typhimurium SL 5000 r-m+ (рестрикция-, модификация+) с помощью электропорации вводили в клетки вакцинного штамма S. enteritidis E-23.

Иммунизация

Для иммунизации были использованы мыши линий ВАLB/c весом 12-15 граммов, полученные из вивария ГНЦ ВБ «ВЕКТОР». Животные содержались на стандартном рационе с достаточным количеством воды.

Для иммунизации клетки сальмонелл, содержащих рекомбинантную плазмиду pcDNA-TCI, выращивали следующим образом: отдельную колонию сальмонеллы засевали в 50 мл среды YT, содержащей ампициллин (50 мкг/мл), и инкубировали 16 часов на качалке при 37°C; клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в 1 мл PBS. Концентрацию жизнеспособных клеток определяли титрованием на агаризованной среде St x I. Мышам линии ВАLB/c вводили перректально по 30 мкл суспензии, содержащей 108 живых клеток S.enteritidis E23/pcDNA-TCI. Часть мышей была повторно иммунизирована на 28-е сутки после первой иммунизации. Животным контрольной группы вводили пер-ректально по 30 мкл суспензии, содержащей 108 живых клеток сальмонелл, не содержащих плазмиды. На 0, 16, 35, 63-е сутки после вакцинации у мышей обеих групп из ретроорбитального синуса производили забор крови для получения сыворотки. Оценку цитотоксического Т-клеточного ответа проводили после однократной иммунизации. На 7, 10, 14, 21-е сутки от начала иммунизации проводили забор селезенки и выделение спленоцитов для постановки ELISpot.

Иммуноферментный анализ

Для определения титра специфических антител в сыворотках иммунизированных мышей был использован вариант твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноблоттинг. Для определения специфических антител при проведении ИФА был использован рекомбинантный белок TCI. Белок TCI сорбировали в концентрации 12 нг/лунку на 96-луночные планшеты для ИФА «microlon», средней сорбционной способности. Планшет инкубировали 2 часа при 37°С. Блокировку осуществляли добавлением 200 мкл/лун 0,1% казеина. Анализируемые сыворотки добавляли 100 мкл/лунку в разведении 1:20. Последующие разведения делали двукратными. Планшет инкубировали на качалке при 302 об/мин и 37°С 1,5 часа. Между инкубациями планшет промывали дистиллированной водой. В работе исполь-

зован конъюгат антител козы против IgG мыши с пе-роксидазой хрена (Sigma, USA, кат № А 4416). Окрашивание осуществляли добавлением субстрата для пероксидазы ТМБ 100 мкл/лун. Планшет инкубировали при комнатной температуре в темноте 30 мин. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл/лун

0,5 М раствора серной кислоты. Результат регистрировали на спектрофотометре производства фирмы Вiorad при длине волны 450 нм. (США). Сигнал считали положительным, если значение ОП в 2 раза выше, чем среднее значение ОП контроля конъюгата.

Определение количества CTL лимфоцитов на основе реакции ELISPOT

При постановке реакции ELISPOT на первом этапе проводили сорбцию анти-INF-y МАТ с концентрацией 5 мкг/мл на лунку 96-луночного планшета ImmunoSpot M200. После инкубации в течение 12 ч при 4°С каждую лунку дважды промывали раствором PBS и блокировали средой RPMI 1640, содержащей 10%-ную фетальную бычью сыворотку в течение 2 ч. В качестве клеток-эффекторов использовали спленоциты иммунизированных животных в концентрации 106/мл. Для стимуляции продукции INF-y суспензией клеток использовали белок TCI 1 мкг/мл) и два пептида: №15 (DRVIEVVQGAYRAIR), №16 (KQIINMWQEVGKAMYA), входящих в белок TCI. Для неспецифической стимуляции спленоцитов использовали пептид EHEC (отрицательный контроль). Клетки культивировали в присутствии 5% СО2 при 37°С в течение 24 ч. INF-у-секретирующие клетки визуализировали, использовав 0,5 мкг/мл биоти-нилированнных анти-INF-y антител и 0,25 мкг/мл конъюгата Avidin-HRP. Окрашивание производили добавлением субстратов для пероксидазы (4-хлор-1-нафтол, диаминобензидин фосфат). Реакцию останавливали удалением реагентов, лунки промывали 3 раза дистиллированной водой. Подсчет количества INF-y -продуцирующих клеток осуществляли с помощью микроскопа. Данные представлялись в пересчете на106 спленоцитов.

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку данных всех экспериментов проводили с помощью пакета статистических программ Statgraphics, Vers.5.0 (Statistical Graphics Corp., USA). Для подтверждения статистической значимости обнаруженных межгрупповых различий использовали критерий Стьюдента, считая достаточным значение достигнутого уровня значимости (вероятности ошибки принять случайные отклонения средних арифметических за различия средних) p<0,05.

Иммуноблотинг

Иммуноблотинг проводили с использованием нитроцеллюлозных фильтров коммерческой тест-системы New-Lav-blot1 (Bio-Rad) с сорбированными белками ВИЧ-1. При исследовании специфичности мышиных сывороток иммуноблотинг проводили согласно инструкции по применению к тест-систе-

мам, за исключением того, что конъюгат против IgG человека был заменен на конъюгат козы против IgG мыши с пероксидазой хрена (Sigma).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Полиэпитопный иммуноген TCI (T cell immunogen) разработан для стимуляции ВИЧ-специфиче-ского Т-клеточного ответа. При конструировании белка TCI (T cell immunogen) были выбраны эпитопы из основных белков ВИЧ-1 Env, Gag, Pol и Nef (субтипов А, В и С), которые индуцируют как CD8+ ЦТЛ, так и CD4+ Т-хелперы [4, 5]. В последовательностях нативных вирусных белков эти эпитопы локализованы в нескольких непрерывных областях как частично, а иногда и полностью перекрывающимися пептидами. Оказалось, что эти непрерывные районы содержат также ряд В-клеточных эпитопов, которые перекрываются с Т-клеточными эпитопами. Именно поэтому иммунизация мышей плазмидой pcDNA-TCI, кодирующей белок TCI, индуцировала как Т-клеточный, так и В-клеточный иммунные ответы.

Отметим, что использование ДНК вакцинных конструкций для доставки CTL-иммуногенов является наиболее естественным путем представления антигенов для стимуляции ответа CTL. При использовании генной вакцинации эндогенно экспрессируемый целевой иммуноген процессируется в про-теасоме с образованием CTL-эпитопов, которые после связывания с молекулами MHC I класса опознаются цитотоксическими Т-лимфоцитами на поверхности антиген-презентирующих клеток (АПК) [12]. В то же время уже первые эксперименты по ДНК-иммунизации выявили серьезную проблему данного подхода, связанную со слабой иммуногенностью ДНК-вакцины. Поэтому сейчас большое внимание уделяется разработке систем, которые позволяют целенаправленно доставлять ДН-вакцину в АПК [13].

Ранее для доставки плазмиды pcDNA-TCI был использован аттенуированный штамм Salmonella typhimurium SL7207 (aroA), любезно предоставленный нам проф. Стокером (Стэндфордский университет). Была показана эффективность представления иммунной системе ДНК-вакцины pcDNA-TCI с помощью вышеуказанного штамма сальмонелл [6]. Однако следует подчеркнуть, что штамм S. typhimu-rium SL7207 (aroA) разрешен только для работы с лабораторными животными.

В Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова был получен аттенуированный штамм S.en-teriditis E-23 . Данный штамм несет мутации в генах cya и crp. На мышах, телятах и обезьянах показано, что патогенность этого штамма снижена в 100 тыс. раз по сравнению с родительским штаммом, при сохранении инвазивной активности [10]. ЛДз0 для штамма S.enteritidis E23/pcDNA-TCI при внутри-брюшинном введении мышам составляет 107 КОЕ, при внутрижелудочном введении - более 109 КОЕ.

Целью данной работы являлось исследование им-муногенных свойств ДНК-вакцины, кодирующей ВИЧ-1 полиэпитопный CTL иммуноген в составе аттенуированного штамма Salmonella enteritidis Е23.

Для исследования иммуногенных свойств аттенуированного рекомбинантного штамма сальмонеллы S.enteritidis E23/pcDNA-TCI была проведена однократная и двукратная перректальная иммунизация мышей линии BALB/c. Выбор перректального способа введения был сделан на основании результатов экспериментов, проведенных ранее по изучению перорального и перректального способов введения иммуногена[14]. По-видимому, при перрек-тальном введении клетки сальмонеллы попадают в хорошо кровоснабжаемую слизистую кишечника, где они поглощаются макрофагами кишечника и запускают местный и системный иммунный ответы на высвобождение ДНК-вакцины pcDNA-TCI и экспрессию целевого антигена. При этом не требуется использования антацидов, которые нейтрализуют кислую рН желудка, как это было бы необходимо при оральном введении.

Клеточный иммунный ответ Способность вакцинной конструкции индуцировать CTL ответ была исследована с помощью метода ELISPOT путем определения числа лимфоцитов, продуцирующих интерферон гамма. Белок TCI, а также пептиды из белков ВИЧ-1 N15 (DRVIEVV-QGAYRAIR) и N16 (KQIINMWQEVGKAMYA), входящих с состав TCI, были использованы как специфические антигены. Известно, что у мышей эти пептиды рестриктированы белками МНС I и II классов, что обеспечивает представленность как CD8+ CTL, так и CD4+ Тх лимфоцитам.

Из полученных данных видно, что на 7-е сутки от начала иммунизации лабораторных мышей штаммом S.enteritidis E23/pcDNA-TCI происходит увеличение числа IFN-y- продуцирующих клеток по сравнению с отрицательным контролем (пептид ЕНЕС)

Таблица

Результаты ELISPOT анализа цитотокси-ческого Т-клеточного иммунного ответа при введении рекомбинантного аттенуированного штамма S. enteritidis E23/pcDNA-TCI лабораторным мышам

Антиген Срок от начала иммунизации (сут), количество IFN-у-продуцирующих клеток/на 10б спленоцитов

7 10 14 21

TCI 120±28* 230±32* 150±22* 143±21*

P15 110±22* 220±25* 128±12* 125±17*

P16 107±16* 217±31* 129±14* 127±12*

EHEC 10±4 7±3 5±3 4±3

* - статистически значимые различия по сравнению с отрицательным контролем при уровне значимости р<0,05.

(табл.). Максимальное количество IFN-у-продуци-рующих клеток зафиксировано на 10-е сутки и оставалось статистически значимо более высоким по сравнению с контролем до конца периода наблюдения (21-е сутки после иммунизации).

Гуморальный иммунный ответ

Для описания результатов исследования гуморального иммунного ответа необходимо отметить, что выбранные для проектирования TCI иммуногена Т-клеточные эпитопы в последовательностях нативных вирусных белков локализованы в нескольких непрерывных областях и являются частично, а иногда и полностью перекрывающимися пептидами. Оказалось, что эти непрерывные районы содержат также ряд В-клеточных эпитопов, которые перекрываются с Т-клеточными эпитопами. Именно поэтому ранее нами было показано, что иммунизация мышей плазмидой pcDNA-TCI, кодирующей белок TCI, индуцировала как Т-клеточный, так и В-клеточный иммунные ответы [4]. В данной работе представляло интерес оценить возможность индукции антитель-

450

g 400 ©

И 350 £ 300

0 250

1 200 I 150

S

I 100

50

0

■ сыворотка мышеи, иммунизированных S. enteritidis E23

□ сыворотка мышей иммунизированных S. enteritidis E23/pcDNA-TCI

16 35 63

сутки после иммунизации

Рис. 1. Гуморальный иммунный ответ у мышей, иммунизированных S.enteritidis E23/pcDNA-TCI (однократное введение). Реципрокные титры антител к белку TCI в ИФА. Данные представлены как среднее значение титра ± стандартное отклонение (n=4).

* - статистически значимые различия по сравнению с отрицательным контролем при уровне значимости р<0,05

1000 ■

900 ■

800 -700 ■

600 -500 -400 ■

300 ■

200 -100 -о — — ■

1*

■ сыворотка мышеи, иммунизированных S.enteritidis Е23

и сыворотка мышей, иммунизированных S. enteritidis E23/pcDNA-TCI

16 35 63

сутки после иммунизации

Рис. 2. Гуморальный иммунный ответ у мышей, иммунизированных S.enteritidis E23/pcDNA-TCI (двукратное введение). Реципрокные титры антител к белку TCI в ИФА. Данные представлены как среднее значение титра ± стандартное отклонение (n=4).

* - статистически значимые различия по сравнению с отрицательным контролем при уровне значимости р<0,05

ного ответа у мышей, иммунизированных рекомбинантным штаммом сальмонеллы S.enteritidis Е23/ pcDNA-TCI, доставляющим плазмиду pcDNA-TCI в антигенпрезентирующие клетки.

Гуморальный иммунный ответ оценивали по обнаружению специфических антител в сыворотке иммунизированных животных в реакции непрямого иммуноферментного анализа. Результаты исследования титров антител в сыворотках мышей, иммунизированных S.enteritidis E23/pcDNA-TCI, представлены на рис. 1 и 2.

Было показало, что иммунизация мышей с помощью рекомбинантного штамма S.enteritidis E23/ pcDNA-TCI вызывает появление специфических антител к ВИЧ-1, при этом титры антител существенным образом зависели от кратности иммунизации. При однократной иммунизации специфические антитела в титре появлялись уже на 16-е сутки после введения (рис. 1). Максимальный титр антител наблюдался на 35-е сутки после иммунизации и составлял 1:245.

Повторная иммунизация на 28-е сутки после первой вызывала повышение синтеза специфичесих антител. Причем антительный ответ при двукратной иммунизации был более пролонгированным по сравнению с однократной иммунизацией. Максимальных значений титр антител (1:700) достигал на 35-е сутки после первой инъекции (7-й день после повторной иммунизации), после чего наблюдалось его снижение в течение 28 суток до уровня 1:470 (рис. 2).

Иммуноблотинг

Дополнительное подтверждение специфичности сывороток, полученных от мышей, иммунизированных S.enteritidis E23/pcDNA-TCI, было получено при использовании иммуноблотинга (рис. 3). Антитела, индуцированные в ответ на введение S.enteriti-dis E23/pcDNA-TCI, специфически распознавали вирусные белки ВИЧ-1 на стрипах из набора New-Lav-Blot1.

Таким образом, при исследовании иммуногенных свойств ДНК-вакцины, кодирующей ВИЧ-1 поли-эпитопный CTL иммуноген в составе аттенуированного штамма S.enteritidis Е23, получены результаты, которые позволяют сделать следующие выводы.

При иммунизации мышей S.enteritidis E23/ pcDNA-TCI происходит наработка специфических антител, которые связываются как с рекомбинантным белком TCI, так и с нативными белками ВИЧ-1. Эти данные указывают на то, что при ДНК-иммуни-зации происходит экспрессия гена TCI in vivo. Важно отметить, что, являясь полностью искусственным иммуногеном, белок TCI, синтез которого обеспечивает ДНК-вакцина pcDNA-TCI, индуцирует у иммунизированных мышей антитела, которые узнают как рекомбинантные, так и природные антигены ВИЧ-1. Кроме того, при иммунизации S.enteritidis E23/pcDNA-TCI лабораторных животных у них формируется специфический Т-клеточный ответ. По-

*

р55

р40 —*■

р24/25 —■

I

р 18/17 —► -1 ■

I

? ? 7

ABC

Рис. 3. Анализ специфичности сывороток мышей, иммунизированных S.enteritidis E23/pcDNA-TCI, с использованием тест-системы New-Lav-Blot1 (Bio-Rad). А - объединенная сыворотка мышей, иммунизированных S.enteritidis E23/ pcDNA-TCI, получена на 35-е сутки (двукратная иммунизация). В - К+ (положительный контроль - сыворотка ВИЧ-положительного человека из набора New-Lav-Blot1).

С - сыворотка мышей, иммунизированных физраствором

лученные результаты показали, что рекомбинантный штамм S.enteritidis E23/pcDNA-TCI может быть перспективным в качестве системы доставки канди-датной анти-ВИЧ-1 ДНК-вакцины.

ЛИТЕРАТУРА

1. Spearman P. Current progress in development of HIV vaccines // Current. Pharm. Des. - 2006. - Vol. 12, no. 9.

- P. 1147-1167.

2. Hanke T., McMichael A. Pre-clinical development of a multi-CTL epitope-based DNA prime MVA boost vaccine for AIDS // Immunol. Lett. - 1999. - Vol. 66, no. 1-3. -P. 177-181.

3. Suhrbier A. Polyepitope vaccines for the codelivery of multiple CD8+ T cell epitopes // Expert. Rev. Vaccines. - 2002.

- Vol. 1, no. 2. - P 207-213.

4. Bazhan S.I., Belavin PA., Seregin S.V., Daniluyk N.K., Babkina I.N., Karpenko L.I. et al. Desinging and engineering of DNA vaccine construction encoding multiple CTL epitopes of major HIV-1 antigens // Vaccine. - 2004. - Vol. 22, no. 13-14. - P. 1672-1682.

5. Бажан С.И., Белавин П.А., Серегин С.В., Данилюк Н.К., Бабкина И.Н., Карпенко Л.И., Некрасова Н.А., Лебедев Л.Р, Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Ильичев А.А., Сандахчиев Л.С. Конструирование искусственного иммуногена, кандидата ДНК-вакцины, кодирующей множественные CTL-эпитопы ВИЧ-1 // Докл. РАН. - 2004.

- Т. 395. - №6. - С. 825-827.

6. Karpenko L.I., Nekrasova N.A., Ilyichev A.A., Lebedev L.R., Ignatyev G.M., Agafonov A.P et al. Comparative analysis using a mouse model of immunogenicity of artificial VLP and attenuated Salmonella strain carrying a DNA vaccine encoding HIV-1 polyepitope CTL-immunogen // Vaccine.

- 2004. - Vol. 22, no. 13-14. - P. 1692-1699.

7. Darji A., Guzman C.A., Gerstel B., Wachholz P., Timmis K.N., Wehland J., Chakraborty T., Weiss S. Oral somatic transgene vaccination using attenuated S. typhimurium // Cell. - 1997. - Vol. 91. - P. 765-775.

8. Dietrich G., Gentschev I., Hess J., Ulmer J.B., Kaufmann S.H., Goebel W. Delivery of DNA vaccines by attenuated intracellular bacteria // Immunol. Today. - 1999. - V. 20, no. 6.

- P 251-253.

9. Grillot-Courvalin C., Goussard S., Huetz F., Ojcius D.M., Courvalin P. Functional gene transfer from intracellular bacteria to mammalian cells // Nat. Biotechnol. - 1998. -Vol. 16, no. 9. - P. 862-866.

10. Рыжова С.А., Бойченко М.Н. Исследование стабильности авирулентного фенотипа и способности к ограниченной персистенции в организме мышей авиру-лентного мутанта Salmonella enteritidis// Бюлл. экспе-рим. биологии и медицины. - 1997. - №10. - С. 429-431.

11. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. - М: Мир, 1988.

12. Berzofsky J.A., Ahlers J.D., Belyakov I.M.. Strategies for designing and optimizing new generation vaccines // Nat. Rev Immunol. - 2001. - Vol. 1. - P. 209-219.

13. Nabel G.J. HIV vaccine strategies // Vaccine. - 2002. -Vol. 20. - P. 1945-1947.

14. Карпенко Л.И., Некрасова Н.А., Игнатьев Г.М., Агафонов А.П., Проняева Т.Р., Мурашев Б.В., Романович А.Э., Климов Н.А., Козлов А.П., Ильичев А.А. Иммунный ответ при оральной и ректальной иммунизации аттенуированным штаммом сальмонелл, несущим ДНК-вак-цину против ВИЧ-инфекции // Вопросы вирусологии.

- 2003. - №4. - C. 16-20.

IMMUNOGENIC PROPERTIES OF RECOMBINANT ATTENUATED STRAIN SALMONELLA ENTERITIDIS Е23 CARRYING DNA-VACCINE CODING FOR HIV-1 POLYEPITOPE 0TL IMMUNOGEN

A.V. Danilenko, L.I. Karpenko, S.I. Bazhan, Ye.D. Danilenko, O.A. Babenko, A.V. Bateneva, O.N. Kaplina, A.A. Il’ichev

SUMMARY

The recombinant attenuated strain Salmonella enteritidis E23/ pcDNA-TCI which carrying DNA-vaccine containing gene of CTL-polyepitope HIV-1 immunogen under the control of CMV promoter was constructed. The strain was used for perrectal immunizations of BALB/c mice. Detected after immunization in sera of immunized mice HIV-specific antibodies were demonstrated to recognize both recombinant and native HIV-1 antigens. Double immunization was more effective compared to unitary injection. The results obtained showed that recombinant attenuated Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI could be perspective for delivery the candidate HIV-1 DNA vaccine.

Key words: VICH, attenuated salmonella, DNK of vaccine, VICH-1 polyepitopic CTL immunogene.

Поступила в редакцию 28.08.2009 г.