CC BY
6
Таблица 1
Зависимость длин воли максимумов спектров поглощения и МКП ФДА от
Растворитель Е"Т МКП
экспериментальные расчетные
Волна 1,0 306 307 920
Бутанол-1 0,602 340 341 990
Пропанол-2 0,546 350 346 630
ДМСО 0,444 362 355 1050
ДМФА 0,404 364 358 1230
Ацетон 0,355 350 363 340
Хлороформ 0,259 370 371 410
Этилацетат 0,228 372 374 1180
Диоксан 0,164 382 380 870
Бензол 0,111 384 384 510
78
77
Для этого в мерные колбы на 25 мл вносят аликвоту ФДА определенной величины, добавляют 10,0 мл 20% раствора уксуснокислого натрия, 1,0 мл 0,01 М раствора диазотированного анилина и доводят водой до метки. Полученный раствор ярко-желтой окраски фотометри-руют через 10— 15 мин при 400 нм в 1 -сантиметровых кюветах относительно воды. Длина волны соответствует максимуму спектра поглощения образовавшегося окрашенного соединения.
Анализируя результаты, приведенные в табл. 2, следует отметить, что природа растворителей (из числа принятых за оптимальные) не очень существенно влияет на чувствительность спектрофотометрического определения ФДА и одного порядка с фотометрическим определением по реакции азосочетания. Однако воспроизводимость определений существенно выше (величина 5Г). Кроме того, к преимуществам спектрофотометрического определения следует отнести простоту, ликвидацию многостадийности и необходимости в реактивах (например, нитрита натрия, анилина или других аминов или фенолов, кислоты для поддержания среды, реактивов для устранения избытка нитрата натрия), нет необходимости жесткого соблюдения среды, температуры.
При спектрофотометрическом определении ФДА в диоксане было проверено мешающее влияние исходного вещества при синтезе ФДФ п-нитроанилина. Было найдено, что п-нитроанилин в количествах до 15% не мешает определению ФДА.
Ход анализа. Навеску пробы массой 25,00 мг вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворяют в лю-
Таблица 2
Метрологические характеристики определения ФДА в разных растворителях (л = 5, Р = 0,95)
Интервал оп- Введено, мкг/мл
Раствори- Уравнение ределяемых Найдено, S.
тель ГГ концентраций, мкг/мл мкг/мл
Вода
ДМФА
ДМСО
А = 0.008 с А = 0.012 с
1,5-100
,6-100
А = 0.01 с 0,8-100
Этилацетат А = 0,011 с 0,6-100
Бутанол А = 0,02+ 1,5—100 + 0,009 с
5,00 28,50 6,00 32,55 10,00 43,50 10,00 55,50 6,50 34,65
4.88 ± 28,24 ±
5.89 ± 32,37 ±
9,76 ± 43,23 ± 9,78 ± 54,22 ± 6,26 ± 34,20 ±
По реакции образования азосоединения, МКП :
Вода А = 0,014 с 0,8-100 3,70 3,39 ±
32,00 27,31 ±
0,18 0,31 0,18 0,21 0,25 0,30 0,24 0,40 0,34 0,45 = 1480
0,31 0 0,76 0
02 ,01 ,01 ,01 ,02 ,01 ,02 01 ,02 ,01
,04 ,02
бом из 5 растворителей (см. табл. 2). Апиквотную часть (1,00 мл) помещают в градуированную пробирку и разбавляют растворителем до объема 10,00 мл. Раствор фо-тометрируют при оптимальной для данного растворителя длине волны в 1-сантиметровой кювете относительно чистого растворителя. По измеренной оптической плотности, пользуясь уравнением трассировочного графика для данного растворителя, находят концентрацию ФДА и проводят расчет его содержания в пробе с учетом произведенных разбавлений.
Литература
1. Ивахненко П. Н., Левшчна Н. И. // Журн. аналит. химии. - 1980. - Т. 35, № 2. - С. 354-358.
2. Исаев Р. Н., Капелькшю Е. Н. // Заводская лаб. — 1992. - Т. 58, № 12. - С. 22-23.
3. Исаев Р. Н., Жуковский А. В. // Журн. аналит. химии. - 1995. - Т. 50, № 11. - С. 1146-1149.
4. Исаев Р. И., Дмитриев В. А. // Заводская лаб. — 1995. - Т. 61, № 9. - С. 9-11.
5. Коренман И. М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений. — М., 1975.
6. Райхардт К. Растворители и эффекты среды в органической химии. — М., 1991.
7. Свердлова О. В. Электронные спектры в органической химии. — Л., 1985.
8. Чернова Р. К., Русакова Н. Н. и др. А. с. 1800331 РФ // Открытия. - 1993. - № 9. - С. 1325.
Поступила 05.02.98
® КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ. 1999 УДК 613.632-078.33
Н. В. Русаков, И. П. Павлова, Е. В. Русакова
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНЗИМОВ САВИНАЗЫ И КАРЕЗИМА В ВОЗДУХЕ
НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А. Н. Сысина, РАМН, Москва
В последние годы отмечается тенденция использования в отечественных лабораториях методов, приборного оборудования, тест-систем различных иностранных фирм. В некоторых инструкциях на методы дается указание, что все исследования должны проводиться только на приборах и реактивах, в них представленных. В лабораториях контролирующих органов может не оказаться такого оснащения, однако оно может быть аналогичным, но других фирм. В связи с чем необходима апробация ме-
тодов, предлагаемых иностранными фирмами, с учетом специфики условий российских лабораторий. Целью настоящей работы являлась апробация иммуноферментно-го метода для определения карезима и савиназы.
В процессе производства моющих средств используются энзимы: савиназа и карезим, которые могут попадать в воздух рабочей зоны. Для контроля за их содержанием предложены инструкция "Энзимы, содержащиеся в воздушной пыли" и метод ELISA на русском языке. В со-
ответствии с этой инструкцией пробы воздуха собирают на фильтрах из стекловолокна. Энзим смывают с фильтров буферным раствором на водной основе. После фильтрования водную буферную вытяжку анализируют с помощью иммуноферментного метода на количественное содержание в ней энзимов. Исследуемые растворы сравнивают со стандартными пробами энзимов известной концентрации.
Иммуноферментный анализ (ИФА) ELISA достаточно широко в настоящее время применяется в России для индикации возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы [1—3]. Однако он не использовался еще для количественного определения энзимов в воздухе рабочей зоны и соответственно нет отечественных тест-систем для этого метода исследования. В связи с этим важно было также апробировать новые диагностические иммуноферментные тест-системы и приобретаемые у иностранных фирм реагенты для постановки ИФА.
В качестве реагентов были использованы:
1. Энзимы: савиназа — сухой порошок; содержание белка 1,78%; карезим — сухой порошок; содержание белка 1,56%.
2. Специфические кроличьи антитела для адсорбции на планшет: против савиназы, жидкие, рабочее разведение 1:1000; против карезима, жидкие, рабочее разведение 1:1000.
3. Специфические антитела морской свинки (против савиназы и карезима соответственно) — жидкие, рабочее разведение 1:1000.
4. Конъюгат фирмы "Dako", cat.N Р141 — антитела кроличьи против иммуноглобулинов морской свинки, меченные пероксидазой хрена, — жидкий, рабочее разведение 1:1000.
5. Субстрат — ортофенилендиамин (ОФД) фирмы "Sigma" — таблетка 15 мг, растворяется в 45 мл субстратного буфера.
6. Планшеты для иммунологических реакций фирмы "Nunc", сертифицированные.
Кроме того, в работе использованы буферные растворы, приготовленные по прописям, представленным в инструкции, а также следующее приборное обеспечение (все фирмы "Labsystems"), которое в ней не рекомендовалось: встряхиватель—инкубатор пластин IEMS, промывное устройство IEMS, полуавтоматические пипетки с вариабельным объемом 5—40 и 50—200 мкл, многоканальная пипетка с вариабельным объемом 50—200 мкл, вертикальный фотометр IEMS.
Во время испытаний проводилась проверка специфичности, чувствительности, воспроизводимости результатов. Для определения энзимов был апробирован вариант двойного сандвича твердофазного ИФА.
Постановку ИФА осуществляли с учетом рекомендаций в соответствии с предоставленной инструкцией. Проведение реакции включало 6 этапов:
I этап — иммобилизация специфических антител на планшеты. В лунки планшет вносили по 200 мкл специфических антител в разведении 1:1000 в карбонатном буфере pH 9,6. Время сорбции антител 16—18 ч при 6—8°С.
II этап — блокировка свободных связей на полистироле. В лунки планшет вносили по 200 мкл 2% раствора бычьего сывороточного альбумина в промывочном буфере. Инкубация 1 ч при постоянном встряхивании при-37°С.
III этап — реакция антитело—антиген—антитело. В лунки планшет вносили по 50 мкл стандартных растворов фермента или анализируемых проб и сразу добавляли по 50 мкл специфических (против соответствующих ферментов) антител морской свинки. Инкубация 1 ч при постоянном встряхивании при 37°С.
IV этап — реакция иммунный комплекс (антитело-антиген—антитело) + антивидовой (против второго специфического антитела) конъюгат. Инкубация 1 ч при постоянном встряхивании при 37°С.
После I—IV этапов планшеты промывали промывочным буфером трижды.
Рабочие стандарты энзимов для построения калибровочной крнвой
Стандарт
Объем разведенного стандарта, мл
Объем буфера в пробе, мл
0,0 0,5 1,0 2,0 4.0 6,0 8,0 10,0
10.0 9.5 9.0 8.0 6.0 4.0 2.0 0,0
V этап — ферментативная реакция — выявление связавшейся пероксидазы (см. таблицу). Во все лунки планшета вносили по 100 мкл субстрат-индикаторного раствора (ОФД в 45 мл субстратного буфера с перекисью водорода). Реакция проводится в динамическом режиме. Инкубация по рекомендации инструкции при 37°С при постоянном встряхивании до появления окрашивания в лунке со стандартом 2. Это время при определении савиназы ориентировочно составило 2 мин, а карезима — 10 мин.
Столь короткий временной период проведения ферментативной реакции неудобен, особенно при одновременном исследовании большого количества проб (несколько планшетов). Поэтому при проведении данных испытаний режим на этом этапе был изменен на инкубацию при комнатной температуре в темноте в течение 20—30 мин.
VI этап — остановка ферментативной реакции. Реакцию останавливали добавлением 150 мкл 1 М раствора серной кислоты.
Учет результатов анализа проводили фотометрирова-нием планшета при длине волны 492 нм. Калибровочные кривые построены в линейной системе координат.
Разбавленный стандарт энзима готовили разведением концентрированного раствора в 200 раз в буфере пробы. С целью оценки воспроизводимости результатов постановку стандартных образцов дублировали.
Результаты исследования стандартного образца показали, что зависимость оптической плотности (ОД) от концентрации фермента носит линейный характер. Профиль (наклон) кривых, полученных в разных опытах, полностью совпадает, что свидетельствует о хорошей воспроизводимости результатов. В лунках, заполненных при постановке анализа пробами с неспецифическими компонентами (PBS, раствор трипсина 10 ед/мл, образцы сывороток людей и животных), неспецифических реакций не наблюдали. Различия в значениях поглощения в параллельных лунках находились в допустимых пределах. Неспецифическая сорбция конъюгата на полистирол практически отсутствует, что свидетельствует о высоком качестве иммуносорбента (лунки с иммобилизованными специфическими антителами) и иммунохимической чистоте конъюгата.
Представленные данные свидетельствуют о высоком качестве иммунореагентов тест-системы, обеспечивающих высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов исследования.
Однако необходимо отметить ряд недостатков, относящихся в основном к инструкции. Известно, что ОД поглощения субстрат-индикаторного раствора — величина вариабельная и зависит от многих факторов, в том числе от времени и условий инкубации. По-видимому, для стандартизации этих параметров разработчики предлагают этот этап анализа проводить при 37°С в термостате-встряхивателе. Время проведения ферментативной реакции практически не лимитируется, рекомендовано ориентировочное время от 2 до 10 мин для различных энзимов, советуя полагаться на визуальную оценку интенсивности окраски высшего стандарта, окончательная
абсорбция (коэффициент поглощения) которого должна быть в интервале 1,0—1,5.
На наш взгляд, нецелесообразно ускорение ферментативной реакции за счет встряхивания и повышения температуры, так как при исследовании большого количества образцов (несколько планшетов) это создает технические трудности. Необходимо иметь значительный опыт для точного визуального определения коэффициента поглощения в интервале (1,0—1,5), что вносит элементы субъективизма. Проще ориентироваться на меньшую концентрацию (стандарт 2) для обеспечения максимальной чувствительности метода. Произвольный выбор времени проведения ферментативной реакции антигенов может привести к снижению чувствительности метода, что особенно может проявиться при ошибке в приготовлении стандартных образцов (увеличение концентрации стандарта). Из сказанного вытекает вывод о необходимости уточнения времени проведения ферментативной реакции и, возможно, ввести диапазон значений ОД для наименьшей концентрации стандарта (стандарт 2) с целыо недопущения ошибок при приготовлении стандарта (неправильная первичная навеска, ошибка в дальнейших разведениях). При отсутствии стабильного стандартного образца желательно введение внутреннего контроля реакции.
Выводы. 1. Применяемые при постановке ИФА для определения энзимов савиназы и карезима в воздухе
производственных помещений иммунореагенты (иммуноглобулин для сорбции на планшет, специфические антитела, конъюгат антител) обеспечивают высокую чувствительность, специфичность результатов.
2. Для контроля проведения реакции, получения воспроизводимых результатов в условиях производственной лаборатории, необходимо внести ряд уточнений в инструкцию, в частности лимитировать условия проведения заключительного этапа (ферментативной реакции) ИФА.
3. В целях стандартизации метода необходимо предусмотреть введение внутреннего контроля реакции.
Литература
1. Кашлвева Т. К., Русакова Е. В., Иванова М. 10. Ц Болгаро-советский симпозиум по вирусным инфекциям, 1-й: Материалы. — Варна, 1990. — С. 222— 223.
2. Тартаковский И. С., Радченко О. В., Русакова Е. В. и др. // Журн. микробиол. — 1988. — № 5. — С. 79-81.
3. Хардина А. А., Лапаева И. А., Русакова Е. В. // Иммунопрофилактика детских инфекций. — Алма-Ата, 1988. - С. 84-86.
Поступила 23.03.98
© Н. В. САНЯГИНА. Б. В. СУЛЬДИН, 1999 УДК 614.771/.777:546.811]-(Г74
Н. А. Санягина, Б. В. Сульдин
О МЕТОДАХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ ТРИБУТИЛОЛОВА В ВОДЕ И ПОЧВЕ
Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарева, Саранск
Соединения трибутилолова находят применение в металлоорганическом синтезе, в качестве антиоксидан-тов синтетического каучука и долгое время использовались как биоциды в виде 0,1% и 0,2% растворов и про-тивообрастающие средства [1, 5]. Применяемые соединения трибутилолова (трибутилоловонитрат — ТБОН, трибутилоловоацетат — ТБОА, бис-трибутилолово (оксид) — ТБТО, трибутилоловохлорид — ТБОХ) характеризуются низкой растворимостью в водных и почвенных растворах [3], а в качестве основного продукта их разложения обнаружен токсичный ТБТО, загрязняющий аг-роландшафты. Предельно допустимая концентрация соединений трибутилолова в воде 0,1—0,2 мг/л, в почве 1 — 2 мг/кг [4].
Соединения этого класса металлоорганических соединений вследствие низкой растворимости в воде и прочной связи с почвенно-поглощающим комплексом трудно экс-
Таблица 1
Оценка правильности и воспроизводимости результатов определения соединений трибутилолова в воде различными методами анализа
Соединение Метод анализа Введено, мг/л Найдено, мг/л
ТБОХ Фотоколориметрический 50,0 34,0 ± 16,0 0,10
Электрохимический 1,0 0,8 ± 0,2 0,04
ГЖХ 37,0 34,0 ± 3,0 0,03
ТБОА Фотоколориметрический 40,0 35,0 ± 5,0 0,10
Электрохимический 1,0 0,8 ± 0,2 0,04
ГЖХ 110,0 72,0 ± 28,0 0,03
ТБОН Фотоколориметрический 50,0 42,6 ± 7,4 0,10
Электрохимический 60,0 54,3 ± 5,7 0,04
ГЖХ 40,0 34,7 ± 5,3 0,03
трагируются и анализируются. Для их определения необходимо применять различные методы анализа |5, 6].
Цель работы — оценка методов анализа соединений трибутилолова в воде и почве.
Для анализа использовали фотометрический метод с применением в качестве реагента на олово (IV) 3,5,7-триоксифенилфлуорона, дитизона, электрохимический метод, основанный на измерении их электропроводности, газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с детектором по захвату электронов. Степень конверсии ТБОХ из водного раствора составляет 80—90%, трибутилоловогидри-да за счет легкости его разложения — 17—22%. Правильность и воспроизводимость методик анализа оценивали методом "введено—найдено". Относительное стандартное отклонение (5Г) отдельного результата рассчитывали статистическими методами, применяемыми в аналитической химии [2]. Результаты, характеризующие оценку правильности и воспроизводимости методов определения оловоорганических соединений в воде и почве, приведены в табл. 1 и 2.
Таблица 2
Оценка правильности и воспроизводимости результатов определения остаточных количеств соединений трибутилолова в почве различными методами анализа
Соединение Метод анализа Введено, мг/кг Найдено, мг/кг •У,
ТБОХ Фотоколориметрический 200,0 2,0 0,10
ГЖХ 1200,0 102,0 0,03
ТБОА Фотоколориметрический 40,0 38,0 0,04
ГЖХ 52,0 0,7 0,03
ТБОН Фотоколориметрический 300,0 15,0 0,10
ГЖХ 1320,0 112.0 0,03
