CC BY
20
УДК 616.37-002.1-036.12-07:616.155.32-078.33
ИММУННЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ И РЕАКЦИЯ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ПАНКРЕАТИТОМ
А. Р. Хасанова, С. К. Шигапова, О. Е. Турышева, Э. Г. Муталова, Л. Н. Мингазетдинова
Башкирский государственный медицинский университет, г. Уфа
Хронический панкреатит — одно из частых заболеваний органов пищеварения, которое поражает ежегодно 1 человека на 10 000 населения, неизбежно приводит к прогрессированию функциональной недостаточности [2]. Хронический панкреатит относится к воспалительно-дистрофическим заболеваниям, активность которых во многом зависит от степени экспрессии про-воспалительных цитокинов и сопровождается развитием вторичной иммунной недостаточности (Лопаткин Е. Н., 1997; Reber Р., Buchier M., 1997; Scholmerich L. N., 1997).
Одной из причин иммунной недостаточности может быть усиление гибели им-мунокомпетентных клеток через механизм апоптоза [6, 8]. Состояние клеточного иммунитета, субпопуляционная структура лимфоцитов, уровень различных кластеров диффе-ренцировки, пролиферации и апоптоза лимфоцитов при хроническом панкреатите (ХП) практически не изучены. Остается не ясным влияние параметров внешней секреции на состояние иммунного ответа и апоптоз лимфоцитов периферической крови.
Цель работы — оценка состояния участников апоптоза клеточного и цитокинового комплексов у женщин с хроническим панкреатитом.
Материал и методы
Обследовано 46 женщин с хроническим рецидивирующим панкреатитом, находившихся на стационарном лечении в гастроэнтерологическом отделении клинической больницы, и 20 здоровых женщин-доноров, сопоставимых по возрасту, в качестве контроля. Средний возраст больных — 50,1±6,8 г., длительность заболевания — 8,3±3,5 г.
При постановке диагноза руководствовались классификацией А. В. Яковенко (1998), адаптированной к Марсельско-Римской классификации (1998). Критериями исключения стали сахарный диабет, заболевания желудка и печени, сердечно-сосудистой системы, острые нарушения мозгового кровообращения, хроническая сердечная недостаточность.
Среди клинических проявлений ХП ведущей жалобой больных были боли в животе, которые провоцировались нарушением диеты, приемом алкоголя. У подавляющего числа больных отмечались диспептические расстройства (анорексия, тошнота, рвота, вздутие живота, диарея). У 37,5% амилаза крови была повышенной и составила 64,2±1,32 ед.
Изучение иммунологического статуса проводилось путем определения общего количества лейкоцитов, лимфоцитов в периферической крови, иммунофенотипиро-
вания лимфоцитов (CD4+, CD8+, CD16+, CD25+, CD95+, HLA-DR+), оценки состояния клеточного иммунитета. Апоптоз клеток определяли методом проточной цитометрии на лазерном клеточном сортере-анализа-торе Facscalibur («Becton Dickinson», США) с помощью окрашивания клеток проподиу-мом иодида в конечной концентрации 50 мкг/мл. Процентное содержание лимфоцитов с морфологическими признаками фрагментации (М1) рассчитывали по одномерной гистограмме оранжевой флуоресценции клеток (FL2-A). Апоптотические клетки, ДНК которых подвергалась фрагментации (М3), формировали гиподиплоидный пик. Провоспалительные цитокины (ИЛ-ip, ИФН-у, ФНО-а) определяли твердофазным иммуноферментным методом (Ягода А. В. и др., 2000).
Результаты исследования
Основные параметры иммунного статуса представлены в таблице 1.
Состояние клеточного иммунитета характеризовалось снижением содержания Т-лимфоцитов (Е-РОК) на 13,4% при уменьшении общего числа лимфоцитов. В то же
время отмечено увеличение содержания В-лимфоцитов (Ет-РОК) до 7,3±0,38% (контроль — 5,7+0,24%, р<0,05). Получено увеличение концентрации иммуноглобулинов. Так, содержание ^ у больных ХП составило 2,99±0,19 г/л (в контроле — 2,1+0,16 г/л, р<0,01) или увеличено на 38%, а ^ вырос на 33,4% (12,06+0,64 и 9,0+0,58 г/л соответственно, р<0,05).
В процессе исследования выявились изменения субпопуляционной структуры лимфоцитов, которые характеризовались снижением Т-лимфоцитов, СД4+Т-лимфоцитов и увеличением В-лимфоцитов (табл. 2).
Уровень CD25+ (рецептор ИЛ-2) у больных ХП увеличился на 30,8% (р<0,01) по отношению к контрольной группе, что свидетельствует об активации Т- и В-лимфоцитов. Определялось статистически значимое снижение CD4+-лимфоцитов (-21,2%, р<0,05). Повышение цитотоксических лимфоцитов CD8+-клеток носило выраженный характер с высокой степенью достоверности. Уровень рецепторов ^ CDl6+-лимфоцитов, опосредующих антителозависимую цитотоксич-ность, повысился на 17,8% (р<0,05) по сравнению с контролем, а содержание лимфоцитов, экспрессирующих антигены гистосов-
Таблица 1
Состояние клеточного иммунитета у больных хроническим панкреатитом
Показатели Группа контроля (n=20) Больные ХП (n=46) р
Лимфоциты, % 34,56±1,39 32,1±4,5 >0,05
Лимфоциты, х109/л 1,36±0,2 1,28±0,24 >0,05
Т-лимфоциты (Е-РОК), % 64,95±1,18 57,24±1,78 <0,05
Т-лимфоциты (Е-РОК), х109/л 1,36±0,16 1,27±0,5 <0,05
Т-активные лимфоциты (Еа-РОК), % 23,15±0,64 21,73±0,89 <0,05
Т-активные лимфоциты (Еа-РОК), х109/л 0,31±0,02 0,37±0,05 <0,05
В-лимфоциты (Еm-РОК), % 5,7±0,24 7,3±0,38 <0,05
В-лимфоциты (Еm-РОК), х109/л 0,49±0,11 0,67±0,12 <0,05
Таблица 2
Субпопуляция лимфоцитов периферической крови больных хроническим панкреатитом
Показатели Контроль (П=20) Больные ХП (П=46) р
CD4+, % кл/мкл 39,74±1,2 32,86±1,80 <0,05
CD8+, % кл/мкл 26,02±0,9 29,05±0,86 <0,05
CD16+, % кл/мкл 12,33±2,7 16,05±1,18 <0,05
CD25+, % кл/мкл 11,3±1,1 14,8±1,52 <0,01
HLA-DR+, % кл/мкл 28,4±1,3 34,17±2,27 <0,05
CD95+(FaS), % кл/мкл 20,8±8,7 32,4±9,2 <0,01
Лимфоциты с морфологическими признаками фрагментации ядра (М1), % 0,362±0,08 0,476±0,01 <0,01
Покоящиеся лимфоциты, % 94,67±1,97 94,17±2,86 >0,05
Лимфоциты с увеличенным количеством ДНК, % 3,05±0,29 3,36±0,21 >0,05
Активационный коэффициент, 0,204±0,02 0,216±0,02 >0,05
местимости II класса (ША-ЭК), также высоко значимо возрастало у больных ХП (р<0,01), что подтверждается наличием прямой корреляционной связи с уровнем амилазы (г=0,41; р<0,05). Антигены ШЬА II класса появляются на поверхности клеток при наличии воспаления, что приводит к их дисфункции. Эти сдвиги закономерно привели к снижению иммунорегуляторного индекса (СЭ4+/СЭ8+), который составил 1,12±0,05 при контроле 1,52±0,05, что свидетельствует о дисбалансе регуляторных механизмов и является косвенным признаком иммунодефицита [11].
Уровень СЭ95+(Ра8)-маркер, отражающий готовность лимфоцита к апоптозу, был значимо выше у группы контроля (р<0,01). Также высоко значимо повышался процент лимфоцитов с морфологическими признаками фрагментации ядра -ц1 (конечный этап апоптоза). Он был на 30% выше, чем у группы контроля, и составил 0,476±0,039 при контроле 0,362±0,020. Уровень спонтанной пролиферации лимфоцитов ^О-фаза) у больных ХП достоверно не отличался от такового 68
у группы контроля, хотя имел тенденцию к снижению. Реакция бласттрансформации лимфоцитов в ответ на митогенную стимуляцию также незначимо была повышена. Вместе с активационным коэффициентом, который составил 0,21б±0,02б (контроль 0,204± ±0,022), эти показатели отражают функциональную активность лимфоцитов.
Корреляционные связи выявили отрицательное влияние СЭ95+ и ц1 на уровень лимфоцитов (г=—0,46 и г=—0,51 соответственно, р<0,05), где параметры ферментов слабо влияли на содержание лимфоцитов. На процент лимфоцитов с морфологическими признаками фрагментации ядра (ц1) сильное влияние оказывала активность амилазы (г=0,7б; р<0,01).
Провоспалительные цитокины (ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6) усиливают продукцию и увеличивают выраженность воспалительных процессов, а ФНО-а является также мощным индуктором апоптоза различных клеток.
При ХП выявлено повышение активности провоспалительных цитокинов. Анализ проведенных исследований показал значи-
мое повышение уровня ИЛ-1 р, составив 27,6+5,30 нг/мл при контроле 11,6+ +4,58 нг/мл (р<0,01). Интерферон ИФНу по своему содержанию также отличался от контрольной группы (41,0+5,62 нг/мл и 32,59+5,31 нг/мл соответственно). Наиболее выраженной была экспрессия ФНО-а, он превышал экспрессию в контрольной группе в 5,2 раза. Если учесть, что основной путь инициации апоптоза реализуется через систему мембранно связанных белков семейства туморнекротических рецепторов, то стимуляция выделения ФНО-а, безусловно, запускает целый каскад реакций, способствующих развитию воспаления и локальной ишемии
[1, 4].
Полученные изменения имели определенные закономерности. Наибольшее участие принимает последний вид цитокинов — ФНО-а, его экспрессия высоко значимо превышала таковую в контрольной группе (р<0,001), уровень экспрессии ИФНу был статистически незначим (рис. 1).
Рис. 1. Содержание цитокинов у больных хроническим панкреатитом.
Высокие значения уровней цитокинов, в частности, ФНО-а, ассоциировали с нарастанием CD25+ и CD95+Т-лимфоцитов, что определяло выраженный дисбаланс между популяциями. Проведенный корреляционный анализ показал взаимосвязь между уровнем CD95 и активностью амилазы (г=0,478; р<0,05).
Сравнительный анализ результатов обследования пациентов с хроническим панкреатитом показал, что у больных ХП имеются
выраженные изменения клеточного и гуморального звеньев иммунитета, проявляющиеся абсолютной и относительной лимфопе-нией, которая может быть связана с высокой апоптотической активностью, что подтвердилось наличием корреляционных связей.
Это проявилось увеличением экспрессии CD95+Т-лимфоцитов, оставаясь статистически значимым по сравнению со здоровыми (р<0,01). Рассчитанный показатель готовности апоптоза (ПГА) как отношение содержания CD95+ к числу CD25+ и НЬА^К+-лим-фоцитов и показатель вероятности к апоптозу (ПВА) как отношение CD95+-кле-ток к сумме содержания CD4+Т-лимфоцитов, CD8+Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов и Ж-клеток также были повышенными. Так, ПВА составил 0,16+0,01 (у здоровых — 0,11+0,08; р<0,01), а ПГА — 0,36+0,03 (при контроле 0,30+0,15; р<0,05), что подтверждает высокую готовность к апоптозу клеток у больных хроническим рецидивирующим панкреатитом в период обострения.
В целом, анализ проведенных наблюдений показал значительное превышение уровня цитокинов. В фазе обострения ХП происходит возрастание концентрации ИЛ-1 в, и наиболее выраженными оказались показатели ФНО-а, который высоко значимо превышал эти показатели в контрольной группе (р<0,01). В меньшей степени изменялся уровень ИФНу как иммунорегулирующий показатель в системе общего иммунитета.
Выявленная зависимость содержания CD95+(FaS)-лимфоцитов периферической крови у больных ХП в фазе обострения, а также повышение показателей вероятности (ПВА) и готовности (ПГА) к апоптозу определяют степень активации апоптотиче-ской реакции. Благодаря ассоциации с цито-скелетом иммунокомпетентных клеток CD95+Т-лимфоциты оказывают влияние на функциональную активность других рецепторов. Снижение экспрессии CD4+-клеток
ассоциировано с усилением Ра8-зависимого апоптоза.
Для хронического рецидивирующего панкреатита является характерным повышенная готовность организма женщин к удалению нежизненных клеток, к их обновлению, замене, дифференцировке. Это хорошо обеспечено клетками — участниками апо-птоза, как СЭ16 (Ж), СЭ25-ИЛ-2, СЭ25, и необходимыми цитокинами ИЛ-Щ ФНО-а и ИФНу, что свидетельствует о дисбалансе ре-гуляторных механизмов, становится дополнительным стимулятором воспаления и локальной ишемии и подтверждается данными других исследований [3, 5, 7, 9, 10].
Выводы
1. Пациенты с хроническим панкреатитом во время обострения имеют нарушения иммунного статуса, которые проявились лимфопенией, дефицитом Т-лимфоцитов, дисиммуноглобулинемией.
2. Развитие хронического панкреатита характеризуется нарастанием СЭ95+(Ра8)-Т-лимфоцитов периферической крови, ассоциируется с депрессией Т-звена иммунитета и изменением уровня амилазы, отражающей нарушение функции поджелудочной железы.
3. Отмечено усиление гибели лимфоцитов по механизму апоптоза, проявляющееся повышением показателей вероятности и готовности к апоптозу.
Библиографический список
1. Буеверов А. О. Медиаторы воспаления и поражение поджелудочной железы/А. О. Буе-веров//Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии.— М., 1999.— № 4.— С. 15—18.
2. Григорьев П. Я. Клиническая гастроэнте-рология/П. Я. Григорьев, А. В. Яковенко.— М.: Мед. информ. агентство, 1998.— 645 с.
3. Сибиряк С. В. Иммунофенотипирование лимфоцитов в клинической практике/ С. В. Сибиряк, Р. Ш. Юсупова, Н. Н. Курчатова.— Уфа, 1997.— 23 с.
4. Фаизова Л. П. Роль цитокинов в иммуно-патогенезе, оптимизации диагностики и лечения хронического панкреатита: ав-тореф. дис. ... д-ра мед. наук.— Уфа, 2004.— 244 с.
5. Хансон К П. Программированная клеточная гибель: молекулярные механизмы и роль в биологии и медицине/К. П. Хан-сон//Мед. химия.— 1997.— Т. 43.— № 6.—
C. 402—411.
6. Ярилин А. А. Апоптоз, роль в патологии и значимость его оценки при клинико-иммунологическом обследовании больных/А А. Ярилин, М. Ф. Никонова, А. А. Ярилина//Мед. иммунология.— 2000.— Т. 2.— № 1.— С. 7—16.
7. Ярилин А. А. Основы иммунологии/ А А. Ярилин.— М.: Медицина, 1999.— 606 с.
8. Aggarwae S. Increased activity of caspases 3 and caspases 8 in anti-fas-induced apoptosis in lymphocytes from ageing humans/S. Aggarwae, S. Gupta//Cein. exp. Immunol.— 1999.— Vol. 117.— P. 285—290.
9. Borgers M. Apoptosis/M. Borgers, L. Voipio-Pulkki, S. Yzumo//Cardiovasc. Res.— 2000.— Vol. 43.— Р. 525—527.
10. Verhagen A. M. Inhibitor of apoptosis proteins and their relatives: IAPs and others BIRPs/A. M. Verhagen, E. Y. Coulson,
D. A VauX///Genome Biology.— 2001.— Vol. 2.— № 7.— Р. 1—10.
11. Yung J. V. Apoptosis in rabbit haemorragic disease//. V. Yung, D. J. Lee, J. H. Tai et al.// J. comp. Pathol.— 2000.— Vol. 123.— Р. 135—140.
A. R. Khasanova, S. K. Shîgaрova, O. E. Turysheva, E. G. Mutalova, L. N. Mingazetdinova
IMMUNE INDICES AND REACTION OF LYMPHOCYTE APOPTOSIS IN PERIPHERAL BLOOD OF PATIENTS WITH CHRONIC PANCREATITIS
The state of participants of cellular and cytokine complex apoptosis in women with chronic pancreatitis (CP) was assessed. Examination of 46 women with chronic relapsing pancreatitis and 20 healthy women-donors (the control) was fulfilled. Investigation of immunological status was performed by means of determining the total number of peripheral blood leukocytes and lymphocytes, immunophenotyping of lymphocytes (CD4+, CD8+, CD16+, CD25+, CD95+, HLA-DR+). Cellular immunity state was also studied. Apoptosis of cells was estimated with the method of flow cytometry. Percentage of lymphocytes with morphological signs of fragmentation (M1) was calculated with unidimensional histogram of orange cellular fluorescence (FL2-A). In the process of investigation, changes in subpopulation structure of lymphocytes characterized by reduction
of T-lymphocytes, CD4+T-lymphocytes and growth of B-lymphocytes were revealed. Heightened readiness of female organism to removal of abiotic cells, their renewal, substitution, differentiation is typical for chronic relapsing pancreatitis. It is well provided by the cells - participants of apoptosis such as CD16 (NK); CD25-IL-2; CD25 and by necessary cytokines IL-1 p, TNF-a and IFNy that demonstrates dysbalance of regulatory mechanisms and becomes an additional stimulator of inflammation and local ischemia.
Exacerbation of chronic pancreatitis causes expressed disturbances of immune status characterized by depression of T-component of immunity. Intensification of the death of lymphocytes by apoptosis mechanism was noted.
Keywords: chronic pancreatitis, cytokines, apoptosis.
Контактная информация: Хасанова Анжелика Ринатовна, кандидат мед. наук, доцент кафедры госпитальной терапии № 1 Башкирского государственного медицинского университета, 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3, тел. 8 (3472) 50-30-20
Материал поступил в редакцию 10.07.2009
