CC BY
130
УДК 616.98:578.898HIV-085.373
А.Н. Чикаев, Н.С. Щербакова, Л.И. Карпенко, С.И. Бажан, Л.Р. Лебедев, А.М. Ерошкин,
А.Б. Рыжиков, А.А. Ильичев
РАЗРАБОТКА ИСКУССТВЕННЫХ ПОЛИЭПИТОПНЫХ В-КЛЕТОЧНЫХ ИММУНОГЕНОВ В КАЧЕСТВЕ ВАКЦИН ПРОТИВ ВИЧ-1
ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (пос. Кольцово, Новосибирская область)
С помощью процедуры биопэнинга из фаговой пептидной библиотеки был селектирован линейный пептид имитатор конформационного эпитопа, узнаваемый широконейтрализующим. моноклональным антителом. (bMab) 2G12. С помощью генно-инженерных манипуляций отобранный пептид VGAFGS-FYRLSVLQS был встроен в состав полиэпитопного белка TBI. Новый белок TBI-2gl2 был выделен из штамма E. coli JM103, несущего экспрессионную плазмиду pTBI-2g12. Продемонстрировано, что очищенный белок TBI-2g12 индуцирует, образование антител, которые связываются с белками ВИЧ-1, с белком. TBIи. синтетическим.пептидом-имитатором, эпитопа bMab2G12. Обсуждаются.возможности используемого подхода для. создания вакцины, против ВИЧ-1.
Ключевые слова: широконейтрализующие антитела 2G12, ВИЧ-1, фаговый дисплей, полиэпитопная вакцина
CONSTRUCTION OF ARTIFICIAL POLYEPITOPE B-CELL IMMUNOGENS AS A HIV-1 VACCINE CANDIDATE
A.N. Chikayev, N.S. Shcherbakova, L.I. Karpenko, S.I. Bazhan, L.R. Lebedev, A.M. Yeroshkin,
A.B. Ryzhikov, A.A. Ilyichiov
Scientific Research Center VB “Vector”, Koltsovo, Novosibirsk Region
Linear peptide mimicking the structure of discontinuous binding sites of broadly neutralizing antibodies 2G12 was selected, from phage peptide library using biopanning procedure. The selected, peptide VGAFGSFYRLSV-LQS was inserted, into the artificial polyepitope protein TBI using genetic engineering manipulations. The new protein TBI-2g12 was isolated, from the E. coli strain JM103 harboringpTBI-2g12 plasmid. It was demonstrated, that the purified. TBI-2g12 induce antibodies that bound to HIV-1 proteins, TBI protein and the synthetic peptide mimotope recognized, by bMab2G12. Thus, recombinant TBI-2g12 protein which, possess antigenicity and. immunogenicity of peptide mimics of 2G12 was obtained. The possibilities of using this approach for vaccine development are being discussed.
Key words: broadly neutralizing antibodies 2G12, HIV-1, phage display library, polyepitope vaccine
ВВЕДЕНИЕ
По данным ВОЗ на 2010 г. распространенность ВИЧ-инфекции среди взрослого населения (15 — 49 лет) в Российской Федерации составляет 1,1 %, при среднем значении в Европейском регионе 0,5 %. Это говорит о необходимости создания новых подходов к разработке эффективных вакцин против ВИЧ инфекции и систем их доставки. Создание вакцины против ВИЧ на основе инактивированного вируса маловероятно из-за сложности получения вакцинных препаратов, свободных от вирусных нуклеиновых кислот [3]. Кроме того, использование цельновирионной вакцины нежелательно из-за того, что отдельные фрагменты белков ВИЧ стимулируют усиление инфекции, вызывая развитие иммунопатологии, приводят к возрастанию количества супрессорных клеток и ингибируют протективный ответ; перекрестно реагируют с белками клеток хозяина и являются потенциальными онкогенами [4],
В настоящее время считается общепризнанным, что вакцина против ВИЧ-1 должна вызывать наработку широко нейтрализующих моноклональных антител, способных нейтрализовать широкий ряд лабораторных штаммов и первичных изолятов ВИЧ-1. Один из наиболее перспективных подходов к созданию нового поколения эффективных
и безопасных вакцин связан с идентификацией T- и B-клеточных эпитопов в вирусных белках и созданием на их основе синтетических полиэпи-топных анти-ВИЧ вакцин. Очевидно, что такие вакцины будут свободны от многих недостатков, свойственных вакцинам, создаваемым на основе нативных белковых субъединиц, аттенуированных и инактивированных патогенов. Подход, основанный на дизайне Т- и В-клеточных иммуногенов, кандидатов для молекулярной полиэпитопной вакцины против ВИЧ-1, развивается в ГНЦ ВБ «Вектор». Было получено несколько полиэпитоп-ных конструкций, одной из которых является четырех-а-спиральный белок-иммуноген TBI (T- and B-cell epitopes contaning immunogen) [2]. Аминокислотная последовательность белка TBI включает четыре Т-клеточных эпитопа и пять В-клеточных нейтрализующих эпитопов из белков envи gag ВИЧ-1 (рис. 1).
Со времени создания первого варианта полиэпитопного белка TBI прошло около 15 лет. За это время появилось много новых данных об антигенной структуре и иммунологической значимости ряда эпитопов ВИЧ-1. На данный момент выделено около десятка нейтрализующих моноклональных антител к ВИЧ-1, обладающих широким спектром действия. К сожалению, эпитопы, узнаваемые
Рис. 1. Структура полиэпитопного белка ТВ1 (Т- и В-клеточный иммуноген). Локализация Т- и В-эпитопов в последовательности белков ВИЧ-1; Т-клеточные эпитопы (область а-спирали) обозначены насыщенным цветом (А, В, С, D); В-клеточные эпитопы - светлым.
этими моноклональными антителами, в большинстве своем имеют конформационную структуру и не могут быть представлены в искусственных иммуногенах. Выход из данной ситуации возможен путем получения линейных пептидов, способных в иммунологическом плане имитировать конформационные эпитопы ВИЧ-1. Уникальные возможности для этого дает технология фагового дисплея, основанная на скрининге рандомизован-ной пептидной фаговой библиотеки. Такая библиотека включает в себя нитчатые бактериофаги, на поверхности которых в составе одного из белков оболочки экспонированы олигопептиды случайного аминокислотного состава. Чужеродный олигопептид, находясь на №конце рекомбинантного белка, располагается на поверхности вириона и доступен для взаимодействия с лигандом. В нашем случае в качестве лиганда выступают широконей-трализующие моноклональные антитела к ВИЧ-1. Использование метода аффинной селекции, включающего в себя инкубирование фаговой библиотеки с клеткой-мишенью и удаление несвязавшихся фагов, позволяет отобрать из фаговой пептидной библиотеки пептиды, соответствующие антигенным детерминантам или имитирующими их по связыванию с антителами.
МЕТОДИКА
Ранее с помощью метода фагового дисплея в нашей лаборатории были получены пептиды-имитаторы конформационного эпитопа, узнаваемого МКА 2G12, и линейного эпитопа, узнаваемого МКА 2Б5 [1]. Было показано, что у мышей и кроликов, иммунизированных этими пептидами, происходит наработка антител, нейтрализующих лабораторные штаммы ВИЧ-1.
Поскольку антитела 2G12 и 2Б5 обладают широкой вируснейтрализующей активностью против различных субтипов вируса [5], несомненно, присутствие в создаваемых вакцинах против ВИЧ-1 эпитопов, способных индуцировать продукцию МКА 2G12 и 2Б5, представляется весьма привлекательным подходом для повышения протективных свойств полиэпитопнго белка TBI.
Для этих целей был проведен синтез олигонуклеотидов, кодирующих пептиды-имитаторы 2F5 и 2G12 эпитопов. Синтезированные олигонуклеотиды встраивали в ген белка TBI по сайтам рестрикции ApaI и Bsp13I с сохранением рамки трансляции. Для работы была использована плазмида pTBI, сконструированная ранее [2]. Данная плазмида несет ген TBI под контролем промотора recA белка Proteus mirabilis. В результате данной встройки участок гена TBI, кодирующий пептид белка p17 ВИЧ-1, был заменен фрагментами, кодирующим пептиды-имитаторы. Причина замены, помимо необходимости использования удобных сайтов рестрикции, заключается еще и в том, что
Рис. 2. Электрофореграмма в 14% ПААГ лизатов клеток Е. Со///тВ|-2д12 до и после фракционирования в растворе мочевины. 1 - лизат клеток Е. Со1//ТВ1-2д12; 2 - то же после фракционирования в растворе мочевины.
р17 является коровым белком вириона, и его удаление не критично для индукции протективных антител против вирусной инфекции.
Полученными в результате клонирования плазмидами были трансформированы клетки Е. соИ ЛМ103. Продукцию химерных белков в бактериальных клетках оценивали с помощью электрофореза в 14 % акриламидном геле. Оказалось, что продукция рекомбинантных белков не превышала 1 % от общей массы клеточных белков. Для повышения выхода целевого белка был проведен ряд экспериментов по оптимизации условий наращивания биомасс Е. соИ, трансформированных полученными плазмидами, а также были оптимизированы условия экстракции и очистки белков. Схема очистки белка включала в себя фракционирование содержимого клеточного материала в неденатурирующих условиях, дробную экстракцию в мочевине (рис. 2) и препаративный гель-ЭФ в ПААГ. В результате были получены гомогенные препараты белков, охарактеризованные с помощью ЭФ, им-муноблоттинга и масс-спектрометрии.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для оценки гуморального иммунного ответа проводили иммунизацию мышей рекомбинантными белками. В качестве контроля производилась иммунизация мышей исходным белком ТВ1.
Сыворотки мышей были проверены с помощью ИФА. В первую очередь было показано, что сыворотки мышей, иммунизированных рекомбинантными белками, также эффективно узнают ТВ1, как и положительный контроль (рис. 3).
Рис. 4. Специфичность сывороток мышей, иммунизированных белком TBI-2g12. 1 - иммунизированные белком TBI-2g12; 2 - иммунизированные исходным вариантом TBI; 3 - неиммунные животные.
Кроме того, при помощи иммуноблота было показано, что рекомбинантный белок при иммунизации вызывает наработку антител к др120 (рис. 5).
Рис. 3. Результаты иммуноферментного анализа сывороток мышей, иммунизированных белком TBI-2g12. 1 - иммунизированные белком TBI-2g12; 2 - иммунизированные исходным вариантом TBI; 3 - неиммунные животные.
В дальнейшем специфичность сывороток оценивали с помощью синтетических пептидов-имитаторов, сорбированных на ИФА планшеты. Из графика видно, что сыворотки мышей, иммунизированных рекомбинантным белком, узнают пептид-имитатор эпитопа, в то время как сыворотки к исходному TBI не узнают (рис. 4).
Рис. 5. Анализ сывороток мышей, иммунизированных белком TBI-2g12, с использованием «New Lav Blot» (Bio-Rad, Франция, 72251 lot 8E1339 Exp. 30-04-2009. 1 - K+ (положительный контроль) из набора; 2 - объединенная сыворотка неиммунных животных; 3 - то же у мышей, иммунизированных TBI-2g 12 (включающем пептид-имитатор 2g12) иммунизированные белком TBI-2g12; 4 - то же у мышей, иммунизированных исходным TBI.
niMiiMiiMiMMin мммммгп □ I i i i i I □ nil iini i
231
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проделанной работы:
1. Были получены генетические конструкции, кодирующие полиэпитопные белки, содержащие пептиды-имитаторы эпитопов ВИЧ-1.
2. Оптимизированы условия наращивания биомассы Е. соїі и оптимизированы условия экстракции и очистки белков.
3. Показано, что иммунизация животных одним из рекомбинантных белков индуцируют образование антител, узнающих исходный ТВІ, петиды-имитаторы и др120 ВИЧ-1.
ЛИТЕРАТУРА
1. Туманова О.Ю. и др. Локализация конфор-мационного эпитопа гликопротеина др120 ВИЧ-1, узнаваемого вируснейтрализующими монокло-
нальными антителами 2G12 // Молекулярная биология. - 2002. - Т. 36, № 4. - С. 1-7.
2. Eroshkin A.M. et al. Design of four-helix bundle protein such as a candidate for HIV vaccine // Prot. Engin. - 1995. - Vol. 24, N 2. - P. 167-173.
3. Girard M.P., Osmanov S.K., Kieny M.P. A review of vaccine and development: The human immunodeficiency virus (HIV) // Vaccine. - 2006. - Vol. 24. N 19. - P. 4062-4081.
4. Letvin N.L. Progress in the development of an HIV-1 vaccine // Science. - 1998. - Vol. 280, N 5371. - P. 1875-1880.
5. Trkola A. et al. Human monoclonal antibody 2G12 defines a distinctive neutralization on the gp120 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 // Journ. Virology. - 1996. - Vol. 70, N 2. -P. 1100-1108.
Сведения об авторах
Чикаев Антон Николаевич - стажер-исследователь отдела иммунотерапевтических препаратов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово, Новосибирская область
Щербакова Надежда Сергеевна - младший научный сотрудник отдела иммунотерапевтических препаратов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово, Новосибирская область
Карпенко Лариса Ивановна - д.б.н., доцент, зав. лабораторией рекомбинантных вакцин отдела иммунотерапевтических препаратов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово, Новосибирская область
Бажан Сергей Иванович - д.б.н. зав. теоретическим отделом ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово, Новосибирская область Лебедев Леонид Рудольфович - к.б.н, старший научный сотрудник ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово, Новосибирская область
Ерошкин Алексей Максимович - д.б.н., зав. отделом биоинформатики в Медицинском научно-исследовательском институте Сэнфорд-Бернем, Ла-Хойа, Калифорния, США
Рыжиков Александр Борисович - к.б.н., зав. отделом ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово, Новосибирская область Ильичев Александр Алексеевич - проф., д.б.н, зав. отделом иммунотерапевтических препаратов ФбУн ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово, Новосибирская область
