CC BY
18УДК 504.054+ 57.083.3
Иммуноферментный метод обнаружения и количественного определения окадаевой кислоты в морепродуктах
Разработан чувствительный и специфичный прямой конкурентный иммуноферментный анализ (ИФА) для качественного обнаружения и количественного определения окадаевой кислоты (ОК) в морепродуктах с использованием поликлональных ОК-специфических антител. Пороговая концентрация токсина, выявляемая с помощью ИФА, составляла 0,33±0,13 нг/мл, 50%-ная ингибирующая концентрация - 7,5±1,45 нг/мл. Разработанный ИФА позволял достоверно выявлять токсин в образцах тканей моллюсков при их содержании 40-80 нг/г и может быть использован для мониторинга контаминации морепродуктов окадаевой кислотой.
Ключевые слова: окадаевая кислота, иммуноферментный анализ, ОК-специфические ттитела
Моренков О.С., Врублевская В.В., Кочкина Н.В., Ковтун А.Л.
Учреждение Российской академии наук Институт биофизики клетки РАН, г Пущино
Введение. В последнее время остро встал вопрос мониторинга токсичных видов фитопланктона прибрежной полосы водоемов. Значительное число видов планктонных микроводорослей способны к синтезу фикотоксинов - веществ, токсичных для животных и человека [4, 18, 19, 20]. Массовое развитие этих видов микроводорослей может приводить к гибели отдельных представителей морской фауны, заморам рыб [4, 5, 18, 19]. Токсичные микроводоросли, наряду с другими фитопланктерами, входят в пищевой рацион двустворчатых моллюсков и ракообразных, при этом фикотоксины способны накапливаться в их тканях. Употребление таких морепродуктов в пищу (обычно это - мидии, устрицы или крабы) приводит к отравлению людей, иногда с летальным исходом [4, 5, 18, 19].
Диаретическое отравление моллюсками (Diarrhoeic Shellfish Poisoning (DSP)) вызывается жирорастворимыми DSP-токсинами, которые концентрируются в жировой ткани двустворчатых моллюсков [4, 5, 18, 19, 22]. Симптомами DSP является диарея, тошнота, рвота и желудочные боли. DSP-токсины обычно синтезируются динофлагеллятами, принадлежащими к родам Dinophysis и Prorocentrum [5, 19, 22]. Важнейшим представителем DSP-токсинов является окадаевая кислота (ОК). Достаточно распространены и дериваты ОК, называемые динофизистоксинами - DTX-1, DTX-2, DTX-3, DTX-4. ОК представляет собой жирорастворимое вещество с длинной углеродной цепью, включающей транс-конденсированные или спирально-соединенные циклические полиэфирные кольца (Рис. 1). Она является мощным ингибитором серин/треониновых фосфатаз PP1 и PP2A, что определяет высокую токсичность ОК для животных и человека [5, 15, 19]. Главной причиной диареи служит гиперфосфорилирование белков, контролирующих №+-обмен в клетках кишечника, или белков цитоскелета и тех компонентов, которые участвуют в регуляции проницаемости мембран для растворенных веществ, что и приводит к массивной потере жидкости [4, 15, 19].
C 2008 г. в России действует СанПиН 2.3.2.2401-08 «Дополнения и изменения № 10 к санитарно-эпидемиологическим правилам и нормативам СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов», который регламентирует допустимый уровень содержания окадаевой кислоты в нерыбных объектах промысла - не более 0,16 мг на 1 кг мяса моллюсков, что соответствует предельно допустимому уровню токсина в Евросоюзе.
Для анализа ОК в морепродуктах используют физико-химические, иммунохимические и биологические методы [5, 6]. Наиболее перспективными, сочетающими в себе простоту, скорость, высокую чувствительность и специфичность, а также возможность автоматизации, являются имму-нохимические методы выявления ОК. К настоящему времени разработан ряд иммунохимических методов, в основном в формате иммуноферментного анализа (ИФА), для количественного определения ОК в тканях моллюсков [1, 8, 10, 11, 16, 23]. Разработанные методы ИФА основаны на применении как поликлональных, так и моноклональных ОК-специфических антител. Недостатком тест-систем на основе моноклональных антител является их высокая специфичность к отдельным представителям DSP-токсинов, что приводит к невозможности выявления других производных ОК. Результаты, полученные с использованием тест-систем на основе поликлональных антител, представляются более надежными, так как поликлональные антитела перекрестно реагируют со всеми структурно-близкими DSP-токсинами. Разработанные иммуноферментные методы определения ОК имеют высокую специфичность и чувствительность, а результаты, получаемые в ИФА, обнаруживают хорошую корреляцию с данными других методов, в том числе и методами высокоэффективной жидкостной хроматографии [2, 3, 12, 13, 17].
Наборы для иммуноферментного определения содержания ОК в моллюсках выпускают компании R-Biopharm (Германия), Biosense Laboratories (Норвегия) и Abraxis (США). В России к настоящему времени не разработаны иммунохимические методы определения ОК, в связи с чем, на сегодняшний день для проведения анализа морской воды и морепродуктов на содержание ОК используют дорогостоящие зарубежные тест-системы. Целью данной работы была разработка им-мунохимических реагентов и на их основе иммуноферментного метода для качественного обнаружения и количественного определения ОК в морепродуктах.
Материалы и методы исследования. Получение конъюгатов ОК с бычьим сывороточным альбумином (БСА), гемоцианином (KLH) и овальбумином (ОВА) осуществляли с использованием водорастворимых карбодиимидов, как описано ранее [1, 8, 10, 11, 23]. Для получения ОК-специфических антител, кроликов иммунизировали конъюгатами ОК-ОВА и ОК-KLH, эмульгированными в полном адъюванте Фрейнда (первая иммунизация) или в неполном адъюванте Фрейнда (последующие иммунизации). Животных иммунизировали подкожно, интервалы между иммуни-зациями - 2 недели, дозы иммунизации - 50-200 мкг конъюгата на одну иммунизацию. Через 14 дней после иммунизаций у кроликов отбирали кровь и получали антисыворотку.
Иммуноглобулины выделяли из антисывороток стандартными методами с помощью хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе [14]. Чистоту препаратов антител оценивали с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия [9]. Концентрацию белков определяли методом Лоури [7]. Конъюгаты поликлональных ОК-специфических антител с пероксидазой хрена (ПХ) получали методом перйодатного окисления [21].
Активность препаратов очищенных ОК-специфических антител (ОК-АТ) и конъюгатов ОК-специфических антител с пероксидазой хрена (ОК-АТ-ПХ) оценивали с помощью непрямого и прямого ИФА, соответственно. ОК-АТ и ОК-АТ-ПХ тестировали на планшетах, сенсибилизированных ОК-БСА. В непрямых ИФА, связавшиеся на полистироловой поверхности антитела выявляли с помощью пероксидазных конъюгатов против иммуноглобулинов кроликов. За титр специфических антител (конъюгатов антител) принимали максимальное разведение препарата ОК-АТ (ОК-АТ-ПХ), при котором оптическая плотность превышала 0,3. Специфичность ОК-АТ и ОК-АТ-
36
ПХ определяли с помощью непрямого и прямого конкурентного ИФА, соответственно, оценивая ингибирование связывания антител (конъюгатов антител) с ОК-БСА, сорбированном на твердой фазе, растворами ОК в разных концентрациях.
Оценку технических характеристик разработанных непрямого и прямого конкурентных методов ИФА проводили путем определения аналитической чувствительности тест-систем, специфичности и воспроизводимости анализов. При этом использовали образцы тканей моллюсков с известным содержанием ОК, а также образцы тканей моллюсков, искусственно контаминиро-ванных этим соединением. Экстракцию ОК из тканей моллюсков осуществляли с помощью 80 % метанола.
Результаты и обсуждение. Первый этап работы был посвящен получению активных иммуно-химических реагентов (конъюгаты ОК с белками для иммунизации, конъюгаты ОК с белками для сорбции на пластик, ОК-специфические антитела и ПХ-конъюгаты ОК-специфических антител) для использования в ИФА. Для получения ОК-специфических антисывороток, кроликов иммунизировали конъюгатами ОК-ОВА и ОК-КЬН. Иммунизацию проводили разными дозами антигенов 3-6 раз, внутримышечно с интервалом между иммунизациями 14 дней. Начиная со 2-й иммунизации, в сыворотках животных определяли титр антител на белок-носитель (ОВА или КЬН) и специфичность антител (способность блокироваться раствором ОК). Репрезентативные результаты иммунизации отдельных кроликов конъюгатами ОК-ОВА и ОК-КЬН представлены на рис. 2. Данные, представленные на рис. 2, свидетельствуют о том, что иммунизация конъюгатами ОК-белок приводила к индукции антител к белкам-носителям и ОК-специфических антител. После 4-6 иммунизаций титры антител в сыворотках кроликов к белкам-носителям доходили до 1:1000000 и больше; титры ОК-АТ были сопоставимы у животных, иммунизированных конъюгатами ОК-ОВА и ОК-КЬН, и составляли 1:10000-1:40000.
Специфичность антисывороток исследовали с помощью непрямого конкурентного ИФА. Растворы ОК в концентрациях 1-1000 нг/мл ингибировали связывание ОК-специфических антител с конъюгатами ОК-белок, сорбированными на твердой фазе. Очевидно, что оба конъюгата, использованных для иммунизации (ОК-ОВА и ОК-КЬН), обладают высокой иммуногенностью и могут быть использованы для получения высокоактивных поликлональных ОК-АТ. Антитела, полученные при иммунизации животных конъюгатом ОК-ОВА, не ингибировались полностью высокими концентрациями ОК и менее эффективно ингибировались низкими концентрациями ОК (1-10 нг/ мл), в сравнении с антисыворотками, полученными при иммунизации кроликов конъюгатами ОК-КЬН. В этой связи, для дальнейшей работы была отобрана активная ОК-специфическая антисыворотка от кролика, иммунизированного ОК-КЬН, демонстрирующая наиболее высокий уровень блокирования в непрямом конкурентном ИФА. Из этой антисыворотки были очищены ОК-АТ и на их основе получены конъюгаты ОК-АТ-ПХ. ПХ-конъюгаты активно взаимодействовали с ОК-БСА, сорбированным на полистироловой поверхности лунок, и специфически ингибировались растворами ОК (1-1000 нг/мл) в непрямом конкурентном ИФА.
С использованием ОК-АТ и ОК-АТ-ПХ разработаны два варианта ИФА для выявления и количественного определения ОК - непрямой и прямой конкурентные ИФА. Для этого проведена оптимизация следующих параметров ИФА: тип и концентрации сорбируемого конъюга-та ОК-белок, методика конъюгирования ОК с белками, условия сорбции конъюгата ОК-белок, условия стабилизации и высушивания планшетов, а также условия постановки анализа. После оптимизации всех параметров был проведен сравнительный анализ двух форматов ИФА по чувствительности и специфичности. Непрямой и прямой конкурентные ИФА для выявления ОК имели примерно сходные аналитические характеристики (Рис. 3). Для обоих форматов ИФА, наблюдалась дозо-зависимость процента ингибирования от концентрации ОК в растворе: 50%-ная ингибирующая концентрация ОК составляла 7-12 нг/мл, пороговая чувствительность - 0,5-1,0 нг/мл. Учитывая, что в прямом конкурентном ИФА проводится одна иммунологическая стадия, упрощающая анализ в сравнении с непрямым конкурентным ИФА (2 иммунологические стадии), в дальнейшей работе мы ориентировались на прямой конкурентный ИФА. Для проведения прямого конкурентного ИФА требовалось 30-40 мин.
Типичная калибровочная кривая, получаемая в прямом конкурентном ИФА, представлена на рис. 4. Участок калибровочной кривой, позволяющий проводить количественное определение ОК, составлял 0,5-50,0 нг/мл (при логарифмическом представлении концентраций ОК). Пороговая концентрация ОК, достоверно выявляемая с помощью ИФА, составляла 0,33±0,13 нг/мл, с учетом доверительного интервала для уровня значимости 0,05. 50%-ная ингибирующая концентрация ОК составляла 7,50±1,45 нг/мл.
Для оценки специфичности прямого конкурентного ИФА в выявлении ОК было исследовано влияние различных неорганических и органических соединений (различные белки, сахара, аминокислоты, витамина и др.) в концентрациях в 100-1000 раз превышающих определяемые концентрации ОК. Исследованные вещества, включая и другие фикотоксины (домоевая кислота, микроцистин-LR), не ингибировали связывания ОК-специфических ПХ-конъюгатов с сорбированным конъюгатом ОК-БСА (таблица). Исследованные экстракты ткани мидий, не содержащих ОК, также не давали неспецифического ингибирующего эффекта. Полученные данные свидетельствовали о высокой специфичности разработанного прямого конкурентного ИФА для выявления ОК в растворах и тканях моллюсков.
При исследовании образцов тканей мидий, природно-контаминированных ОК или искус-ственно-контаминированных токсином в различных концентрациях, установлено, что разработанный прямой конкурентный ИФА достоверно выявляет токсин в образцах тканей моллюсков при их
Токсикологический вестник №4 (ю9)
н3с он
Рис. 1. Структура окадаевой кислоты
3 4 5
Количество иммунизации
3 4 5
Количество иммунизации
носитель ( 1—1 и V-/) и на ОК (
Vю■ат|ми
. и ■) у 1
иммунизированных кроликов (по два кролика на каждый антиген).
содержании 40-80 нг/г, что в 2-4 раза ниже установленных в России допустимых уровней содержания ОК в нерыбных объектах промысла (0,16 мг окадаевой кислоты на 1 кг мяса моллюсков).
Воспроизводимость получаемых в ИФА результатов оценивали, анализируя разброс значений ОП450 при анализе 16 повторов одной и той же пробы на 1 планшете. Коэффициент вариации (СУ) результатов определяли для проб без ОК и проб с концентрациями ОК 1 нг/мл и 20 нг/мл. Получаемые значения СУ зависели от интенсивности сигнала в ИФА. При О^5о 0,6-1,5 единицы, значение СУ находилось в пределах 5,0-5,6 %, что свидетельствует о достаточно высокой воспроизводимости анализа. При более низких значениях О^5о (0,3-0,6 единицы) значение СУ было несколько выше.
Таким образом, разработаны ОК-специфические иммунохимические реагенты и на их основе чувствительный и специфичный прямой конкурентный ИФА для качественного обнаружения и количественного определения окадаевой кислоты в морепродуктах.
Выводы
1. Получены активные ОК-специфические иммунохимические реагенты (конъюгаты ОК с белками для иммунизации, конъюгаты ОК с белками для сорбции на пластик, ОК-специфические антитела и ПХ-конъюгаты ОК-специфических антител). На основе полученных реагентов разработаны два формата ИФА для определения ОК - непрямой и прямой конкурентные ИФА, и проведен их сравнительный анализ. Прямой конкурентный ИФА оказался наиболее перспективным методом определения ОК.
2. Определены аналитические характеристики прямого конкурентного ИФА для количественного определения ОК. Экстракты из тканей мидий и большое количество исследованных неорганических и органических веществ не проявляли неспецифического ингибирующего эффекта в ИФА, что свидетельствует о специфичности разработанного метода. Пороговая концентрация токсина, достоверно выявляемая с помощью ИФА, составляла 0,33±0,13 нг/мл, 50%-ная ингибиру-ющая концентрация - 7,5±1,45 нг/мл, коэффициент вариации результатов определения - 5,0-5,6 %, диапазон количественного определения ОК - 0,5-50 нг/мл. ИФА позволял достоверно выявлять токсин в образцах тканей моллюсков при их содержании 40-80 нг/г, что в 2-4 раза ниже установленных в России допустимых уровней содержания ОК в нерыбных объектах промысла.
37
о,а 6,4 иа
Концентрации ОК {нг/мл)
Рис. 4. Калибровочная кривая в прямом конкурентном ИФА.
38
Токсикологический вестник №4 (ю9)
Специфичность прямого конкурентного ИФА для определения ОК
Исследуемые вещества Концентрации исследу емыхв еществ Ингибирование сигнала в ИФА (%)
Сахара (глюкоза, сахароза, сорбит и др.) 100 мкг/мл 0-5
Белковые добавки (БСА, желатин, иммуноглобулины разных животных) 100 мкг/мл 0-8
Сыворотки животных (кролик, мышь, человек) 10% 0-10
Неорганические и органические компоненты различных буферов (Трис-НС1, №-фосфат, №-карбонат, №-цитрат, ХЕПЕС и т.д.) 30-100 мМ 0-11
Домоевая кислота 1000 мкг/мл 0-5
Микроцис'mн-LR 1000 мкг/мл 0-5
Другие органические соединения (более 30 соединений) 1-100 мМ 0-10
39
1. Chin J.D., Quilliam M.A., Fremy J.M. Screening for okadaic acid by immunoassay
// J. AOKC Int.,1995. - № 78 (2). - P 508-513.
2. Draisci R., Croci L., Giannetti L. et al. Comparison of mouse bioassay, HPLC and enzyme immunoassay methods for determining diarrhetic shellfish poisoning toxins in mussel // Toxicon, 1994. - № 32 (11). - P. 1379-1384.
3. Gucci P.M., Serse A.P, Coccia F.A., et al. A comparison of methods for diarrhoeic shellfish poison detection // Toxicol. Lett. - 1994. - № 74. - P. 91-97.
4. Hallegraeff G.M., Anderson D.M., Cembella A.D. Manual on harmful marine microalgae. - IOC Manuals and Guides, UNESCO, 1995. - No. 33.
5. Hallegraeff, G.M. 1995. Harmful algal blooms: a global overview // Eds. Hallegraeff G.M. Manual on Harmful Marine Microalgae. - IOC Manuals and Guides, UNESCO, 1995. - No. 33. - P. 1-22.
6. Hungerford J.M., Wekell M.M. Analytical methods for marine toxins // Food Poisoning - Handbook of Natural Toxins, 1992. - № 7. - P. 441-450.
7. Laemmly, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature, 1970. - № 227. - P. 680-685.
8. Lawrence J.E., Cembella A.D., Ross N.W. et al. Cross-reactivity of an anti-okadaic acid antibody to dinophysistoxin-4 (DTX-4), dinophysistoxin-5 (DTX-5), and an okadaic acid diol ester // Toxicon, 1998. - № 36(8). - P. 1193-1196.
9. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L et al. Protein measurement with Folin phenol reagent // J.Biol.Chem, 1951. - № 193. - P. 265-275.
10. Matsuura S., Hamano Y., Kita H.et al. Preparation of mouse monoclonal antibodies to okadaic acid and their binding activity in organic solvents // J. Biochem, 1993. - № 114(2). - P. 273-278.
11. Matsuura S., Kita H., Takagaki Y. Specificity of mouse monoclonal anti-okadaic acid antibodies to okadaic acid and its analogs among diarrhetic shellfish toxins // Biosci Biotechnol. Biochem., 1994. - № 58(8) - P. 1471.
12. Morton S.L., Tindall D.R. Determination of okadaic acid content of dinoflagellate cells: a comparison of the HPLC-fluorescent method and two monoclonal antibody ELISA test kits // Toxicon, 1996. - № 34(8). - P. 947-954.
13. Nunez P.E., Scoging A.C. Comparison of a protein phosphatase inhibition assay, HPLC assay and enzyme-linked immunosorbent assay with the mouse bioassay for
the detection of diarrhetic shellfish poisoning toxins in European shellfish // Int. J.
Food Microbiol, 1997. - № 36. - P. 39-48.
14. Oppermann M. Anion exchange chromatography for purification of monoclonal IgG antibodies // Eds. Peters J.P., Baumgarten H. Monoclonal antibodies. - SpringerVerlag Berlin Heidelberg, 1992. - P. 271-275.
15. Ritchie A.H. Diarrhetic Shellfish Poisoning Toxins // Soc. Appl. Bacteriol., 1993. - № 31. - P 191-201.
16. Shestowsky W.S., Quilliam M.A., Sikorska H.M. An idiotypic-anti-idiotypic competitive immunoassay for quantitation of okadaic acid // Toxicon, 1992. - № 30(11). - P. 1441-1448.
17. Vale P., Sampayo M.A. Comparison between HPLC and a commercial immunoassay kit for detection of okadaic acid and esters in Portuguese bivalves // Toxicon, 1999. - № 37(11). - P. 1565-1577.
18. Van Apeldoorn M.E. Diarrhoeic shellfish poisoning. - RIVM/CSR Report 05722A00, August 1998.
19. Van Egmond H.P., Aune T., Lassus P. Paralytic and diarrhoeic shellfish poisons: occurrence in Europe, toxicity, analysis and regulation // J. Nat. Toxins. - 1993. - № 2. - P. 41-83.
20. Vershinin A., Kamnev A. Harmful algae in Russian coastal waters // Eds. Hallegraeff G.M. Harmful algal blooms 2000. - IOC Manuals and Guides, UNESCO, 2001. - P. 134 - 137.
21. Wilson M.B., Nakane P.K. Recent developments in the periodate method of conjugating horseradish peroxidase (HRPO) to antibodies // Wick G. Immunofluorescence and related staining techniques. - North Holland, Amsterdam, Elsevier, 1978. - P. 215-224.
22. Wright J.L.C. Dealing with seafood toxins: present approaches and future options // Food Research International, 1995. - № 28(4). - P. 347-358.
23. Usagawa T., Nishimura M., Itoh Y. Preparation of monoclonal antibodies against okadaic acid prepared from the sponge Halichondria okadai // Toxicon, 1989. - № 27(12). - P. 1323-1330.
Morenkov O.S., Vrublevskaya V.V., Kochkina N.V., Kovtun A.L.
Immunoenzimometric method of identification and quantitative estimation of okadaic acid in seafood
Institute of Cell Biophysics Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow Region
A sensitive and specific competitive direct immunoenzimometric analysis was developed for qualitative identification and quantitative estimation of okadaic acid in seafood using polyclonal OK-specific antibodies. A toxin threshold concentration found with the help of immunoenzimometric analysis was 0.33 ±0.13 ng/ml and 50% inhibiting concentration was 7.5±1.45 ng/ml. The developed immunoenzimometric analysis allows to authentically identify toxins in samples of shell-fish tissues when their content is of 40-80 ng/g and can be used to monitor the contamination of seafood by okadaic acid.
Материал поступил в редакцию 01.06.2010 г
40
