CC BY
43УДК 619.615.9
ПРИМЕНЕНИЕ КОНЪЮГАТА Т-2 ТОКСИНА С ПОЛИЛИЗИНОМ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ Т-2 ТОКСИНА В КОНКУРЕНТНОМ ИФА
Н.Н.Мишина - кандидат биологических наук, ст.н.с.; Э.И.Семёнов - кандидат биологических наук, зав. лабораторией; К.Х.Папуниди - доктор ветеринарных наук, профессор; зам. директора по НИР.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420075, г.Казань, Научныйгородок-2, тел.+7(843) 239-53-20, e-mail: vnivi@mail.ru).
Цель исследований - испытание возможности использования конъюгата Т-2 токсина с полилизином для обнаружения Т-2 токсина в ИФА. Были синтезированы конъюгаты Т-2 токсина с высокомолекулярными носителями - бычьим сывороточным альбумином и полилизином. Провели иммунизацию кроликов по одинаковой схеме, сенсибилизацию планшет и постановку ИФА проводили в одинаковых условиях для обоих конъюгатов. Установили, что конъюгат Т-2 токсина с полилизином в испытанных условиях эксперимента не может использоваться в качестве сенсибилизируемого антигена на планшетах. Конъюгат Т-2 токсина с полилизином обладает высокой иммуноген-ностью и может использоваться для получения специфических поликлональных антител к Т-2 токсину. Показано, что при сравнительном исследовании конъюгата Т-2 токсина с полилизином и конъюгата Т-2 токсина с бычьим сывороточным альбумином в одинаковых условиях эксперимента, конъюгат Т-2 токсина с полилизином обладает большей иммуногенностью (титр 1:500000). При постановке ИФА со специфической сывороткой рабочий диапазон был шире и чувствительность выше, чем со специфической сывороткой к Т-2-БСА. Иммунизация животных конъюгатом Т-2 токсина с полилизином не требует дополнительной очистки специфической сыворотки.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Т-2 токсин, полилизин, конъюгат, ИФА.
Микотоксины - это вторичные, низкомолекулярные метаболиты микроскопических плесневых грибов, обладающие выраженными токсическими, канцерогенными, мутагенными, эмбриоток-сическими, иммуносупресивными свойствами [1, 2].
Проблема зараженности микотоксинами приобрела глобальный характер. Она находится в центре внимания таких авторитетных международных организаций, как Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ), Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН (ФАО), Программа ООН по окружающей среде (ЮНЕП), Международное агентство по исследованию рака (МАИР) и др.
Микотоксины вызывают отравления животных, снижение продуктивности, воспроизводства, а через продукты животноводства и растениеводства могут представлять угрозу для населения[3, 4, 5]. В различной литературе отмечается возможность использования микотоксинов и в диверсионных целях [6].
Т-2 токсин - один из представителей многочисленной группы трихотеценовых микотоксинов, обладающий сильнейшим токсическим действием [7]. Распространен в природе, особенно в средней полосе Российской Федерации, где наиболее благоприятные климато-географические условия для развития основного гриба-продуцента Т-2 токсина [8].
Ввиду большой распространенности Т-2 токсина и его высокой токсичности необходим постоянный контроль продовольствия и кормов на содержание опасного контаминанта. В настоящее время в России регламентированы различные методы индикации ми-
котоксна Т-2. Хроматографические методы (ТСХ, ГЖХ, ХМ-МС), несмотря на свою точность, имеют ряд существенных недостатков - длительная и сложная подготовка, необходимость дорогостоящего оборудования и высокой квалификации специалиста, невозможность использования для быстрого скрининга. Поэтому для большинства лабораторий удобно использование метода иммуноферментного анализа.
Иммуноферментный анализ является одним из наиболее активно развивающихся направлений химической энзимологии, как в нашей стране, так и за рубежом. Это обусловлено тем, что в ИФА уникальная специфичность иммунохимического анализа сочетается с высокой чувствительностью детекции ферментативной метки. Методы ИФА классифицируются по типу реагентов, используемых на первой стадии анализа - конкурентные и неконкурентные [9].
Для определения микотоксинов подходит только конкурентный формат, потому что они являются низкомолекулярными соединениями, которые имеют только один центр связывания с антителами. Поэтому с другими антителами низкомолекулярный антиген связаться не может. Неконкурентный формат для определения микотоксинов не приемлем[10]. Исследования по обнаружению микотоксина Т-2 различными вариантами твердофазного иммуноферментного анализа проводились и отечественными авторами [11].
В России (СССР) первыми разработчиками метода ИФА для индикации микотоксинов были сотрудники ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (в 1987 г. «ВНИВИ»), добившиеся чувствительности метода на уровне 1,0 - 2,0 мкг/кг
ЕГЕПШАРНЫЙ
Врач
корма [12]. Однако распад Советского Союза, отдалил широкое внедрение метода, были утеряны научные кадры. Затем в 1999 в ВНИИВСГЭ был вновь разработан ИФА метод определения Т-2 токсина, разработчикам удалось добиться чувствительности 30 мкг/кг [13]. Тем не менее, исследования по усовершенствованию им-мунохимических методов определения микотоксинов продолжаются [14]. Одним из основных аналитических компонентов постановки методов являются антигены -конъюгаты низкомолекулярных микотоксинов с высокомолекулярными носителями.
Цель исследований - испытание возможности использования конъюгата Т-2 токсина с полилизином для обнаружения Т-2 токсина в ИФА.
Материалы и методы. Для исследований использовали кристаллический Т-2 токсин предварительно полученный нами в лаборатории микотоксинов ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» из субстрата инокулированного ток-сигенным штаммом. В качестве гриба продуцента использовали штамм Fusarium sporotrichioides 2m15 предоставленный д.в.н. А.Н.Котиком. Экстракт фунгальной массы очищали колоночной хроматографией по методике описанной в [15]. Завершающую очистку токсина проводили с помощью препаративной хроматографии.
Конъюгаты гемисукцината Т-2 (ГС-Т-2) с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и полилизином (ПЛ) для исследований любезно предоставлены к.х.н. Т.И.Новожиловой. Синтез гемисукцината Т-2 (ГС-Т-2) с целью введения в молекулу гаптена карбоксильной группы проводился согласно описанной ранее и широко используемой в иммунохимии методике [16]. Синтез конъюгатов ГС-Т-2 с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и полилизином (ПЛ) был проведен с использованием метода активированных эфиров [17], который широко применяется при создании иммунореагентов [18].
Для получения специфических сывороток проводили иммунизацию лабораторных животных. Беспородных кроликов массой 2,5-3,5 кг иммунизировали 300 мкг конъюгата Т-2-БСА в 1 мл стерильного раствора Рингера, смешанного с 1 мл полного адъюванта Фрейнда. Эту эмульсию (2 мл) вводили внутрикожно вдоль выбритой спины кролика (точечные внутрикож-ные инъекции), остатки в шприце вводили внутримышечно в бедро и затем иммунизировали через 3, 6, 9 и 12 недель с неполным адъювантом Фрейнда. Активность гипериммунных сывороток крови кроликов оценивали в непрямом твердофазном варианте ИФА. Подобная схема иммунизации была взята и для иммунизации кроликов конъюгатом Т-2-ПЛ.
Полученные поликлональные антитела далее осаждали насыщенным раствором сульфата аммония и очищали с помощью диализа. Сыворотки, полученные от животных иммунизированных конъюгатом Т-2-БСА, истощали к БСА. Для чего БСА (400 мг) растворяли в 10
мл 0,2 М ацетатного буфера с рН 5,0 и при перемешивании добавляли по каплям 2,5%-ный раствор глута-рового альдегида (2 мл). Для гелеобразования смесь оставляли при комнатной температуре на 3 часа. Полученный таким образом иммуносорбент суспендировали и промывали физиологическим раствором, забуференным фосфатами (рН 7,2). Соответствующие количества антисыворотки перемешивали с суспензией иммуносорбента в течение 72 часов мин при комнатной температуре (для предотвращения пророста добавляли мертиолят). Сорбент удаляли центрифугированием, супернатант (сыворотка) содержал специфические антитела к определенному лиганду, а количество антител к БСА было минимально.
Для постановки непрямого конкурентного ИФА планшеты («Costar», США) сенсибилизировали выполненными на 0,1М КБР (рН 9,5) разведениями конъюгата Т-2 -БСА (или Т-2-ПЛ) с концентрациями 0,01, 0,1 и 1 мкг/мл. В каждую лунку планшета вносили по 100 мкл полученного раствора и инкубировали в холодильнике при температуре 4-60С в течение 16 часов. Промывали планшет 3 раза. В готовые планшеты вносили в лунку по 50 мкл анализируемых проб, содержащих Т-2 токсин в концентрациях 0,000, 0,001, 0,01, 0,1, 1,0, 10, 100 нг/ мл и 50 мкл раствора антител. На каждую концентрацию использовалось по три лунки. Все разведения Т-2 токсина выполняли на фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,4) с добавление Твин-20 (0,1%), метанола (10%) и БСА (1%), разведения антител проводили на фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,4) с добавление Твин-20 (0,1%) и БСА (1%). Планшет инкубировали при температуре 25 0С в течение 1 часа при постоянном встряхивании (250 об/мин). После троекратной отмывки в лунки вносили 100 мкл конъюгата пероксидазы хрена против JgG кролика («Sigma») в рабочем разведении 1:10000. После инкубации в тех же условиях и отмывки планшета вносили субстратную смесь для пероксидазы хрена (3,3',5,5'-тетраметилбен-зидин). Инкубировали 15 минут при комнатной температуре в темноте, после чего останавливали цветовую реакцию добавлением равного количества 1М раствора серной кислоты (H2S04). Учет ИФА проводили при длине волны 450 нм на спектрофотометре «Multiscan FC». Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках с исследуемыми растворами, делили на среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножали на 100, этим выражали процент поглощения сигнала. Постановку ИФА проводили трехкратно.
Определение чувствительности проводили по ГОСТ Р 51352-2013 «Медицинские изделия для диагностики ин витро. Методы испытаний», следующим образом: находили среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках содержа-
ЕТЕРЖНЛРНЫЙ
щих раствор микотоксина Т-2 0,0 нг/мл. Рассчитывали величину среднего квадратичного отклонения (о) по формуле:
а
п-1
где: В1 - значение оптической плотности каждого измерения в лунках с нулевой пробой, ед. опт.плотн.; В - среднее арифметическое значение оптической плотности в лунках с нулевой пробой, ед. опт. плотн.; п - число измерений.
На оси ординат откладывали значение коэффициента ингибирования, вычисленного по формуле
(B - 2о)/В0х100%, где В0 - среднее арифметическое значение нулевого калибровочного раствора. По калибровочному графику находили соответствующее ему на оси абсцисс значение минимально определяемой концентрации микотоксина Т-2.
Обработку цифрового материала проводили методом вариационной статистики с применением критерия достоверности по Стьюденту на персональном компьютере с использованием программ Excel.
Результаты исследований. Данные по обнаружению Т-2 токсина в непрямом конкурентном ИФА с использование раствора антител, полученных от животных иммунизированных антигеном Т-2-ПЛ, представлены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1
Эффективность обнаружения Т-2 токсина в ИФА со специфическими антителами к Т-2-ПЛ при сенсибилизации планшетов Т-2-БСА 1 мкг/мл
Наслойка Концентрация Т-2 токсина, нг/мл Процент поглощения сигнала лунки /разведения раствора антител
1:50001 1:25000 1:50000 1:100000 1:500000 1:10000002
Т-2-БСА 1,0 мкг/мл 0,0 - 100,0±1,1 100,0±1,2 100,0±0,8 100,0±1,3 -
0,001 - 97,8±1,3 101,7±1,6 102,4±1,4 100,6±1,6 -
0,01 - 101,4±1,4 99,5±1,3 99,8±1,0 100,2±1,1 -
0,1 - 100,9±1,2 93,4±1,2 90,7±0,9 103,2±0,8 -
1,0 - 102,5±1,3 90,6±0,7 88,5±1,1 100,4±1,1 -
10,0 - 99,7±1,1 80,7±1,0 77,4±0,7 93,4±0,5 -
100,0 - 95,2±1,4 65,5±0,6 70,2±0,8 86,9±0,6 -
Примечание: 1 - результаты не учитывались, т.к. ОП всех лунок была выше оптимальных границ >3,9, зависимости от концентрации токсина не наблюдалось;
2 - результаты не учитывались, т.к. ОП всех лунок была ниже оптимальных границ <0,4, зависимости от концентрации токсина не наблюдалось.
Как следует из данных, представленных в таблице 1, при разведениях раствора антител 1:25000 достоверное дозо-зависимое поглощение сигнала наблюдали лишь при достаточно высокой концентрации токсина 100 нг/мл, аналогичная ситуация была и при разведении антител 1:500000, достоверное снижение сигнала наблюдали при концентрации 10,0 и 100,0 нг/мл. Больший дозо-зависмый эффект наблюдали при разведении 1:50000 и 1:100000 - достоверное снижение сигнала наблюдали с концентрации токсина 0,1 нг/мл, однако оптическая плотность нулевого стандарта различалась практически в три раза, соответственно 3,03 и 0,936. При разведении 1:5000 и 1:1000000 результаты не учитывались, т.к. в первом случае ОП всех лунок была выше оптимальных границ >3,9, а во втором случае ОП всех лунок была ниже оптимальных границ <0,4, кроме того зависимости от концентрации токсина не наблюдалось даже при высоких концентрациях Т-2 токсина.
Как следует из таблицы 2, при разведениях раствора антител 1:25000 - 1:500000, достоверное до-зо-зависимое поглощение сигнала наблюдали уже при концентрации токсина 0,01 нг/мл, однако рабочий диапазон при разведении 1:25000 значительно был значительно уже, чем при разведении 1:50000 и 1:100000. Больший дозо-зависмый эффект наблюдали при разведении 1:500000, апоглощение сигнала наблюдали уже при концентрации токсина 0,001 нг/мл. При разведении 1:5000 зависимости от концентрации токсина не наблюдалось даже при высоких концентрациях Т-2 токсина. При разведении 1:1000000 результаты не учитывались, т.к. ОП всех лунок была ниже оптимальных границ <0,4.
На основании полученных данных был построен график зависимости поглощения сигнала от концентрации токсина (рис.1)..
ЕТЕРННЛРНЫВ
Врач
Таблица 2
Эффективность обнаружения Т-2 токсина в ИФА со специфическими антителами к Т-2-ПЛ при сенсибилизации планшетов Т-2-БСА 0,1 мкг/мл
Наслойка Концентрация Т-2 токсина, нг/мл Процент поглощения сигнала лунки /разведения раствора антител
1:5000 1:25000 1:50000 1:100000 1:500000 1:10000001
Т-2-БСА 0,1 мкг/мл 0,0 100,0±1,4 100,0±1,5 100,0±1,3 100,0±1,4 100,0±1,4 -
0,001 101,4±1,4 97,3±1,8 97,1±1,2 96,7±1,1 91,9±1,0 -
0,01 100,6±1,1 94,9±1,0 93,4±1,3 91,6±1,2 85,3±1,1 -
0,1 99,5±1,0 83,6±0,7 87,7±1,1 80,5±0,8 58,6±0,7 -
1,0 100,2±1,4 82,3±0,8 73,6±0,9 65,4±0,6 38,4±0,4 -
10,0 98,3±1,3 78,2±0,6 66,4±0,8 57,9±0,7 31,0±0,4 -
100,0 99,8±1,6 72,4±0,5 55,1±0,9 45,7±0,5 22,6±0,3 -
Примечание: 1 - результаты не учитывались, т.к. ОП всех лунок была ниже оптимальных границ <0,4, зависимости от концентрации токсина не наблюдалось.
Рис. 1. Зависимость поглощения сигнала от концентрации токсина в ИФА со специфическими антителами к Т-2-ПЛ при сенсибилизации планшетов Т-2-БСА 0,1 мкг/мл.
При изучении эффективности обнаружения Т-2 токсина в ИФА со специфическими антителами к Т-2-ПЛ при сенсибилизации планшетов Т-2-БСА 0,01 мкг/мл, установили, что ОП лунок при всех испытанных разведениях антител была ниже оптимальных границ <0,4, а зависимости от концентрации токсина не наблюдалось.
При изучении эффективности обнаружения Т-2 токсина в ИФА со специфическими антителами к Т-2-ПЛ при сенсибилизации планшетов Т-2-ПЛ в дозах от 1,0 до 0,01 мкг/мл, установили, что ОП при всех испытанных разведениях антител была значительно ниже оптимальных границ <0,4 и составила от 0,26 до 0,14. Зависимости ОП лунок от концентрации токсина не наблюдалось.
Результаты изучения обнаружения Т-2 токсина в непрямом конкурентном ИФА с использование раствора антител полученных от животных иммунизированных антигеном Т-2-БСА представлены в таблицах 3 и 4.
Как следует из данных, представленных в таблице 3, при разведениях раствора антител 1:25000 до-
стоверное дозо-зависимое поглощение сигнала наблюдали лишь при достаточно высокой концентрации токсина 100 нг/мл. При разведении антител 1:50000, достоверное снижение сигнала наблюдали начиная с концентрации 1,0, однако рабочий диапазон был достаточно узок 1,0 -10 нг/мл.
При разведении 1:5000 и от 1:100000 до 1:1000000 результаты не учитывались, т.к. в первом случае ОП всех лунок была выше оптимальных границ >3,9, а во втором случае ОП всех лунок была ниже оптимальных границ <0,4, кроме того зависимости от концентрации токсина не наблюдалось даже при высоких концентрациях Т-2 токсина, за исключением разведения 1:100000 - дозо-зависимый эффект наблюдался, однако, из-за низкой оптической плотности вести учет результатов посчитали не целесообразным.
На основании полученных данных был построен график зависимости поглощения сигнала от концентрации токсина (рис. 2).
Таблица 3
Эффективность обнаружения Т-2 токсина в ИФА со специфическими антителами к Т-2-БСА при сенсибилизации планшетов Т-2-БСА 1 мкг/мл
Наслойка Концентрация Т-2 токсина, нг/мл Процент поглощения сигнала лунки / разведения раствора антител
1:50001 1:25000 1:50000 1:1000002 1:5000002 1:10000002
Т-2-БСА 1,0 мкг/мл 0,0 - 100,0±2,0 100,0±2,1 - - -
0,001 - 98,7±1,4 98,6±2,2 - - -
0,01 - 99,4±1,6 97,8±2,1 - - -
0,1 - 100,2±2,2 90,6±2,0 - - -
1,0 - 96,4±1,7 84,4±2,2 - - -
10,0 - 96,0±2,1 84,0±1,4 - - -
100,0 - 93,8±1,8 71,3±1,5 - - -
Примечание: 1 - результаты не учитывались, т.к. ОП всех лунок была выше оптимальных границ >3,9, зависимости от концентрации токсина не наблюдалось;
2 - результаты не учитывались, т.к. ОП всех лунок была ниже оптимальных границ <0,4.
Таблица 4
Эффективность обнаружения Т-2 токсина в ИФА со специфическими антителами к Т-2-БСА при сенсибилизации планшетов Т-2-БСА 0,1 мкг/мл
Наслойка Концентрация Т-2 токсина, нг/мл Процент поглощения сигнала лунки / разведения раствора антител
1:5000 1:25000 1:50000 1:1000001 1:5000001 1:10000001
Т-2-БСА 0,1 мкг/мл 0,0 100,0±2,1 100,0±2,2 100,0±1,9 - - -
0,001 102,3±2,5 92,3±2,4 96,5±1,6 - - -
0,01 101,6±2,3 90,1±1,8 89,7±1,7 - - -
0,1 99,4±2,0 87,6±1,7 78,3±1,1 - - -
1,0 100,7±1,9 85,4±1,9 72,4±1,3 - - -
10,0 98,6±1,8 83,9±1,3 60,4±1,5 - - -
100,0 99,4±1,5 80,2±1,5 52,0±1,4 - - -
Примечание: 1 - результаты не учитывались, т.к. ОП всех лунок была ниже оптимальных границ <0,4, зависимости от концентрации токсина не наблюдалось.
Концентрация 1
Рис. 2. Зависимость поглощения сигнала от концентрации токсинав ИФА со специфическими антителами к Т-2-БСА при сенсибилизации планшетов Т-2-БСА 0,1 мкг/мл.
ЕТ ЕР ПИАРНЫЙ
Врач
Как следует из таблицы, больший дозо-зависимый эффект наблюдали при разведении 1:50000, достоверное поглощение сигнала наблюдали уже при концентрации токсина 0,01 нг/мл При разведении 1:5000 зависимости от концентрации токсина не наблюдалось даже при высоких концентрациях Т-2 токсина. При разведении 1:100000 и более, результаты не учитывались, т.к. ОП всех лунок была ниже оптимальных границ <0,4.
При изучении эффективности обнаружения Т-2 токсина в ИФА со специфическими антителами к Т-2-БСА при сенсибилизации планшетов Т-2-БСА в дозе 0,01 мкг/мл, установили, что ОП всех лунок при испытанных разведениях антител была ниже оптимальных границ <0,4, а зависимости от концентрации токсина не существенна.
При изучении эффективности обнаружения Т-2 токсина в ИФА со специфическими антителами к Т-2-БСА при сенсибилизации планшетов Т-2-ПЛ в дозах от 1,0 до 0,01 мкг/мл, установили, что ОП лунок при всех испытанных разведениях антител была значительно ниже оптимальных границ <0,4. Зависимости ОП лунок от концентрации токсина не наблюдалось.
Чувствительность ИФА в наших условиях постановки по уровню снижения сигнала с учетом достоверности по критерию Стьюдента и, в соответствии, с методикой подсчета чувствительности оценили выборочно - у наиболее показательных графиков. Для антител на Т-2-ПЛ это разведения 1:50000, 1:100000 и 1:500000 и антител на Т-2-БСА это разведение
Литература
1:50000, при наслойке Т-2-БСА 10 нг/лунку. Установили, что при разведении сыворотки на Т-2-ПЛ 1:50000 чувствительность составляет 0,13 нг/мл, 1:100000 -0,10 нг/мл и 1:500000 - 0,04 нг/мл. При разведении сыворотки на Т-2-БСА 1:50000чувствительность составляет 0,12 нг/мл.
Заключение. КонъюгатТ-2 токсина с полилизином в испытанных условиях эксперимента не может использоваться в качестве сенсибилизируемого антигена на планшетах.
КонъюгатТ-2 токсина с полилизином обладает высокой иммуногенностью и может использоваться для получения специфических поликлональных антител к Т-2 токсину.
В сравнительном плане конъюгата Т-2 токсина с полилизином с конъюгатом Т-2 токсина с бычьим сывороточным альбумином, в равных одинаковых условиях эксперимента, конъюгат Т-2 токсина с полилизином обладает большей иммуногенностью (титры достигали 1:500000). При постановке ИФА со специфической сывороткой рабочий диапазон был шире и чувствительность выше, чем со специфической сывороткой к Т-2-БСА. Иммунизация конъюгата Т-2 токсина с полилизином не требует дополнительной очистки специфической сыворотки.
Авторы статьи выражают благодарность кандидату химических наук Т.И.Новожиловой за оказанную помощь при проведении научных исследований.
1. Тутельян, В.А. Микотоксины (медицинские и биологические аспекты) / В.А.Тутельян, Л.В.Кравченко. - М.: Медицина, 1985. - 320 с.
2. Смирнов, В.В. Микотоксины: фундаментальные и прикладные аспекты / В.В.Смирнов, А.М.Зайченко, И.Г.Рубежняк // Современные проблемы токсикологии. - 2о0о. - № 1. - С. 10-17.
3. Микотоксикозы животных (этиология, диагностика, лечение, профилактика) / А.В.Иванов, М.Я.Тремасов, К.Х.Папуниди, А.К.Чулков. - М.: Колос, 2008. - 140 с.
4. Микотоксикозы (биологические и ветеринарные аспекты) / А.В.Иванов, В.И. Фисинин, М.Я.Тремасов, К.Х.Папуниди. - М.: Колос, 2010. - 392 с.
5. Проблема микотоксикозов животных / М.Я.Тремасов, А.В.Иванов, К.Х.Папуниди, Э.И.Семёнов // Ветеринарный врач. - 2010. - № 5. - С. 16-19.
6 .Военная токсикология / Н.А.Лошадкин, Б.А.Курлянский, Г.В.Беженарь, Л.В.Дарьина; под ред. Б.А.Курлян-ского. - М.: Медицина, 2006. - 208 с.
7. Зайченко, А.М. Макроциклические трихотециновые микотоксины: продуценты, распространение, определение, физиология токсинообразования, токсигенный потенциал / А.М.Зайченко, И.Г.Рубежняк, О.П.Кобзистая // Современные проблемы токсикологии. - 2001. - № 2. - С. 11-14.
8. Fusarium fungi and mycotoxins on cultivated forage grasses / TYu.Gagkaeva, O.P.Gavrilova, A.A.Burkin, G.P.Kononenko / Fusarium: pathogenicity, mycotoxins, taxonomy, genomics, biosynthesis, metabolomics, resistance, disease control. Bookofabstracts: 13th European fusarium seminar. - M., 2015. С. 149.
9. Теория и практика иммуноферментного анализа / А.М.Егоров, А.П.Осипов, Б.Б.Дзантиев, Е.М.Гаврилов. -М.: Высшая школа, 1991. - 288 с.
10. Беляева, Л.Л., Индикация микотоксинов методом ИФА / Л.Л.Беляева, М.Я.Тремасов // Ветеринария. -1995. - № 1. - С. 26.
11. Обнаружение микотоксина Т-2 различными вариантами твердофазного иммуноферментного анализа / А.А.Кытманов [и др.] // Лабораторная диагностика. - 2009. - № 3. - С. 27-29.
12. Методические указания по обнаружению Т-2 токсина в объектах ветнадзора методом ИФА: утв. ГУВ СССР 27.03.1991 / Л.Л.Беляева, К.Х.Папуниди, М.Я.Тремасов, П.К.Сметов. - М.,1991. - 7 с.
13. Иммуноферментный метод определения Т-2 токсина в контаминированном зерне / Г.П.Кононен-ко, А.А.Буркин, Н.А.Соболев, Е.В.Зотов // Прикладная биохимия и микробиология. - 1999. - Том 35, №4. -С. 457-462.
14. Урусов А.Е. Иммунохимические методы анализа микотоксинов (обзор) / А.Е.Урусов, А.В.Жердев, Б.Б.Дзантиев // Прикладная биохимия и микробиология. - 2010. - Том 46, № 8. - С. 276-290.
15. Сергейчев, А.И. Обеспечение стандартными образцами лабораторий по индикации микотоксинов / А.И.Сергейчев // Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний: материалы Междунар. симпозиума, г. Казань, 28-30 нояб. 2005 г. Часть 1. - Казань, 2005. - С. 240-243.
16. Mycotoxic Fungy, Mycotoxins, Mycotoxicoses / T.D.Wyllie [et al.] // An Encyclopedic Handbook. - 1977. -Vol. 1. - Р. 356-361.
17. Means, G E. Chemical modification of proteins / G E Means, E Feeney. - San Fransisco: Holden-Day, 1971. - 144 р.
18. Буркин, А.А. Обнаружение микотоксина Т-2 различными вариантами твердофазного иммуноферментно-го анализа / А.А.Буркин, Г.П.Кононенко, В.Г.Зорян // Прикладная биохимия и микробиология. - 2000. - Т. 36, № 4. - С. 428-432.
APPLICATION OF T-2 TOXIN CONJUGATE WITH POLYLYSINE FOR DETECTION OF T-2 TOXIN USING COMPETITIVE ELISA
Mishina N.N. - Candidate of Biological Sciences; Semenov E.I. - Candidate of Biological Sciences;
Papunidi K.Kh. - Doctor of Veterinary Medicine, professor.
Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail:vnivi@mail.ru).
The aim of the study was to test the possibility of using a toxin-T-2 conjugate with polylysine to detect a T-2 toxin using ELISA. T-2 toxin conjugates with high-molecular carriers - bovine serum albumin and polylysine - were synthesized. Rabbits were immunized in the same way, the plates was sensitized and the ELISA was performed under the same conditions for the both conjugates. The studies showed that T-2 toxin conjugate with polylysine under the experimental conditions cannot be used as a sensitizing antigen in plates. The conjugate of T-2 toxin with polylysine has a high immunogenicity and can be used to obtain specific polyclonal antibodies against T-2 toxin. The comparative studies of T-2 toxin conjugate with polylysine and T-2 toxin with bovine serum albumin under the same experimental conditions showed that T-2 toxin conjugate with polylysine has higher immunogenicity (titer 1:500,000). Using ELISA with specific serum performance and sensitivity rate were higher than that of the specific serum to T-2 toxin with BSA. Immunization of toxin-T-2 conjugate with polylysine does not require additional purification of specific serum.
KEYWORDS: T-2 toxin, polylysine, ELISA.
References
1. Tutel'yan, V.A. Mikotoksiny (medicinskie i biologicheskie aspekty) [Mycotoxins (medical and biological aspects) / V.A.Tutel'yan, L.V.Kravchenko. - Moscow: Medicina, 1985. - 320 p.
2. Smirnov, V.V. Mikotoksiny: fundamental'nye i prikladnye aspekty [Mycotoxins: fundamental and aapplied aspects] / V.V.Smirnov, A.M.Zajchenko, I.G.Rubezhnyak // Sovremennye problemy toksikologii. - 2000. - № 1. - P. 10-17.
3. Mikotoksikozy zhivotnyh (ehtiologiya, diagnostika, lechenie, profilaktika)[Animal mycotoxicoses (etiology, diagnostics, treatment, and prevention)] / A.V.Ivanov, M.YA.Tremasov, K.H.Papunidi, A.K.Chulkov. - Moscow: Kolos, 2008. - 140 p.
4. Mikotoksikozy (biologicheskie i veterinarnye aspekty) [Mycotoxins (medical and biological aspects) ] / A.V.Ivanov, V.I. Fisinin, M.YA.Tremasov, K.H.Papunidi. - Moscow: Kolos, 2010. - 392p.
5. Problema mikotoksikozov zhivotnyh [The problem of animal mycotoxicoses]/ M.Ya.Tremasov, A.V.Ivanov, K.H.Papunidi, E.I.Semyonov // Veterinarnyj vrach. - 2010. - № 5. - P. 16-19.
6. Voennaya toksikologiya [Military toxicology] / N.A.Loshadkin, B.A.Kurlyanskij, G.V.Bezhenar', L.V.Dar'ina; pod red. B.A.Kurlyanskogo. - Moscow: Medicina, 2006. - 208 p.
ET ЕР МНАРНЫЙ
Врач
7. Zajchenko, A.M. Makrociklicheskie trihotecinovye mikotoksiny: producenty, rasprostranenie, opredelenie, fiziologiya toksinoobrazovaniya, toksigennyj potencial [Macroclinical trychocetinic mycotoxins: products, spread, identification, toxin formation physiology, toxinogenic potential]/ A.M.Zajchenko, I.G.Rubezhnyak, O.P.Kobzistaya // Sovremennye problemy toksikologii. - 2001. - № 2. -P. 11-14.
8. Fusarium fungi and mycotoxins on cultivated forage grasses / T.Yu.Gagkaeva, O.P.Gavrilova, A.A.Burkin, G.P.Kononenko / Fusarium: pathogenicity, mycotoxins, taxonomy, genomics, biosynthesis, metabolomics, resistance, disease control. Bookofabstracts: 13th European fusarium seminar. - Moscow, 2015. P. 149.
9. Teoriya i praktika immunofermentnogo analiza [Theory and practice of ELISA method]/ A.M.Egorov, A.P.Osipov, B.B.Dzantiev, E.M.Gavrilov. - Moscow: Vysshaya shkola, 1991. - 288 p.
10. Belyaeva, L.L., Indikaciya mikotoksinov metodom IFA [detection of mycotoxins using ELISA method] / L.L.Belyaeva, M.YA.Tremasov // Veterinariya. - 1995. - № 1. - P. 26.
11. Obnaruzhenie mikotoksina T-2 razlichnymi variantami tverdofaznogo immunofermentnogo analiza / [Detection of T-2 toxin using various versions of ELISA method] A.A.Kytmanov [et al.] // Laboratornaya diagnostika. - 2009. -№ 3. - P. 27-29.
12. Metodicheskie ukazaniya po obnaruzheniyu T-2 toksina v ob"ektah vetnadzora metodom IFA: utv. GUV SSSR 27.03.1991 [Methodology guidelines on T-2 toxin detection in veterinary facilities using ELISA method: approved by the USSR Chief Veterinary Administration of 27.03.1991] / L.L.Belyaeva, K.H.Papunidi, M.Ya.Tremasov, P.K.Smetov. -Moscow, 1991. - 7 p.
13. Immunofermentnyj metod opredeleniya T-2 toksina v kontaminirovannom zerne [ELISA-based detection ofmycotoxins in contaminated grain]/ G.P.Kononenko, A.A.Burkin, N.A.Sobolev, E.V.Zotov // Prikladnaya biohimiya i mikrobiologiya. - 1999. - Vol. 35, №4. - P. 457-462.
14. Urusov, A.E. Immunohimicheskie metody analiza mikotoksinov (obzor) [Immunochemical amethods of mycotoxins analyses (a review)]/ A.E.Urusov, A.V.Zherdev, B.B.Dzantiev // Prikladnaya biohimiya i mikrobiologiya. -2010. - Vol. 46, № 8. - P. 276-290.
15. Sergejchev, A.I. Obespechenie standartnymi obrazcami laboratory po indikacii mikotoksinov [providing laboratories with standard samples for identification of mycotoxins] / A.I.Sergejchev // Nauchnye osnovy obespecheniya zashchity zhivotnyh ot ehkotoksikantov, radionuklidov i vozbuditelej opasnyh infekcionnyh zabolevanij - scientific basics of providing animal health from mycotoxins, radionuclides, and agents of dangerous contagious diseases: proceedings from the Int. symposium, Kazan', 28-30 Nov., 2005. Part 1. - Kazan', 2005. - P. 240-243.
16. Mycotoxic Fungy, Mycotoxins, Mycotoxicoses / T.D.Wyllie [et al.] // An Encyclopedic Handbook. - 1977. -Vol. 1. - P. 356-361.
17. Means, G E. Chemical modification of proteins / G E Means, E Feeney. - San Fransisco: Holden-Day, 1971. - 144 p.
18. Burkin, A.A. Obnaruzhenie mikotoksina T-2 razlichnymi variantami tverdofaznogo immunofermentnogo analiza[ Detection of T-2 toxin using various versions of ELISA method] / A.A.Burkin, G.P.Kononenko, V.G.Zoryan // Prikladnaya biohimiya i mikrobiologiya. - 2000. - Vol. 36, № 4. - P. 428-432.
УДК 619:616.5-018.73-085.28:636.7/8
СПРЕЙ АНТИСЕПТИЧЕСКИЙ - ЭФФЕКТИВНОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ КОЖИ И СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК У СОБАК И КОШЕК
1Н.В.Данилевская - доктор ветеринарных наук, профессор, 2М.В.Арисов - доктор ветеринарных наук, 3И.П.Белых - кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник, 1Е.Н.Индюхова - аспирант.
1ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина»(109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д.23,
e-mail: zxcv33980@yandex.ru).
2ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт фундаментальной и прикладной
паразитологии животных и растений имени К.И. Скрябина» (117218, Россия, г. Москва, ул. Б.Черемушкинская, д. 28, e-mail: arisov_vet@mail.ru).
3ЗАО «Научно-производственная фирма «Экопром» (140070, Московская обл., Люберецкий р-н, пос. Томилино, ул. Гаршина, 11, литер Ф, а/я 917, e-mail: belykh@ekoprom.org).
В статье представлены результаты изучения эффективности нового антисептического спрея (хлоргекси-динабиглюконат, диоксидин) при лечении у собак и кошек гнойных и негнойных ран (в том числе послеопера-
