il Иммуноферментные тест-системы
{S для диагностики энтеровирусных инфекций
ф человека на основе использования
! рекомбинантных технологий
-о
^ Дедюля К.Л., Казинец О.Н., Амвросьева Т.В., Поклонская Н.В., Богуш З.Ф. 1С
ï ГУ «Республиканский научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии», Минск,
С Республика Беларусь
Z о,
о Enzyme-linked immunosorbent assay kits,
based on recombinant technologies, for human enteroviral infections diagnosis
Dziadziulia K.L., Kazinez O.N., Amvrosieva T.V., Poklonskaya N.V., BogushZ.F.
State Institution «The Republican Research and Practical Center for Epidemiology and Microbiology», Minsk, Republic of Belarus
r-
Настоящая работа содержит информацию о разработанных на базе ГУ «Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии» диагностических иммуно-ферментных тест-системах для выявления антиэнтеровирусных IgM и энтеровирусных антигенов, основанных на использовании в качестве антигенного компонента энтеровирусспе-цифического рекомбинантного полипептида. Проведенные исследования показали высокие значения их диагностической чувствительности и специфичности. Продемонстрирована возможность использования разработанных препаратов для лабораторной диагностики и санитарной вирусологии.
Ключевые слова: энтеровирусные инфекции, тест-системы ИФА, энтеровирусный антиген, анти-энтеровирусные IgM, диагностика, санитарная вирусология.
Библиографическая ссылка: Дедюля К.Л., Казинец О.Н., Амвросьева Т.В., Поклонская Н.В., Богуш З.Ф. Иммуноферментные тест-системы для диагностики энтеровирусных инфекций человека на основе использования рекомбинантных технологий // Биопрепараты. 2013. № 4. С. 24-28.
The article contains information about ELISA test systems, developed in the State Institution «The Republican Research and Practical Center for Epidemiology and Microbiology» for detection of antienteroviral IgM and enteroviral antigens, which utilize enterovirus-specific recombinant polypeptide as their antigen component. High specificity and sensitivity of test systems were demonstrated during the research process, along with the possibility of their use for laboratory diagnostics and sanitary virology.
Keywords: enteroviral infections, ELISA test systems, enteroviral antigen, antienteroviral IgM, diagnostics, sanitary virology.
Bibliographic description: Dziadziulia K.L., Kazinez O.N., Amvrosieva T.V., Poklonskaya N.V., Bogush Z.F.Enzyme-linked immunosorbent assay kits, based on recombinant technologies, for human enteroviral infections diagnosis//Biopreparation (Biopharmaceuticals). 2013. № 4. P. 24-28.
Для корреспонденции:
Дедюля К.Л. - ведущий научный сотрудник ГУ «Республиканский научно-исследовательский центр
эпидемиологии и микробиологии»
Адрес: ГУ «Республиканский научно-исследовательский
центр эпидемиологии и микробиологии»
220114, Минск, ул. Филимонова, 23
Статья поступила 09.10.2013 г, принята к печати 05.11.2013 г
«
ПРЕПАРАТЫ
Энтеровирусы (ЭВ) широко распространены в человеческой популяции, пато-генны и вызывают целый спектр заболеваний различной степени тяжести с поражением практически всех органов и тканей человека. Среди них наиболее тяжелыми клиническими формами являются полиомиелит, менингит, энцефалит, кардит, гепатит [1, 2]. Их возбудители относятся к семейству Picornaviridae, роду Enterovirus, который включает четыре группы неполиомиелитных энтеровирусных агентов - Enterovirus A, B, C, D, а также отдельный вид по-лиовирусов [2, 7].
В ряду известных методов диагностики энтеровирусных инфекций (ЭВИ) особое место занимает им-муноферментный анализ (ИФА) - как рутинный экспресс-метод, доступный и широко используемый в практических лабораториях, благодаря его относительно низкой стоимости и простоте постановки по сравнению с молекулярно-биологическими методами. Данные преимущества ИФА делают его одним из методов выбора при лабораторной диагностике ЭВИ и проведении санитарно-вирусологических исследований воды и пищевых продуктов, что особенно актуально в условиях массовых исследований при групповой заболеваемости, требующей оперативности в установлении ее этиологии, путей и факторов передачи [1, 6].
Целью данного исследования было изучение диагностической эффективности разработанных на базе ГУ «Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии» диагностических иммуноферментных тест-систем «Тест-системы диагностической для выявления антител класса М к эн-теровирусам методом иммуноферментного анализа «ЭВ-РекИФА-М» (РУ № ИМ-7.96638 от 30.06.2010) и «Тест-системы рекомбинантной для определения антигенов энтеровирусов методом иммуноферментного анализа «ЭВ-РекИФА-АГ»» (в процесс регистрации), основанных на использовании энтеровирусспецифи-ческого рекомбинантного полипептида (РП). Разработанные тест системы предназначены для проведения качественной экспресс-диагностики ЭВИ, вызываемых наиболее распространенными серотипами неполиомиелитных энтеровирусов (Human Enterovirus B). Диагностическую эффек-тивность разработанных тест-систем оценивали по чувствительности и специфичности в сравнении с аналогичными коммерческими диагностическими системами, в основе которых лежит цельновирионный антиген.
Материалы и методы
В качестве антигенного (АГ) компонента ИФА тест-систем применяли ранее созданный рекомбинантный энтеровирусспецифический полипептид СЕ/Е6 [3, 4]. Для его экспрессии использовали линию бактериальных клеток E. coli BL21(DE3), несущую векторную конструкцию pET-24b(+)/CE/E6 с клонированной последовательностью N-концевого фрагмента капсидного белка VP1, кодирующей 89 аминокислот входящих в состав так называемого общего антигенного эпитопа. Выделение экспрессированного РП из бактериальных
клеток E. coli BL21(DE3) осуществляли аффинной ме-талл-хелатной хроматографией на колонках из набора «HisTrap HP Kit» («Amersham Biosciences», США).
Постановку реакции обратной транскрипции осуществляли с использованием набора «РЕВЕРТА-L» («Амплисенс», Россия). Выявление полученной в реакции обратной транскрипции кДНК энтеровирусов осуществляли с использованием тест-систем для ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией («Ам-плиСенс», Россия).
Накопление и титрование ЭВ осуществляли на перевиваемых культурах клеток RD (клетки эмбриональной рабдомиосаркомы человека), BGM (клетки почки зеленой мартышки), Hep-2c (клетки карциномы гортани человека), полученных из Института цитологии Российской академии наук (г Санкт-Петербург).
В качестве отрицательного контроля в разработанных ИФА тест-системах использовали 1%-й раствор БСА, в качестве положительного контроля - смесь цельнови-рионных АГ различных штаммов энтеровирусов.
При изучении диагностической эффективности разработанной тест-системы «ЭВ-РекИФА-М» использовали: сыворотки крови здоровых людей (10 образцов) и больных (30 образцов), у которых уже были обнаружены IgM к энтеровирусу (20 образцов), к вирусу простого герпеса (2 образца), к вирусу Эпштейн-Бар (2 образца), к Mycoplasma hominis (3 образца), к Toxoplasma gondii (1 образец), к Chlamidia trachomatis (2 образца), полученные из городской детской инфекционной клинической больницы г Минска; 34 моноспецифические антиэнтеровирусные сыворотки, производства ФГБУ «ИПВЭ им. М.П. Чумакова» г Москва, Россия.
Для изучения диагностической эффективности разработанной тест-системы «ЭВ-РекИФА-АГ» использовали: фекалии пациентов с клиническим диагнозом энтеровирус-ная инфекция (16 образцов), норовирус-ная инфекция (5 образцов), астровирусная инфекция (5 образцов), ротовирусная инфекция (3 образца), аденовирусная инфекция (2 образца), полученные из городской детской инфекционной клинической больницы г Минска и областных ЦГЭ; штаммы энтеровирусов ЕСНО 1, 4, 6, 11, 14, 15, 20, 25, 30 и Коксаки В 1, 2, 3, 4, 5 из коллекции РНПЦ эпидемиологии и микробиологии (Минск, Республика Беларусь); пробы питьевой воды (51 образец), сточных вод (6 образцов), пищевых продуктов (49 образцов), отобранные в плановом порядке и по эпидпоказаниям в очагах ЭВИ.
Пробы пищевых продуктов и питьевых вод перед исследованием подвергались концентрированию согласно соответствующим инструкциям, входящим в состав наборов «Набор для сбора и концентрирования вирусов из питьевой воды в системе децентрализованного хозяйственно-питьевого водоснабжения, поверхностных и сточных вод» (ТУ РБ 100558032. 048-2001) (концентрирование в 300 раз) и «Набор для экстракции и концентрирования вирусов из пищевых продуктов» (концентрирование в 50-100 раз) (ТУ РБ 100558032.152-2008).
Для сравнительной оценки разработанных рекомби-нантных ИФА тест-систем использовали существую-
я
1,4 1,2 ¡5 1,0
С
0,8 0,6 0,4 0,2 0
KB1 1KB2 1 KB3 'KB4 KB5
E2 1 E3 1 E4 1 E5 1 E6 1E7 1 E8 1E9 1E11'E12 E13 E141 E15 1 E16'E17 1 E181E19'E201 E21'E22'E241E25 E26'E27'E29 E301E32
Рисунок 1. Результаты исследования способности тест-системы «ЭВ-РекИФА-М» выявлять антитела к различным серотипам ЭВ. (ПОП - показатель оптической плотности (для отрицательной пробы не должен превышать 0,2 единицы), KB - Коксаки В, E - ECHO).
щие на отечественном рынке коммерческие препараты: «Тест-систему иммуноферментную для выявления антител класса М к энтеровирусам» («ЭВ-ЦельновирИФА-М») и «Тест-систему для определения антигенов энтеро-вирусов методом иммуноферментного анализа» («ЭВ-ЦельновирИФА-АГ») (Республика Беларусь).
Диагностическую чувствительность разработанных тест-систем вычисляли по формуле: (количество положительных проб / количество истинно положительных проб) х 100%, диагностическую специфичность - по формуле: (количество отрицательных проб / количество истинно отрицательных проб) х 100%. В качестве истинно положительных и истинно отрицательных проб использовали пробы, оказавшиеся положительными или отрицательными при исследовании их соответствующими коммерческими тест-системами.
Результаты и обсуждение
При разработке технологии производства тест-системы «ЭВ-РекИФА-М» использовали классический прямой метод ИФА со следующей схемой постановки. На поверхности носителя в качестве антигена иммобилизуется созданный ранее энтеровирусспецифиче-ский РП [3, 4], к которому добавляется исследуемый образец, содержащий определяемые 1дМ. После инкубации и удаления несвязавшихся компонентов к образовавшемуся комплексу антиген+антитело добавляется фиксированная концентрация меченых антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя проводится детекция ферментативной активности образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Для данной тест-системы в лунках с поло-
жительным контролем (ПК) значение среднего арифметического показателя оптической плотности (ПОП) должно быть не менее чем в 2,1 раза превышать среднюю арифметическую величину ПОП для лунок с отрицательным контролем (ОК). При этом величина ПОП для ОК не должна быть более 0,2. Величина ПОП для ПК не должна быть менее 0,42.
Способность тест-системы «ЭВ-РекИФА-М» выявлять антитела к широкому спектру серотипов энтерови-русов была показана в ИФА с 34 моноспецифическими сыворотками к различным энтеровирусам (рис. 1). Как видно из рисунка 1, тест-система способна эффективно выявлять антитела к 22 из 34 энтеровирусов. В реакции ИФА с 7 из 12 оставшихся моноспецифических сывороток ПОП был немногим меньше порогового (менее 0,42). С 5 моноспецифическими сыворотками (к вирусам ЕСНО 9, 11, 16, 19 и 29) в реакция ИФА ПОП был близок к 0,2, что говорило об отрицательном результате. Следует отметить, что несмотря на наличие ряда серотипов, с которыми тест-система не способна взаимодействовать, она эффективно выявляет основные эпидемически значимые для РБ серотипы энтеровирусов, такие как ЕСНО 6 и 30, а также Коксаки В 3 и 5.
Сравнительное изучение диагностической эффективности тест-системы «ЭВ-РекИФА-М» и ее коммерческого аналога показало полное совпадение результатов при исследовании 40 сывороток крови. Созданная тест-система выявила все положительные и отрицательные пробы, ложноположительные и ложноотрицательных результаты отсутствовали. Таким образом, ее диагностическая чувствительность и специфичность составили 100%.
В основу другой нашей разработки - тест-системы «ЭВ-РекИФА-АГ» - был положен конкурентный метод
ПРЕПАРАТЫ
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
I
E11 E14
E20 KB1
Рисунок 2. Результаты детекции спектра серогрупп ЭВ (ECHO 1, 4, 6, 11, 14, 15, 20, 25, 30 и Коксаки В 1, 2, 3, 4, 5) конкурентным методом ИФА (ПОП - показатель оптической плотности, ОК - отрицательный контроль (для отрицательной пробы не должен быть меньше 0,8 единицы), ПП - положительная проба).
ИФА, при постановке которого использовались меченные ферментом вторичные антитела и иммобилизованный на твердой фазе в качестве АГ энтеровирусспе-цифический РП.
Следует отметить, что непрямая схема с использованием меченых антивидовых антител является одной из наиболее распространенных при постановке ИФА [5]. На поверхности носителя иммобилизуется АГ-белок, к которому добавляется раствор, содержащий определяемый АГ и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител. После инкубации и удаления несвязавшихся компонентов добавляется фиксированная концентрация меченых антивидовых антител. Спустя 1 ч после инкубации компонентов, проводится отмывка носителя и последующая детекция ферментативной активности образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина сигнала находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого АГ. При данной постановке ИФА анализируемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние содержащихся в образце эффекторов на каталитические свойства ферментной метки.
В соответствии с описанной схемой принцип работы созданной тест-системы состоит в следующем. Иссле-
дуемая проба, содержащая детектируемый АГ, добавляется одновременно с иммунной сывороткой в сенсибилизированные энтеровирусспецифическим РП лунки планшетов с целью их (АГ) конкурентного взаимодействия за специфическое связывание с антителами, содержащимися в иммунной сыворотке. В результате такой антигенной конкуренции происходит снижение показателя оптической плотности положительного контроля или пробы, содержащей энтеровирусный АГ, по сравнению с ПОП отрицательного контроля. Для данной тест-системы средний арифметический показатель оптической плотности в лунках с ОК должен быть не менее 0,8 и при этом должен превышать средний арифметический ПОП положительного контроля не менее чем в 2,1 раза.
Способность рекомбинантного АГ в тест-системе «ЭВ-РекИФА-АГ» конкурировать с вирусными агентами, являющимися основными представителями различных серогрупп ЭВ за связывание c антиэнтерови-русными специфическими антителами была изучена при помощи соответствующих штаммов энтеровиру-сов (ЕСНО 1, 4, 6, 11, 14, 15, 20, 25, 30 и Коксаки В 1, 2, 3, 4, 5) (рис. 2). При детекции конкурентным методом ИФА антигенов тест-вирусов оптическая плотность отрицательного контроля снижалась более чем в 2 раза,
Выявление АГ ЭВ в пробах из объектов окружающей среды
0
0К
ПП
E1
E4
E6
E15
KB2
KB3
KB4
KB5
Наименование проб Количество исследованных Количество положительных Процент положительных
Сточные воды б 4 бб,7
Питьевые воды 51 2 3,92
Пищевые продукты 48 10 20,83
что свидетельствовало о возможности использования тест-системы «ЭВ-РекИФА-АГ» для определения антигенов ЭВ в пробах клинического материала пациентов, воды и пищевых продуктов.
Изучение диагностической специфичности и чувствительности разработанной тест-системы проводили в параллельных исследованиях клинического материала (пробы фекалий) с использованием коммерческой тест-системы «ЭВ-ЦельновирИФА-АГ», в основе технологии производства которой лежит применение цельновири-онного энтеровирусного антигена. Подтверждением наличия вирусного материала в исследуемых пробах, кроме обнаружения энтеровирусных АГ коммерческой тест-системой, было выявление энтеровирусной РНК методом ОТ-ПЦР или выделение инфекционных ЭВ в культурах чувствительных клеток. В результате этих исследований было отобрано 16 положительных (содержащих ЭВ) и 15 отрицательных (не содержащих ЭВ) образцов фекалий. Разработанная тест-система выявила все отобранные положительные и отрицательные пробы без ложноположительных и ложноотрицательных результатов, что указывало на ее 100% диагностическую чувствительность и специфичность.
Результаты проведенных далее полевых испытаний созданной тест-системы с целью выявления энтеро-вирусных АГ в пробах из объектов окружающей среды свидетельствовали о достаточно высокой эффективности ее использования для проведения санитарно-вирусологических исследований воды (питьевой, сточной) и пищевых продуктов (таблица).
Оценивая перспективы использования вышеописанных рекомбинантных тест-систем для диагностики ЭВИ и индикации их возбудителей в объектах окружающей среды, важно обратить внимание на ряд имеющихся у них преимуществ при сравнении с аналогичными, уже существующими коммерческими цельновирионными тест-системами. Основными из них являются:
- возможность использования в технологии производства в качестве основного компонента стандартного АГ, что сводит к минимуму появление неспецифических реакций;
- увеличение спектра детектируемых серотипов ЭВ, что увеличивает диагностическую эффективность ИФА исследований;
- снижение себестоимости производства препаратов за счет уменьшения трудовых и материальных за-
трат на трудоемкие и длительные культуральные работы по накоплению цельновирионных АГ.
Указанные достоинства рекомбинантных тест-систем, наряду с высокими показателями диагностической специфичности и чувствительности, обосновывают целесообразность их преимущественного (перед цельновирионными аналогами) использования при проведении диагностических и санитарно-вирусологи-ческих исследований, что будет способствовать повышению качества и эффективности лабораторного контроля и эпиднадзора за ЭВИ на уровне человеческой популяции и эпидемически значимых объектов окружающей среды.
Литература
1. Богуш З.Ф., Амвросьева Т.В., Казинец О.Н. и др. Состояние и результаты лабораторного контроля за возбудителями энтеровирусной инфекции в Республике Беларусь // Медицинская панорама. 2008. № 11. С. 7-11.
2. Букринская А.Г. Вирусология. М.: Медицина, 1986. 336 с.
3. Дедюля К.Л., Поклонская Н.В., АмвросьеваТ.В. и др. Получение рекомбинантного полипептида и изучение его антигенных свойств для создания диагностических тест-систем // Здравоохранение. 2007. № 11. С. 13-17.
4. Дедюля К.Л., Поклонская Н.В., Амвросьева Т.В. Использование рекомбинантоного энтеровирус-специфического полипептида в качестве антигена при разработке диагностической тест-системы // Военная медицина. 2010. № 3. С. 87-91.
5. ЕгоровА.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высшая школа, 1991.
6. Казинец, О.Н. и др. Использование методов серо-и генодиагностики для лабораторной расшифровки вспышек энтеровирусных инфекций // Труды международной конференции (г. Санкт-Петербург, 22-23 апреля 2004 г.). СПб. 2004. C. 236-237.
7. Family Picornaviridae // Virus Taxonomy. Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses / Eds Stanway G. et al. London: Elsevier, 2005. P. 757-778.