CC BY
165
Об апоптозе лимфоцитов крови при аутоиммунных тиреопатиях
Проф., зав. каф. Е.Б. КРАВЕЦ, проф. О.И. УРАЗОВА, асп. Ю.В. НЕДОСЕКОВА 1, асп. А.В. РОГАЛЕВА Apoptosis of blood lymphocytes in autoimmune thyropathies
E.B. KRAVETS, O.I. URAZOVA, YU.V. NEDOSEKOVA, A.V. ROGALEVA
Сибирский государственный медицинский университет, Томск
В статье обсуждаются результаты исследования активности апоптоза лимфоцитов в крови у 81 больного с аутоиммунными тиреопатиями (аутоиммунным тиреоидитом — АИТ и диффузным токсическим зобом — ДТЗ). Показано, что при АИТ в состоянии гипотиреоза и ДТЗ отмечается увеличение содержания «предуготовленных» к апоптозу лимфоцитов CD95+ в крови. Кроме того, установлено, что течение АИТ и ДТЗ сопровождается увеличением содержания а-фактора некроза опухолей (ФНО-а) в сыворотке крови, сочетающимся при АИТ в состоянии эутиреоза с уменьшением концентрации интерферона-Y (ИФН-y) в крови. У больных АИТ с гипотиреозом продемонстрирована взаимосвязь между повышенной численностью лимфоцитов CD95+ и содержанием ФНО-а в сыворотке крови.
Ключевые слова: аутоиммунный тиреоидит, диффузный токсический зоб, лимфоциты, апоптоз, цитокины.
This paper reports the results of a study of lymphocyte apoptosis in the blood of 81 patients presenting with autoimmune thyropathies, such as autoimmune thyroidism (AIT) and Grave's disease (GD). It was shown that AIT in patients with hypothyroidism and DTG is associated with an increased number of CD95+ lymphocytes «doomed» to apoptose. Moreover, AIT and DTG conditions are characterized by an elevated level of serum tumour necrosis factor-alpha (TNF-а). In euthyroid patients with AIT, this rise is accompanied by a decrease in the interferon-gamma (IFN-y) level. Hypotyroid patients with AIT exhibit positive relationship between an increased number of CD95+ lymphocytes in blood and serum TNF-а levels.
Key words: autoimmune thyropathies, diffuse toxic goiter, lymphocytes, apoptosis, cytokines.
Среди хронических неинфекционных заболеваний патология щитовидной железы (ЩЖ) занимает одно из первых мест по заболеваемости и территориальной распространенности [1—3]. В структуре заболеваний ЩЖ аутоиммунным тирео-патиям (АИТП) принадлежит одно из ведущих мест. Согласно данным последних исследований [4], АИТП — сложные полигенные болезни, развитие которых определяется множеством генетических, эндогенных и экзогенных факторов.
В последние годы активно изучается способность иммунной системы влиять на функциональное состояние ЩЖ [5—7]. Установлена, в частности, способность провоспалительных лимфо- и моноки-нов оказывать прямое воздействие на гормональную активность тиреоидных клеток. Большое значение в развитии аутоиммунных заболеваний ЩЖ придается нарушению апоптоза лимфоцитов [8, 9].
В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение интенсивности апоптоза лимфоцитов крови и участия а-фактора некроза опухоли (ФНО-а) и интерферона у (ИФН-у) в ее модуляции при аутоиммунном тиреоидите (АИТ) и диффузном токсическом зобе (ДТЗ).
Материал и методы
В исследование был включен 81 пациент (2 мужчины и 78 женщин в возрасте 19—60 лет) с диагнозом хронического АИТ и ДТЗ. Все больные
были разделены на группы в зависимости от нозологической формы и функциональной активности ЩЖ. В 1-ю группу были включены 46 пациентов с АИТ (при этом ранее был диагностирован гипотиреоз, пациенты получали заместительную терапию левотироксином не менее 6 мес и на момент обследования была достигнута компенсация гипотиреоза), 2-ю группу составили 20 пациентов с АИТ с гипофункцией ЩЖ (не получавшие заместительную терапию). В 3-ю группу вошли 15 пациентов с ДТЗ (тиреотоксикоз различной степени тяжести). В контрольную группу были объединены 15 условно здоровых добровольцев (мужчина и 14 женщин) аналогичного возраста.
Диагноз АИТ и ДТЗ устанавливали на основании характерных клинико-лабораторных признаков. Диагноз АИТ верифицировали на основании характерных ультрасонографических признаков, обнаружения в сыворотке крови повышенного титра антитиреоидных антител (антител к тиреопе-роксидазе и/или тиреоглобулину) и первичного гипотиреоза в момент обследования либо в анамнезе заболевания — манифестного или стойкого субклинического. При диагностике ДТЗ обращали внимание на наличие характерных жалоб и клинической картины тиреотоксикоза, данных физикального обследования, характерных ультрасонографиче-ских признаков, наличие в сыворотке крови повышенного титра антитиреоидных антител (антител к тиреопероксидазе и/или тиреоглобулину), харак-
© Коллектив авторов, 2010 16
'e-mail: nedosekova@yandex.ru
терных изменений гормонального статуса — низкий уровень тиреотропного гормона (ТТГ) в сочетании с повышенной концентрацией свободных фракций трийодтиронина (Т3) и тироксина (Т4) [2, 4]. Критериями исключения пациентов из исследования были наличие в анамнезе и на момент обследования видимой сопутствующей инфекционной и неинфекционной патологии, онкологических заболеваний, вакцинация и прием иммуномодулирующих препаратов в течение 6 мес, предшествующих исследованию.
Материалом для исследования служила периферическая кровь, забранная из локтевой вены утром натощак в количестве 5 мл.
Апоптотический потенциал лимфоцитов периферической крови оценивали путем идентификации клеток CD95 в условиях in vitro с помощью мо-ноклональных антител CD95 (Сорбент, Москва) в лимфоцитотоксическом тесте по методу Р.В. Петрова и соавт. [10]. Для количественного определения концентраций ФНО-а и ИФН-у в сыворотке крови использовали наборы реагентов а-ФНО-ИФА-БЕСТ и у-интерферон-ИФА-БЕСТ (Вектор-Бест, Новосибирск).
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0. Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, применяли непараметрический критерий Манна—Уитни, а для выборок, подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали критерий Стьюдента. Степень зависимости между параметрами внутри исследуемых групп оценивали с помощью ранговой корреляции Спирмена. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05 [11].
Результаты и обсуждение
Согласно современным представлениям [5, 12], АИТ и ДТЗ рассматриваются как заболевания, обусловленные генетическим дефектом Т-супрессо-ров. Этот дефект способствует выживанию «запрещенных» клонов Т-лимфоцитов, которые появляются в результате случайной мутации и способны к взаимодействию с антигенами рецепторного аппарата фолликулярного эпителия, оказывая повреждающее действие на тиреоциты. Т-супрессоры при взаимодействии с В-лимфоцитами индуцируют синтез антител. Кроме того, экзогенные антигены, имеющие в своем составе перекрестные антигены с компонентами мембраны тиреоцитов, способствуют выработке аутоантител [1]. Как при АИТ, так и при ДТЗ, обнаруживаются антитела к тиреоидным антигенам — тиреоидной пероксидазе, тиреогло-булину [6, 13]. Другая фракция иммуноглобулинов,
получивших название «тиреостимулирующие иммуноглобулины» (ТСИГ), при связывании с рецепторами к ТТГ способна вызывать гиперфункцию тиреоцитов, усиление синтеза и секреции гормонов. В активной фазе заболевания ТСИГ определяются у 90% больных ДТЗ. Гиперфункция ЩЖ, возникающая под влиянием ТСИГ, сопровождается гипертрофией ее паренхимы, повышением концентрации тиреоидных гормонов в крови [1, 13].
Огромную роль в функционировании иммунной системы играет апоптоз, обеспечивающий элиминацию лимфоцитов с генными мутациями или с неадекватной специфичностью рецепторов, чужеродных клеток, аутоагрессивных лимфоцитов, старых и «отработавших» клеток, выполнивших свою функцию [14—16]. Реализация программы клеточной гибели, в том числе при аутоиммунных заболеваниях, на настоящее время активно изучается, причем наибольший интерес вызывает регулирующее влияние на апоптоз биологически активных веществ — цито-кинов [14—19]. Выявлена группа цитокинов: ФНО, интерлейкин (ИЛ)-1, p-токоферол, способных индуцировать апоптоз. Цитокининдуцированный апоп-тоз — сложный механизм. В этом виде апоптоза на клетку не действуют внешние антиапоптотические факторы, отсутствует генетическая блокада апопто-за, не активируются репарационные процессы. Другая группа цитокинов (ИЛ-2, 3, 4, 10, ИФН-а) запускает программу защиты от апоптоза посредством активации белков Bcl-2, Bcl-х [13, 20, 21].
В ходе исследования было установлено, что уровень презентации рецепторов CD95 на лимфоцитах у больных АИТ в состоянии эутиреоза соответствовал таковому у здоровых доноров, в то время как в группе больных АИТ с гипофункцией ЩЖ и при ДТЗ отмечалось достоверное увеличение количества лимфоцитов CD95+ по сравнению с нормой в среднем в 2 раза (см. таблицу).
Известно, что зрелые Т- и В-лимфоциты в неактивном состоянии лишены мембранного рецептора Fas и экспрессируют протоонкогены Вс1-2 и Вс1-х1, что определяет их устойчивость к индукторам апоптоза [21]. Положение меняется на обратное при активации лимфоцитов, что, несомненно, наблюдается в случае развития антитиреоидного аутоимму-нитета. Увеличение экспрессии Fas/CD95 на лимфоцитах сопровождается ростом чувствительности клеток к соответствующему лиганду — Fas-L, связывание с которым определяет запуск программы гибели клеток [9, 22, 23]. Следовательно, учитывая, что увеличение уровня экспрессии рецептора Fas на лимфоцитах отражает их готовность к апоптозу, которая в условиях активации клеток аутоантигеном (как при АИТП) и взаимодействия Fas-R с Fas-L реализуется в гибель клетки, мы можем расценивать увеличение числа лимфоцитов CD95+ у пациентов с АИТ в стадии гипотиреоза и у больных с ДТЗ в каче-
Таблица. Содержание лимфоцитов CD95+ в периферической крови и цитокинов (ФНО-а, ИФН^) в сыворотке крови у больных АИТ и ДТЗ (М±т)
Показатель
Больные АИТ
Здоровые доноры -
( =15) компенсированный гипоти- некомпенсированный гипо-
реоз (n=46)
тиреоз (n=20)
Больные ДТЗ (n=15)
Лимфоциты CD95+, % 12,56+0,69 13,88+2,11 23,87+5,03 24,44+2,91
р<0,05 р<0,05
ФНО-а, пг/мл 1,34+0,25 10,84+0,49 6,08+1,44 6,62+1,11
р<0,01 р<0,01 р<0,01
ИФН-y, пг/мл 83,26+17,58 54,71+4,85 83,26+17,58 59,51+16,89
р<0,05
Примечание. р — для различий по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров. АИТ — аутоиммунный тиреоидит; ДТЗ — диффузный токсический зоб; ФНО-а — а-фактор некроза опухолей; ИФН-у — интерферон-у.
стве признака не только повышенной «предуготов-ленности» лимфоцитов к апоптозу, но и активации программированной гибели клеток.
Увеличение числа лимфоцитов CD95+ у больных АИТ в стадии гипотиреоза также могло быть связано с функциональным состоянием ЩЖ. Ти-реоидные гормоны способны оказывать мембра-нотропный эффект, влиять на электрическую стабильность и мембранный потенциал лимфоцитов. Свободные тиреоидные гормоны регулируют пассивный ток натрия внутрь клеток через ионные каналы, который при избытке гормонов усиливается, при недостатке — тормозится [24]. В соответствии с этим усиливается или тормозится активный ток натрия в обратную сторону, что направлено на поддержание нормального трансмембранного электрохимического потенциала клеток. В свою очередь падение трансмембранного потенциала является одним из наиболее значимых факторов запуска каскада реакций гибели клетки [25, 26].
Другое возможное объяснение гибели лимфоцитов у больных с АИТП — изоляция иммуноло-гически «привилегированных» зон от проявлений активности эффекторных клеток иммунной системы. К числу таких зон относится ткань ЩЖ, клетки которой с целью «самообороны» эспрессируют ли-ганд Fas. В результате эффекторные Т-лимфоциты, экспрессирующие рецептор Fas, неизбежно гибнут в процессе миграции через данный барьер вследствие взаимодействия рецептора Fas с лигандом Fas барьерных клеток [27].
Как отмечалось выше, немаловажную роль в модуляции апоптоза играют цитокины, прежде всего ФНО-а. Апоптоз, индуцированный ФНО, реализуется через специфические рецепторы — TNF-R1 и TNF-R2. ФНО-а относят к гомологам лиганда Fas, что свидетельствует о его высокой апоптогенной активности. Кроме того, апоптоз, индуцированный связыванием TNF-а с TNF-R1, подобно взаимодействию Fas-R с Fas-L, может осуществляться через путь FADD—каспаза 8, а также сходный с ним адапторный белок TRADD (TNF-R-associated death
domain). В то же время гиперэкспрессия TRADD ведет не только к запуску апоптоза, но и к активации ядерного фактора кВ (NFkB), который предотвращает индуцированную ФНО гибель клетки [22, 23, 27].
При изучении содержания ФНО-а в сыворотке крови у больных АИТП показано многократное повышение концентрации цитокина независимо от формы заболевания и функционального состояния ЩЖ (см. таблицу). Наряду с этим при корреляционном анализе у больных с АИТ с гипотиреозом выявлена положительная связь между концентрацией ФНО-а и численностью лимфоцитов CD95+ в крови (r=0,739; р<0,05), что подтверждает данные литературы [27] о способности ФНО-а (равно как и ряда иных провоспалительных цитокинов — ИЛ-1, 2, ИНФ-у и др.) индуцировать экспрессию Fas-R на мембране клеток.
По мнению ряда исследователей [9, 28], уровень продукции ФНО-а при АИТП определяется выраженностью аутоиммунного процесса. По данным литературы, при контакте с антигеном происходит активация антигенраспознающей функции имму-нокомпетентных клеток с последующей выработкой ими ряда цитокинов, участвующих в индукции аутоиммунного процесса, в частности ФНО-а. Этот фактор играет важную роль в развитии аутоиммунных заболеваний ЩЖ, поскольку принимает непосредственное участие в регуляции пролиферации антигенспецифических клонов Т-, В-лимфоцитов и продукции аутоантител. Он также обладает способностью усиливать экспрессию на поверхности тиреоцитов антигенов гистосовместимости (HLA) II класса, что может обусловливать нарушение процессов антигенного распознавания и запуск антити-реоидного иммунитета. Наряду с этим ФНО-а осуществляет коррекцию численности цитотоксиче-ских лимфоцитов, поражающих собственную ЩЖ, т.е. представляет собой некий компонент защитной реакции макроорганизма, контролирующей «силу» аутоиммунного процесса. Это позволяет предполагать, что повышение содержания ФНО-а в крови
у больных АИТП может быть не только критерием оценки активности аутоиммунного процесса, но и позитивным прогностическим признаком, что совершенно очевидно зависит от степени увеличения концентрации цитокина.
Определенную роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний играет ИФН-у. Существует мнение [6, 28, 29], что ИФН-у ингибирует транскрипцию гена тиреоглобулина, модулирует функционирование и пролиферацию фолликулярных клеток ЩЖ, экспрессию HLA II класса на поверхности тиреоцитов.
Содержание ИФН-у в сыворотке крови у пациентов с АИТ в состоянии эутиреоза оказалось пониженным. При этом у больных АИТ с гипофункцией ЩЖ и ДТЗ концентрация данного цитокина сохранялась в пределах контрольного уровня (см. таблица).
По всей видимости, сохранение уровня ИФН-у в крови в пределах нормы у больных АИТ с гипотиреозом и пациентов с ДТЗ также следует считать благоприятным фактором, поскольку ИФН-у, являясь эффективным механизмом отрицательной обратной связи контроля гиперпродукции провос-палительных цитокинов, нормализует количество клеток CD95+, стимулирует процессы репарации ДНК, что служит фактором защиты клеток от преждевременной гибели [6, 15, 16, 30]. Однако значимых корреляций между концентрацией ИФН-а и содержанием ФНО-а и лимфоцитов CD95+ в крови у больных АИТ и ДТЗ нами не зарегистрировано.
Таким образом, полученные в ходе настоящего исследования результаты свидетельствуют о стимуляции апоптоза циркулирующих лимфоцитов у больных ДТЗ и АИТ с гипофункцией ЩЖ, которая в последнем случае проявляет выраженную взаимосвязь с повышенным уровнем в крови ФНО-а. Указанные изменения, по нашему мнению, представляют большой интерес, поскольку имеют не только научную, но и практическую значимость и могут быть использованы как в оценке нарушений иммунного статуса при АИТ и ДТЗ, так и для прогнозирования течения, предупреждения неблагоприятных исходов и обоснования дифференцированного подхода к выбору тактики иммунокорригирующей терапии отдельных клинических форм аутоиммунного поражения ЩЖ.
Выводы
1. Признаком стимуляции апоптоза при АИТ в стадии гипотиреоза и ДТЗ является увеличение содержания «предуготовленных» к апоптозу лимфоцитов CD95+ в крови.
2. Течение АИТ и ДТЗ сопровождается увеличением содержания ФНО-а в сыворотке крови, сочетающимся при АИТ с уменьшением концентрации ИФН-а в крови.
3. Уровень CD95-позитивных циркулирующих лимфоцитов при АИТ в состоянии гипотиреоза зависит от содержания ФНО-а в сыворотке крови.
ЛИТЕРАТУРА
1. Валдина Е.А. Заболевания щитовидной железы. 3-изд. Ст-Петербург: Питер 2006;368.
2. Дедов И.И., Мельниченко Г.А., Фадеев В.В. Эндокринология. М: Медицина 2000;638.
3. Зефирова Г.С. Заболевания щитовидной железы М: Арт-Бизнес-Центр 1999;215.
4. Болезни щитовидной железы. Под ред. Л.И. Браверманна. М: Медицина 2000;417.
5. Болотская Л.А., Маркова Т.П. Клинико-иммунологическая характеристика больных аутоиммунным тиреоидитом. Иммунология 2002;3:175—177.
6. Глазанова Т.В., Бубнова Л.Н., ТрунинЕ.М. и др. Продукция некоторых цитокинов у больных с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы. Пробл эндокринол 2004;3:29— 32.
7. Champion B.R., Cooke А., Rayner D.C. Thyroid autoimmunity. Curr Opin Immul 1992;6:770—780.
8. Кандрор В.И., Бабкина И.В., Крайнова С.И. и др. Повышение уровня FAS-лиганда в сыворотках как возможный механизм их антитиреоидной цитотоксичности при аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы. Бюл экспер биол 2004;7:45—47.
9. Giordano C., Stassi G., De Maria R. Potential involvement of Fas and its ligands in the patogenesis of Hashimoto' s thyroiditis. Science 1992;3:275—530.
10. Петров Р.В., Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Оценка иммунного статуса человека при массовых обследованиях. Иммунология 1992;6:51-62.
11. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistika. М: Медиа Сфера 2002;312.
12. Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. М: Медицина 2000;432.
13. Состояние иммунитета при патологии щитовидной железы у детей Сибирского региона: Сборник научных трудов. Под ред Л.М. Огородовой, В.М. Алифировой. Томск 2004;338.
14. ЛушниковЕ.Ф. Гибель клетки. М: Медицина 2001;214.
15. Андреева Л.И., Иванова Л.И., Титова М.В., Петрова В.С. Биохимические механизмы апоптоза. Программированная клеточная гибель. Ст-Петербург 1996;51 —71.
16. Попов Л.С., Корочкин Л.И. Генетически программированная смерть клеток (апоптоз). Генетика 2004;2:149-166.
17. Симбирцев А.С. Цитокины — новая система регуляции защитных реакций организма. Цитокины и воспаление 2002;1:9-15.
18. Ярилин А.А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме. Патол физиол 1998;2:38-48.
19. Blagosklonny M. Cell death beyong apoptosis. Leukemia 2000;14:1502-1518.
20. Казначеев К.С. Механизмы развития цитокининдуцирован-ного апоптоза. Гематол и трансфузиол 1999;1:40-43.
21. Потапнев М.П. Апоптоз клеток иммунной системы и его регуляция цитокинами. Иммунология 2002;4:237-242.
22. Ashkezi A., Dherin V.M. Death receptors. Signaling and modulation. Scince 1998;281:1305-1308.
23. Van Parijs L, Biuckians A., Abbas A.K. Functional roles of Fas and Bcl-2-regulated apoptosis of T-lymphocytes. Immunology 1998;160:2065-2071.
24. Новицкий В.В., КозловЮ.А., Лаврова В.С., Шевцова Н.М. Гормоны, гемопоэз, эволюция. Новосибирск: Наука1997;432.
25. Бойчук С.В., Мустафин И.Г. Fas-рецептор и его роль при ато-пических заболеваниях. Иммунология 2001;3:24-29.
26. Суханова Г.А., СеребровВ.Ю. Биохимия клетки. Томск: Чародей 2000;184.
27. De Maria R, Testi R. Fas-Fas L interactions: a common pathogenetic mechanism in organ-specific autoimmunity. Immunol Today 1998;19:121—250.
28. Благосклонная Я.В., Кетлинский С.А., Красильникова Е.И. и др. Содержание фактора некроза опухоли а и интерлейкина-1 в сыворотке крови пациентов при аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы. Пробл эндокринол 1998;4:22—24.
29. Григорьева Т.Ю., Никонова М.Ф., Ярилин А.А. Различная чувствительность к индукции апоптоза Т-лимфоцитов субклассов CD4+ и CD8+. Иммунология 2002;4:148—152.
30. Владимирская Е.Б. Механизмы апоптотической смерти клеток. Гематол и трансфузиол 2002;2:35—40.
