CC BY
59
Биология
Вестник Нижегородского универ сите та им. Н.И. Ло бачевско го , 2007, № 1, с. 122-126
УДК 616.921.5:575.191
ИНДУКЦИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУННОГО ОТВЕТА НА ВВЕДЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК, СОДЕРЖАЩЕЙ ГЕН gD ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА
© 2007 г. А.Ю. Козлов 1, В.В. Новиков 1, Р.Р. Климова 2, А.А. Кущ 2,
О.В. Некрасова 3, В.Н. Шингарова 3
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского 2 Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, Москва 3 Институт биоорганической химии им. М. Шемякина и Ю. Овчинникова РАН, Москва
mbre@mail.ru
Поступила в редакцию 22.12.2006
Исследована эффективность ДНК-иммунизации лабораторных мышей плазмидой, несущей ген поверхностного белка gD вируса простого герпеса. Отработана схема иммунизации, обеспечивающая эффективный Т-клеточный и гуморальный ответ. Результаты открывают новые возможности в формировании подходов к созданию ДНК-вакцин для генетической иммунизации.
Вирус простого герпеса (ВПГ) является причиной многих серьезных заболеваний человека, поражая различные органы и ткани организма. Инфекции, вызываемые ВПГ, широко распространены среди населения. Несмотря на имеющиеся противовирусные препараты и терапевтические вакцины, отмечается рост заболеваемости. Используемые в настоящее время вакцины имеют ряд недостатков. Так, вакцины на основе живых аттенуированных вирусов могут вызывать разного рода осложнения, их трудно стандартизировать. Кроме того, существует вероятность мутаций, приводящих к вирулентному фенотипу. Вакцины на основе инактивированного вируса могут приводить к заражению в случае его неполной инактивации. Субъединичные вакцины требуют больших материальных затрат на выделение вирусных белков и их очистку (Шестопалов и др., 2002).
В последние годы все большее внимание исследователей привлекает одно из направлений генной инженерии - генетическая иммунизация (ДНК-иммунизация). Она заключается в том, что определенный ген или участок генома патогена встраивается в бактериальные или вирусные векторы и затем используется для вакцинации. Созданная таким образом ДНК-вакцина потенциально способна индуцировать клеточный и гуморальный иммунный ответ (Encke et al., 1998; Higgins et al., 2000).
Преимущество ДНК-иммунизации состоит в том, что она позволяет избежать риска развития инфекционного процесса после вакцинации живыми, аттенуированными вакцинами. Кроме
того, она обеспечивает посттранскрипционные модификации в эукариотических клетках и корректную презентацию антигена. Одним из существенных преимуществ генетической
иммунизации является возможность создания рекомбинантной ДНК, кодирующей несколько белков с различными функциями или
различного происхождения. ДНК-вакцины
являются генетически стабильными системами, что позволяет создавать оптимальные
конструкции для модуляции иммунного ответа, а в перспективе - вакцины нового поколения.
При создании противовирусных ДНК-вакцин в качестве иммуногенов чаще всего используют гены поверхностных вирусных
белков, содержащих детерминанты,
индуцирующие протективный иммунный ответ. Для ВПГ определено несколько поверхностных гликопротеинов, обладающих иммуногенными свойствами (Sin et al., 1999) и содержащих эпитопы, с которыми могут взаимодействовать вируснейтрализующие антитела. Одним из таких белков является поверхностный
гликопротеин gD ВПГ, который индуцирует образование вируснейтрализующих антител и участвует в проникновении вируса в клетку (Ancel et al., 1998).
Цель настоящей работы состояла в изучении эффективности ДНК-иммунизации мышей плаз-мидной конструкцией, содержащей ген белка gD ВПГ.
Материалы и методы
Для получения генетически
трансформированных клеток, экспрессирующих gD ВПГ, использовали перевиваемую
клеточную линию Уего (клетки почки зеленой Мышей линии БЛЬБ/е иммунизировали мартышки). Для трансфекции клеток плазмидой реВКЛ-3.1(+)/§Б ЫБУ внутримы-использовали плазмиду реОКЛ-3.1(+)/§В ЫБУ, шечно, вводя 100-110 мкг очищенной ДНК.
полученную на основе коммерческой плазмиды реБКЛ-3.1(+) «1пуйго§еп» (США). В нее был встроен ген ВПГ и маркерный ген
неомицин-фосфотрансферазы. Трансфекцию клеток Уего осуществляли стандартным кальций-фосфатным методом. Селекцию трансформантов проводили в культуральной среде, содержащей генетицин 0-418 в концентрации 400 мкг/мл. После трансфекции клетки фиксировали в разные сроки и изучали экспрессию гена при помощи полученных
ранее моноклональных антител к белку методом непрямой имуннофлюоресценции.
Использованы различные схемы иммунизации, описанные далее.
Для оценю Рис. 1. Динамика гуморального а некроза опухо иммуНюго ответо нр ДЖ- л т иммунизацию мышей плазмидой -
по 3 жшкт peDNA-Pji/gD IisV: оСь £1бсЩ1сс - И
группы muvs (.ро1СИ имму-шзации и забора -3-1(+)/gD us крови, недели ; ось ординат - х правой и лево титры а-дидeл, обратило в
основание хво разведения м
вводили ФН( [,
BHуДИИбИЮШИннн. Мышам второй группы
вводили инакдивииованный ВПГ-1 (штамм F) по 50 мкг внудpибиюшинно и через сутки -
ФНО в концентрации 0,1 мкг/мл
внутрибрюшинно. Мыши третьей группы были иммунизированы ВПГ без адъюванта.
Образование анти-ВПГ антител в сыворотке крови иммунизированных мышей изучали методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью тест-системы фирмы «Вектор-Бест». Об активности Т-клеточного иммунитета судили по интенсивности пролиферации
спленоцитов in vitro. Для этого спленоциты выделяли при помощи гомогенизатора, лейкоцитарную фракцию получали с помощью центрифугирования в градиенте фиколл-гипака и помещали в 96-луночные планшеты в концентрации 105 клеток в лунку в среде RPMI-1640, содержащей 10% фетальной сыворотки, 4.5 г/л глюкозы, 3 мМ глутамина, 0,2 ед./мл инсулина и 50 мкг/мл гентамицина. Спленоциты стимулировали in vitro инактивированным ВПГ с инфекционной множественностью (ИМ) 10, 1,0 и 0,1 БОЕ/кл в течение 5 дней при 37°С. В качестве положительного контроля пролиферации использовали конканавалин А (КонА) в
концентрации 5 мкг/мл.
Результаты
Появление первых клонов
трансфицированных клеток было отмечено на третьи сутки после введения чужеродной ДНК и селекции в присутствии G-418. На пятые сутки после трансфекции было получено 35 клонов, из которых 13 (37%) содержали белок gD ВПГ в цитоплазме. На восьмые сутки после трансфекции количество клонов уменьшилось до 20, из них 15 (75%) содержали клетки, экспрессирующие ген gD. На 15-е сутки после трансфекции число генетически
трансформированных клонов уменьшилось до
16, и все оставшиеся клоны продуцировали белок gD (100%). Полученные данные указывают на достаточно стабильную экспрессию гена gD, встроенного в бактериальную плазмиду pcDNA-3.1(+)/gD HSV в генетически трансформированных клетках.
Для изучения клеточного и гуморального иммунного ответа на введение плазмиды было проведено 6 опытов по ДНК-иммунизации, 3 из
которых были наиболее успешными. В первом из этих опытов мышей иммунизировали 5-кратно с интервалом в 14 дней между инъекциями и введением по 100 мкг ДНК внутримышечно. Установлено, что через 1 неделю после пятой иммунизации титр антител к ВПГ в сыворотке крови иммунизированных мышей составлял 1:200. Изучение Т-клеточного ответа показало, что пролиферативная реакция Т-лимфоцитов у мышей, иммунизированных ДНК ВПГ, на инактивированный ВПГ была в 8,6 раз выше, чем у контрольных животных, и в 2,6 раза выше, чем в присутствии КонА.
Для изучения динамики иммунного ответа и выяснения возможности уменьшения количества иммунизаций был проведен следующий опыт. Мышей иммунизировали 1-, 2- и 3-кратно с интервалом в 21 день между введениями ДНК. Плазмиду вводили по 50 мкг в мышцы задних правой и левой лап и по 10 мкг подкожно в основание хвоста. Кровь для изучения гуморального иммунного ответа брали через 1, 2, 3 недели после первой иммунизации, через 1 и 2 недели после второй иммунизации и через 1 и 2 недели после третьей иммунизации. В каждой точке было изучено не менее трех животных. Всего изучено 15 животных. Результаты изучения гуморального ответа представлены на рис. 1. Было показано, что через 3 недели после однократной иммунизации титр антител достигал 1:450. Повторное введение ДНК увеличивало антительный ответ, который характеризовался титром 1:350. Через две недели после третьей иммунизации активность антител не увеличивалась и даже несколько снижалась (титр 1:1050). Изучение
вируснейтрализующей способности антител показало, что сыворотка одной из трех мышей иммунизированных 3-кратно, обладала вируснейтрализующей активностью в разведении 1:40.
Количество бл&СТФВ ма яуыАу
При исследовании Т-клеточного ответа у мышей, иммунизированных ДНК,
предварительно была определена оптимальная ИМ ВПГ для стимуляции пролиферации лимфоцитов, которая составила 1,0 БОЕ/кл. Установлено, что через одну неделю после первой инъекции уровень пролиферативного ответа на ВПГ у иммунизированных ДНК мышей в 2,8 раза превышал контроль, но был ниже, чем ответ на стимуляцию КонА (рис. 2). Через две недели Т-клеточный ответ превышал контрольный уровень в 9,2 раза и был значительно сильнее, чем ответ на КонА. Через три недели пролиферативный ответ Т-клеток снижался до значений, выявленных через 1 неделю после ДНК-иммунизации.
Вторая группа животных была
иммунизирована двукратно с интервалом в 3 недели между инъекциями. Т-клеточный ответ был исследован через 14 дней после второй иммунизации. После второй инъекции ДНК Т-клеточный ответ в группе животных, иммунизированных плазмидой, в 4,4 раза превышал контроль и не уступал
пролиферативному ответу на КонА.
Третья группа животных была
иммунизирована трехкратно с интервалом в 3 недели между инъекциями. Т-клеточный ответ оценивался через 2 недели после третьего введения ДНК. Уровень Т-клеточного ответа достоверно не превышал нормы, тогда как ответ на КонА сохранялся на достаточно высоком среднем уровне.
В связи с имеющимися данными об иммуностимулирующих свойствах ФНО (ВеиЙег еі а1., 1985) представляло интерес изучить его действие на эффективность иммунизации животных. Сравнивали влияние ФНО на иммунный ответ животных, иммунизированных инактивированным ВПГ и ДНК ВПГ. Для этого мышам,
Рис. 3. Влияние ФНО на пролиферативный ответ Т-лимфоцитов мышей, иммунизированных ДНК или ВПГ. По оси ординат - среднее количество бластов в лунке. По оси абсцисс - группы животных: 1 -контрольная группа (не иммунизированные животные);
2 - иммунизация ДНК gD ВПГ; 3 - иммунизация ДНК gD ВПГ + ФНО; 4 - иммунизация ВпГ; 5 -иммунизация ВПГ + ФНО. Иммунизацию во всех группах животных проводили однократно и анализировали Т-клеточный ответ через две недели после инъекции. ☆ - р < 0.05
иммунизированным ДНК или ВПГ, через сутки после иммунизации вводили рекомбинантный ФНО в концентрации 0,1 мкг на животное (Апсеї еі а1., 1998).
Введение ФНО мышам, однократно
иммунизированным ДНК, не влияло на гуморальный иммунный ответ, который оставался низким и характеризовался титром 1:100. Титр антител у животных, иммунизированных ВПГ в сочетании с ФНО, в
2 раза превышал титр антител у мышей, иммунизированных только ВПГ, и был равен 1:12 800.
Результаты изучения Т-клеточного ответа мышей исследованных групп представлены на рис. 3. Видно, что различия в уровнях Т-кле-точного ответа на ВПГ при иммунизации мышей только ДНК и ДНК в сочетании с ФНО незначительны. Совместное введение ВПГ и ФНО усиливало Т-клеточный ответ в 4,3 раза. Следует отметить, что после однократного введения инактивированного вируса Т-клеточный ответ был низким и практически не отличался от пролиферативного ответа неиммунизированных животных. Введение ФНО повышало Т-клеточный ответ, однако он не достигал уровня ДНК-иммунизированных животных.
Обсуждение
Иммунизация инактивированным вирусом или вирусными белками индуцирует высокий уровень специфических антител (АТ), но в большинстве случаев вызывает слабый Т-клеточный ответ. Эта закономерность нашла подтверждение в наших опытах по иммунизации мышей инактивированным ВПГ-
1. Титр антител после однократного введения составил 1:6400, тогда как пролиферативный ответ
Т-клеток достоверно не отличался от контрольных, неиммунизированных
животных. При ВПГ-инфекции не обнаружено корреляции между уровнем
антителообразования и протективной активностью, высокого АТ ответа недостаточно для клиренса вируса. В то же время известно, что АТ могут частично ограничивать установление латенции и в некоторой степени защищать от первичной ВПГ-инфекции. В связи с этим важная роль при создании вакцин против ВПГ-инфекции отводится поискам иммуногенов, способных индуцировать Т-кле-точный ответ.
Oсновываясь на результатах проведенных экспериментов, можно заключить, что ДНК-им-мунизация приводит к индукции как гуморального, так и Т-клеточного иммунитета, при этом Т-клеточный ответ выражен значительно сильнее. Эти данные согласуются с результатами других исследователей, согласно которым ДНК-иммунизация более эффективно индуцирует Т-хелперный ответ 1 типа в сравнении с Th2 ответом (Sin et al., 1999). Длительные схемы иммунизации (4—5 инъекций ДНК) на порядок усиливали клеточный ответ. Полученные данные находятся в соответствии с результатами работы T. J. Higgins et al. (2000). Oднако применение таких схем на практике не отвечает требованиям, предъявляемым к современным вакцинам. Для ДНК-вакцин многократное введение опасно еще и тем, что оно индуцирует образование аутоантител к вводимой чужеродной ДНК.
В связи с этим нами была изучена динамика формирования иммунного ответа на ДНК-вакцинацию и проведен поиск коротких схем иммунизации.
Установлено, что максимальный уровень Т-клеточного ответа наблюдался через две недели после первой иммунизации, затем происходило его постепенное снижение. Повторная иммунизация усиливала клеточный ответ, однако третье введение ДНК gD не оказывало стимулирующего эффекта. Формирование наибольшего уровня
гуморального иммунного ответа наблюдалось позднее. Максимальные уровни антител к ВПГ наблюдались через 2 недели после второй иммунизации ДНК. Аналогичные данные были получены недавно E. Jennifer et al. (2001) в отношении белка gB ВПГ. Таким образом, оптимальные результаты получены при использовании схемы иммунизации, состоящей из двух инъекций с интервалом в 14 дней и при введении ДНК подкожно и внутримышечно одновременно. Указанная схема позволяет достичь максимального уровня как гуморального, так и клеточного иммунного ответа.
Представляется возможным
комбинированное применение ДНК-вакцин с вакцинами на основе инактивированных вирусов, или иммунными адъювантами. ФНO принимает участие в регуляции иммунного ответа, повышая активность макрофагов, усиливая индуцированную антигеном пролиферацию и дифференцировку Т-клеток (Panzer et al., 1993). В наших опытах было установлено, что ФНO усиливает
иммуностимулирующее действие
инактивированного вируса, повышая при этом уровень Т- и В-клеточного иммунного ответа. Такого влияния ФНО на ДНК-иммунизацию выявлено не было. Одно из возможных объяснений: отсутствие эффекта кроется в неоптимальной схеме применения ФНО.
Действительно, в наших опытах было
продемонстрировано, что экспрессия gD ВПГ в трансфицированных клетках наблюдается, начиная с 3 дня после трансфекции. Это принципиально сходно с результатами авторов, которые показали, что после введения плазмиды, содержащей ген gD ВПГ, максимальная экспрессия белка gD
наблюдалась в клетках иммунизированных
мышей Balb\c через 3 дня (Cruz et al., 1999). Возможно, введение ФНО через 1 день после ДНК-иммунизации - неоптимальный срок для проявления иммуностимулирующей активности данного цитокина.
Суммируя полученные результаты, можно заключить, что показана эффективность использования ДНК-плазмиды, содержащей ген gD ВПГ, в активации клеточного иммунного ответа. Полученные результаты открывают новые возможности в формировании подходов к созданию ДНК-вакцин для генетической иммунизации, способной стимулировать как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ.
Список литературы
1. Шестопалов А.М., Рассадкин Ю.Н., Устинова Е.Н. и др. Влияние фактора некроза опухоли а на эффективность вакцинации против бешенства // Вопросы вирусологии. 2002. № 3. С. 37-40.
2. Ancel H., Westra D.F., Wellingwester S. Induction of interferon-alpha by glycoprotein D of Herpes simplex virus - a possible role of chemokine receptor // Virology. 1998. V. 257. P. 317-326.
3. Beutler B., Milsark J. W., Cerami A. Cachectine / tumor necrosis factor: production, distribution, and metabolic fate in vivo // J. Immunol. 1985. V. 135. P. 3972-3977.
4. Cruz P.E., Khalil P.L., Dryden T.D. et al. A novel immunization method to induce cytotoxic T-lymphocyte responses (CTL) against plasmid-encoded Herpes simplex virus type-1 glycoprotein D // Vaccine. 1999. V.
17. P. 1091-1099.
5. Encke J., Putlitz J., Geissler M. Genetic
immunization generates cellular and humoral immune responses against the nonstructural protein of the hepatitis C virus in murine model // J. Immunol. 1998. V. 161.
P. 4917-4923.
6. Higgins T.J., Herold K.M. et al. Plasmid DNA-expressed secreted and nonsecreted forms of herpes simplex virus glycoprotein D2 induce different types of
immune responses // J. Infect. Diseases. 2000. V. 182. P. 1311-1320.
7. Jennifer E., Loomis-Huff R. et al. Immunogenicity of a DNA vaccine against herpes B virus in mice and rhesus macaques // Vaccine. 2001. V. 19. P. 4865-4873.
8. Panzer S., Madden M., Matsuki K. Interaction of IL-6P, IL-6 and tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) in human T-cells activated by murine antigens // Clin. Exp. Immunol. 1993. V. 93. P. 471-478.
9. Sin J.I., Ayavo V., Boyer J. et al. Protective immune correlates can segregate by vaccine type in a murine herpes model system // Int. Immunology. 1999. V. 11. P. 1763-1773. 322. P. 681-692.
DUCTION OF A SPECIFIC IMMUNE RESPONSE ON RECOMBINANT DNA CONTAINING THE GENE OF HERPES SIMPLEX VIRUS SURFACE gD PROTEIN
A. Yu. Kozlov, V. V. Novikov, R.R. Klimova, A.A. Kushch,
O. V. Nekrasova, V.N. Shingarova
We study the effectivity of DNA immunization of mice by a plasmid containing the gene of herpes simplex us surface gD protein. The immunization protocol inducing the effective cell and humoral response is veloped. The results open new ways for DNA vaccine construction.
