CC BY
162
Медицинская Иммунология 2002, Т. 4, № 4-5, стр 637-644 © 2002, СПб РО РААКИ
Краткие сообщения
ПАРАМЕТРЫ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА И ЦИТОКИНОВОГО СТАТУСА У БОЛЬНЫХ РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ
Бисага Г.Н., Калинина Н.М.*, Акимов С.Б., Давыдова Н.И.*
Кафедра нервных болезней Военно -медицинской академии,
* Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины МЧС России, Санкт-Петербург
Резюме. С целью определения роли цитокинов в патогенезе и их зависимости от иммуногенетических маркеров при рассеянном склерозе обследовано 68 больных с достоверным диагнозом заболевания и 50 здоровых доноров. Субпопуляции лимфоцитов исследовали с использованием моноклональных антител серии ИКО (МБС, Москва) к антигенам CD3 (Т-лимфоциты), CD4 (Т-хелперы), CD8 (цитотоксические Т-лимфоциты), CD20 (В-лимфоциты), CD25 (рецептор IL2), CD 16 (натуральные киллеры), CD95 (активированные клетки, готовые к апоптозу). Концентрацию цитокинов в сыворотке крови и культуральной среде определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. HLA антигены исследовали в стандартном лимфоцитотоксическом тесте.
Установлено снижение при рассеянном склерозе по сравнению с контролем уровней CD3 (р<0,001), CD4, CD8, CD20 и CD16, увеличение индекса CD4/CD8, CD95 (р<0,01), CD25. Уровень CD95 при рассеянном склерозе коррелировал с CD4 (r=0,50; р<0,05), CD4/CD8 (r=0,64; р<0,01), CD16 (г=0,47; р<0,05). Спонтанная продукция IL-2, IL-6, IL-8 и TNFa и сывороточная продукция IL-1 {3, IL-4, IL-6, IL-8 и TNF-a при рассеянном склерозе были повышены, а индуцированная секреция IL-6 и IL-8 снижена по сравнению с контролем. У пациентов с рассеянным склерозом, имеющих HLA DR2 антиген (DR2 (+) больных) по сравнению с DR2 (-) больными было установлено повышенное содержание CD3 (р<0,05), CD4 (р<0,05), CD16 (р<0,05) и CD25, но спонтанная продукция IL1(3 (р<0,01) и стимулированная секреция IL-6, IL-8 (р<0,05) и TNFa были снижены. У DR2 (-) пациентов в сравнении с DR2 (+) и контролем были снижены уровни всех субпопуляций лимфоцитов, особенно CD8 (р<0,001), но спонтанная продукция IL-8 (р<0,01) была повышена, так же как сывороточная продукция in vivo IL-4 в сравнении с контролем.
Полученные данные свидетельствует об активации при рассеянном склерозе апоптоза лимфоцитов, направленного на уничтожение активированных лимфоцитов, и о преобладании Т хелперного ответа 1 типа. DR2-aHTHreH не обуславливает тяжести иммунологических нарушений, а характеризует лишь предрасположенность к возникновению заболевания.
Ключевые слова: рассеянный склероз, лимфоциты, цитокины, апоптоз, DR2-aHmuzeu.
Bisaga G.N., Kalinina N.M., Akimov S.В., Davidova N.I.
CELLULAR IMMUNITY AND CYTOKINE PROFILE IN MULTIPLE SCLEROSIS
Abstract. In order to determine the role of cytokines in pathogenesis of multiple sclerosis (MS) and their dependence upon immunogenetic markers, 68 patients with proved MS and 50 healthy donors were examined. The subpopulations of lymphocytes were investigated with the help of monoclonal antibodies (Moscow) against CD3 (T-lymphocytes), CD4 (T-helpers), CD8 (T-cytotoxic lymphocytes), CD20 (B - lymphocytes), CD25 (receptors of IL-2), CD16 (natural killers), CD95 (activated cells ready to apoptosis). By means of ELISA test IL-2, IL-4, IL-6 and TNF-a levels were measured.
--------------------------------------------- HLA antigenes were investigated by lymphocytotoxic test
Адрес для переписки: ¡n order to reveal HLA-antigens I and II class.
Бисага Геннадий Николаевич, кафедра нервных In Ms we found the decrease in CD3 (p<0,001), CD4,
болезней Военно-медицинской академии. CD8, CD20 and CD16 levels, but the increase in CD95
175044, Санкт-Петербург, Лесной пр., 2. (p<0,01), CD4/CD8 and CD25 levels, comparing to the
Тел.: 542-34-20. Факс.329-71-71. control. CD95 levels in MS correlated with CD4 (r=0,50;
E-mail: [email protected] p<0,05), CD4/CD8 (r=0,64; p<0,01) and CD16 (r=0,47;
p<0,05) levels. Spontaneous production of IL-2, IL-6, IL-8 and TNF-a and serum production in vivo of IL-4, IL-6, IL-8, TNFa and IL1(3 in MS increased, and the stimulated secretion of IL6 and IL8 was reduced, comparing to the control.
We found in DR2 (+) MS patients, comparing with DR2 (-) patients and the control, the increase in CD3 (p<0,05), CD4 (p<0,05), CD16 (p<0,05) and CD25, but spontaneous production of IL-ip (p<0,01) and stimulated secretion of IL-6, IL-8 (p<0,05) and TNF-a were reduced, comparing to the control. In DR2 (-) patients the levels of all lymphocyte subpopulations were decreased, especially of CD8 (p<0,001), but spontaneous production of IL-8 (p<0,01) was increased in comparison with the control and DR2 (+) patients; IL-4 serum production in vivo also increased, when compared the control.
The obtained data indicates lymphocyte apoptosis activation aimed at destruction of activated lymphocytes. The data suggests the Thl-type response prevalence in MS. The severity of immunological disturbances is not conditioned by DR2 antigen. DR2 characterizes only the predisposition to MS development. (MeiLImmunol., 2002, vol.4, N 4-5, pp 637-644)
Рассеянный склероз (РС) - демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), развивающееся в результате повреждения олигодендроглии и миелиновых оболочек нервных волокон цитотоксическими Т-лимфоцитами. К настоящему времени участие иммунной системы в патогенезе РС является доказанным фактом [9]. Однако тонкие механизмы, посредством которых запускается процесс Т-клеточной цитотоксичности в отношение олигодендроцитов и миелиновой оболочки нервных волокон, пока недостаточно изучены [3].
Цитокины, как регуляторы межклеточного взаимодействия, непосредственно участвуют в комплексе иммунных реакций и модулируют реактивность иммунокомпетентных клеток. Лимфоцитарная инфильтрация в ЦНС является ключевым событием в иммунопатогенезе РС. Микроглия и резидентные макрофаги ЦНС могут способствовать этому процессу, вырабатывая хемоаттрактанты, стимулирующие проникновение лимфоцитов через ге-мато-энцефалический барьер. Исследованию состояния системы цитокинов посвящено множество публикаций зарубежных и отечественных авторов, в которых изучены уровни секреции почти всех известных цитокинов у больных РС.
Как правило, при РС обнаруживали изменения продукции не одного, а нескольких цитокинов [10, 14], секреция которых характерна для определенных субпопуляций лимфоцитов, например, различных типов Т-хелперов. Поэтому нередко патогенез РС рассматривают с точки зрения участия Т-хелперов 1 (ТЫ) и 2 (ТЬ2) типов в запуске и поддержании иммунного ответа. Принято считать, что развитие ответа по ТЫ или ТЬ2 типу зависит от таких факторов, как природа иммуногена, исходный ци-токиновый профиль пациента, доза антигена в момент антигенпредставления или наличие генетической предрасположенности индивида к преимущественному характеру ответа. При несостоятельности ТЫ ответа, критерием чего может служить длительность персистенции или неэффективность элиминации патогена, наблюдается распространение повреждений и присоединение ТЬ2 ответа. ТЬ2 клетки способны ограничить неадекватный ТЫ ответ и с этих позиций являются частью супрессорного механизма для чрезмерного и/или несоответствующего ситуации ТЫ ответа [11]. Оба типа Т хелперов ха-
рактеризуются продукцией определенных цитокинов. Так, если ТЫ продуцируют интерферон-гамма (INFy), интерлейкин (IL)-1(3, IL-2, TNFa, то Th2 -IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. У больных PC обнаружено преобладание Thl иммунного ответа [16] и увеличение митоген стимулированной продукции цитокинов Thl типа по сравнению с контролем. При активном РС по сравнению со стабильным продукция цитокинов Thl типа также повышена [13].
На экспериментальной модели РС установлено, что антигены, которые индуцируют Th2 ответ, могут в достаточной мере модифицировать взаимоотношения в цитокиновой сети и изменять спектр продуцируемых цитокинов, ограничивать пролиферацию аутореактивных Т- клеточных клонов, и, в конечном счете, обеспечивать значимую защиту против экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита [12], являющегося моделью РС.
Ввиду того, что единого мнения относительно участия цитокинов в развитии патологического процесса при РС нет, целью настоящего исследования явилось изучение цитокинового статуса у больных РС и его связи с иммуногенетическими маркерами.
Материалы и методы
Обследовано 68 больных с достоверным диагнозом РС в возрасте от 15 до 48 лет, из них 19 мужчин и 49 женщин. Средний возраст составил 35,1 ±2,8 лет, средний возраст начала заболевания - 24,9±2,3 года, средняя продолжительность заболевания -11 ±2,4 года. Степень тяжести заболевания по шкале J.Kurtzke (1983) - 3,1 ±1,0. У 41 пациентов (60%) наблюдали ремиттирующее течение, у 27 (40%) -прогредиентное. В состоянии ремиссии были 16 пациентов, декомпенсации - 20 , обострении - 10. Декомпенсацией считали повторное возникновение имевшегося когда-либо ранее симптома, либо усиление выраженности существовавшего более 1 месяца симптома на срок более 24 часов. Контрольная группа состояла из 50 здоровых доноров.
Мононуклеары периферической крови выделяли на градиенте плотности фиколл-пака («Pharmacia») по методу A. Boyum. Субпопуляции лимфоцитов исследовали в лимфоцитотоксическом тесте, использовали моноклональные антитела серии ИКО (МБС, Москва) к антигенам CD3 (Т-лимфо-
циты), CD4 (Т-хелперы), CD8 (Т-цитотоксические лимфоциты), CD20 (В-лимфоциты), CD25 (рецептор IL2), CD16 (натуральные киллеры), CD95 (активированные клетки, готовые к апоптозу) и «активационному маркеру»-НЬАП (к инвариантной цепи).
Продукцию фактора некроза опухоли альфа (TNFa), IL-ip, IL-4 определяли после культивирования цельной крови, разведенной 1:10 средой Игла с глутамином и гентамицином в течение 24 часов в присутствии индуктора - ФГА и ЛПС-содержащего препарата проди-гиозана. Концентрацию цитокинов в сыворотке крови и культуральной среде определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента («Протеиновый контур», Санкт-Петербург).
IL-2 и IL-6 определяли с помощью стандартного теста поддержания пролиферации IL-2 зависимой Т-клеточной перевиваемой линии (CTLL-2) и IL-6 зависимой гибридомы мыши В9 соответственно. Уровни биологической активности IL-2 и IL-6 рассчитывали, сравнивая значение со стандартным препаратом [6], одна единица соответствовала концентрации 1 пг/мл.
Для определения адгезии использовали нейтро-филы (2-106 клеток/мл среды Игла с добавлением 10% сыворотки плода коровы), которые инкубировали 1 ч при 37° С. Фиксацию и окраску проводили кристалл-виолетом на 30° С метаноле в течение 10 мин. Результаты оценивали с помощью фотометра для микропланшетов при длине волны 595 нм. Для определения стимулированной адгезии добавляли 10 мкл форболмиристат ацетата (10 нг/мл). Расчет спонтанной и стимулированной адгезии проводили в процентах по отношению к фону.
Исследование Н LA-системы у обследуемых лиц проводили в стандартном лимфоцитотоксическом тесте с использованием панели антилейкоцитарных сывороток Республиканского центра иммунологического типирования тканей (Российского НИИ гематологии и трансфузиологии) и международного набора гистотипирующих стандартов.
Результаты и обсуждение
Выявлено достоверное снижение общего количества лимфоцитов (р<0,01) и Т-лимфоцитов (CD3) (р<0,001) у больных РС (табл. 1.1). Кроме того, наблюдали снижение уровней Т-хелперов и цитоток-сических лимфоцитов (CD4+ и CD8+). Отмеченное при РС более высокое значение индекса CD4 /CD8’ свидетельствует об относительном увеличении популяции Т-хелперов или миграции CD8+ лимфоцитов, носителей FasL, из периферической крови к миелиновым волокнам. Обнаружено также снижение количества В-лимфоцитов (CD20+) и естественных киллеров (CD16+) у больных РС по сравнению с контролем, что также может отражать аутоиммунный характер заболевания. Особого внимания заслуживает достоверное (р<0,01) увеличение при РС количества клеток, готовых к апоптозу (CD95+). Уровень этих клеток коррелировал с количеством Т-хелперов (CD4+; r=0,50; n=19; t=2,38; р<0,05), индексом дифференцировки (CD4/CD8; г=0,64; п=19; t=3,43; р<0,01), CD16+ (r=0,47; n-19; t-2,19; р<0,05). Корреляционная связь CD4+ клеток с CD95+ клетками выглядит вполне закономерной, поскольку Т-хелперы являются основными носителями маркера CD95+ в периферической крови. Наличие корреляционной связи между CD95+ и CD16+ с отсутствием ее между CD95+ и CD8+ позволяет предположить, что в элиминации CD4+ лимфоцитов и снижении их числа на периферии (посредством взаимодействия CD4+CD95+ лимфоцитов с клетками, несущими FasL), CD8+ лимфоциты не участвуют. Большая часть CD8+ лимфоцитов, несущих FasL, устремляется к Fas несущим олигодендроцитам и участвует в их уничтожении. CD16+ лимфоциты, также несущие на себе FasL могут участвовать в апоптозе клеток глии, но миграция их к олигодендроглии затруднена, в отличие от CD8+ лимфоцитов.
При РС выявлено повышение числа лимфоцитов, несущих рецептор к IL-2 (CD25), что, очевидно, свидетельствует об активации иммунной системы и компенсаторном увеличении числа клеток,
Табл. 1.1. СУБПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ РС И ЗДОРОВЫХ ЛИЦ (в мм3)
Показатель I К CD3 1 CD4 1 С08 CD4/8 CD20 С025 HLA II CD16 соэЦ
Контроль (п=50) Ср знач. Ср кв Ош. » z рп Z §• 1,13 0,5 418 29,1 рв 448 29 424 37,2 \щ
Больше РС (п=68) Ср знач. 6498 1921 У'! 497 In 1,25 380 382 466 385 265jB
Ср кв Ош. 295 97,5 .48,7 28,8 23,7 0,05 23,5 23 29,4 23,6 5Q,2¡|f
Т | 3,22 3,22 2,16 2,93 2,06 • 3.2Я
Примечание:* - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001,- нет данных; выделены достоверные показатели.
отвечающих на IL2 на фоне снижения CD3+, CD4+, CD8+.
Уровни продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови (МНПК) и концентрации цитокинов в сыворотке у больных PC и контроле представлены в таблице 1.2.
Спонтанная продукция ILlb при PC не изменена, IL2, IL6, IL8, TNFa повышена. Для IL8 - фактора миграции лимфоцитов - это различие высокозначимо. Индуцированная продукция IL-lß, IL-2, TNF-a у больных PC не изменена, а индуцированная продукция IL-6 и IL-8 снижена (р<0,01 и р<0,05 соответственно). Повышена сывороточная продукция in vivo IL-4, IL-6, IL-8, TNF-a, IL-lß.
Таким образом, при PC снижены общее количество лимфоцитов, Т-лимфоцитов (CD3), Т-хелпе-ров (CD4), T-киллеров (CD8), индуцированная продукция IL-6, IL-8, повышены: число лимфоцитов с рецепторами для IL-2 (CD25), клеток с начавшимся апоптозом (CD95), спонтанная продукция IL-8 и сывороточная концентрация IL-4.
Известно, что заболеваемость PC ассоциирована с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ). В исследованиях, проведенных в нашей стране, установлена связь PC с HLA-антигенами A3, В7, DR2 [1, 4, 8]. При этом, по нашим данным [2], на территории Северо-западного региона России наиболее сильная ассоциация существует для DR2 антигена. Кроме того, при PC установлена связь HLA фенотипа с уровнями продукции TNF-a, IL-10 [21]. Обсуждаются возможные ассоциации HLA-DR2 с аллелями TNF-aß [19] и TNF-ß2 [24], обуславливающие пониженные уровни секреции TNF [19]. В связи с этим мы попытались соотнести частоту выявления DR2 с уровнями продукции цитокинов при PC.
Проведен анализ субпопуляционного состава лимфоцитов и цитокинового профиля у групп больных PC: имеющих HLA-DR2 - DR2 (+) и без данного антигена - DR2 (-). Обнаружено увеличение
практически всех показателей клеточного иммунитета (таблица 2.1) у группы больных PC DR2 (+) по сравнению с DR2 (-) больными.
У DR2 (+) пациентов были достоверно увеличены общее число Т-лимфоцитов (CD3+; р<0,05), Т-хелперов (CD4+; р<0,05), естественных киллеров (CD16+; р<0,05), а также субпопуляций лимфоцитов, несущих маркер CD25, что наблюдали и в общей группе больных PC. Численность всех субпопуляций лимфоцитов у DR2 (-) пациентов оказалась сниженной по сравнению с показателями лиц контрольной группы, а CD8 - особенно резко (р<0,001). Количество циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), адгезия нейтрофильных грану-лоцитов (спонтанная и индуцированная) у группы DR2 (+) по сравнению с DR2 (-) пациентами были снижены, что свидетельствует об усилении миграции CD8+ у DR2 (+) больных.
Спонтанная продукция цитокинов (табл. 2.2) у DR2 (+) больных по сравнению с контролем характеризовалась снижением IL-13 (р<0,01), а секреция IL-4, IL-6, IL-8 значимо не менялась. У DR2 (-) больных спонтанная продукция исследуемых цитокинов также не отличалась от уровней в группе контроля, за исключением IL-8, содержание которого в группе DR2 (-) больных было повышено как по сравнению с контролем (р<0,01), так и по сравнению с группой DR2 (+) больных (р<0,05).
Стимулированная продукция IL-6, IL-8, TNF-a у DR2 (+) больных по сравнению с контролем была значимо понижена. Стимулированная продукция IL-1(3, IL-2 не изменялась. В группе DR2 (-) больных значимых различий уровней стимулированной продукции определяемых цитокинов выявлено не было. Снижение индуцированной продукции IL-8 у DR2 (+) больных является статистически значимым как в сравнении с группой DR2 (-) (р<0,05), так и в сравнении с группой контроля (р<0,001). При исследовании цитокинов сыворотки крови у DR2 (+)
Табл.1.2. УРОВНИ ЦИТОКИНОВ У БОЛЬНЫХ PC И ЗДОРОВЫХ ЛИЦ (пг/мл)
Показатель IL-1ß слон IL-4 спон IL-6 спон ШаШ СПОН иШ I IL-1ß инд IL-2 ЙВ инд ЩШ TNFa инд IL-8 IL-1 ß IL-4 i инд сыв сыв I I,L'6 I сыв TNFa сыв IL-8 сыв
Контроль (п=50) Ср знач. 493 140 105 111 2910 16,7 Ир! 672 5420 0 Jgj 0 34 0
Ср кв. ош. 96 - 17,5 29,5 ЩШ 117 0,9 Щ 18,5 313 0 ЩШ 0 7,5 0
Больные PC (п=68) Ср знач. 457 12,5 147 305 111 I 2807 15,4 ИВ 642 4260 36,7 |Н 0,56 204 21
Ср кв. ош. 201 13,4 56,4 121 ÉP I 483 2,84 ЩШ 176 378 58,5 ЩШ ! 1,67 132 25,1
Т к Н|тд 2,37 HÜ *
Примечание: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001, - нет данных; выделены достоверные показатели.
больных обнаружены изменения, характерные для общей группы больных РС: повышение 11А (р<0,01) и отсутствие значимых различий 1Ь-1(3, 1Ь-2, 1Ь-6, 1Ь-8, ПчТ-а. Кроме того, сывороточные концентрации 1Ь-6,1Ь-8, ТТЧБ-а у 0112 (+) пациентов по сравнению с 1Ж2 (-) были незначительно выше.
Таким образом, при обследовании 68 пациентов с РС установлено снижение, на фоне лимфопении, абсолютного числа Т-лимфоцитов (СОЗ), СБ4+,
CD8+ субпопуляций с преимущественным снижением CD8+ лимфоцитов. Количество лимфоцитов, в частности, хелперов (CD4) и натуральных киллеров (CD16), индекс дифференцировки (CD4/CD8) прямо коррелировали с уровнем клеток, несущих маркер апоптоза (CD95), что, по-видимому, свидетельствует об участии механизмов апоптоза в регуляции численности Т-хелперов и процессах, связанных с повреждением олигодендроцитов.
Табл.2.1. СУБПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ, ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ ИММУННЫЕ КОМПЛЕКСЫ(ЦИК), АДГЕЗИЯ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ У 0Я2(+), DR2(-) БОЛЬНЫХ РС И ЗДОРОВЫХ ЛИЦ (в мм3)
Показатель
Лимф
СОЗ
CD4
CD8
CD4/8
CD20
CD25
CD16
CD95
ЦИК
Адг.сп.%
Адг.сп,%
Контроль ¡йёрйй
(п—50) 2322 1120 594 526 из 418 304 424 97,5
Больные РС
(п=68) 1921 901 497 415 1,25 380 382 385 265 16,4 42,6 63,7
DR2+ (п=13) 2261 1113 633 508 1,29 481 478 493 - 22,1 39,2 59,5
Ср кв. ош. t ( DR2+ 225 101 62,7 59 54 61,8 53,8 / '$*/-> - 5,09 5,41 :МШМЖЖШШШ> 4,91
и контроля) 0,25 0,06 0,55 0,27 0,32 1,03 2,54 1,06
DR2-
(п-6) 1456 700 375 313 зоа 290 266 МИН 25,3 53,4 188
Ср кв. ош. 116 ш 108 71.1 18,4 0,09 22,1 21,5 50,8 - 6,36 5,39 116
t (DR2- ' ¡¡В
и контроля) 6,22 **• 3,57 MwÊÊÈÉm 2,78 Яр35 **♦ 0,12 ИЯ н 0,37 2,51
t (DR2+ и DR2-) 1,88 2,09* 2,1* 1,75 0,52 1,69 1,61 2,18* 0,35 1,35 1,76
Примечание: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001, - нет данных; выделены достоверные показатели.
Табл.2.2. УРОВНИ ЦИТОКИНОВ У 0В2{+), 0Я2(-) БОЛЬНЫХ РС И ЗДОРОВЫХ ЛИЦ (пг/мл)
DR2 IL-1P IL-4 IL-6 TNF IL-8 IL-13 IL-2 IL-6 TNF IL-8 IL-1(3 IL-4 IL-6 TNF IL-8
спон спон спон спон спон ИНД ИНД инд инд инд СЫ8 сыв сыв сыв сыв
Контроль (п=50) 493 140 105 302 2910 16,7 1022 672 5420 0 25 0 34 0
Больные РС (п=68) 457 12.5 147 305 1574 2807 15,4 441 642 4260 36,7 1253 0,56 204 21
DR2+
(п—13) 71,5 3,33 158 яИМ» 585 2880 19,8 397 222 ЗОЮ шШк 1137 1,67 359 45,5
Ср кв. ош. 83,9 5,77 72,6 - 242 1182 8,01 205 62,9 440 - 384 2,89 310 71,6
t ( DR2+ ШШ "
и контроля) 3,31 ft* 2,93 ** 6,87 *** 4,46 *** 2,89 ■Élit
DR2- ЯМ1
(п=6) - 40 - 77,5 4124 2467 12,7 900 - 6000 70 1600 0 20 0
Ср кв. ош. - - - 2,5 1590 819 4,88 - - 1748 140 - - - -
t ( DR2- 2,4 ¡gjji
и контроля) ¡■•11
t (DR2+ 3,25 2,34
и DR2-) • * flllllli'
Примечание: * - р<0,05,
** —
р<0,01,
р<0,001, - нет данных; выделены достоверные показатели.
Обнаружены изменения продукции цитокинов in vivo при PC, в частности, повышение уровня IL-ip, IL-8, TNF-a, IL-4, IL-6 в сыворотке крови. Подобные нарушения были отмечены при РС также и в других исследованиях [15] и могут быть объяснены персистенцией антигена (основного белка миелина) в циркуляции с поддержанием иммунного ответа на него. Повышение IL-4 при РС может рассматриваться как проявление антагонистического действия этого цитокина в отношении TNF-a - фактора миграции и цитотоксичности. Увеличение продукции ш vivo провоспа-лительных цитокинов IL-ip, IL-8 (фактор миграции клеток в очаг повреждения), TNFa отражает, очевидно, тяжесть процесса, т.к., по некоторым данным, вышеперечисленные цитокины прямым и непрямым путем блокируют проведение сигнала по частично демиелинизированным нервным волокнам [17]. Повышенный уровень TNF-a, опосредующий TNF-путь апоптоза клеток глии, несомненно, также вносит вклад в патогенез заболевания, способствуя элиминации активированных Т-лимфоцитов. При этом IL-4 и IL-6 рассматриваются как факторы модуляции иммунного ответа по Th2 типу. Увеличение этих цитокинов в сыворотке крови, возможно, является попыткой иммунной системы подавить неадекватный Thl ответ, приводящий к повреждению глии. Уровень IL-4, с этих позиций, может быть тесно связан с типом течения заболевания и степенью неврологического дефицита [20].
Высокий уровень IL-8 свидетельствует об усилении миграции лимфоцитов к очагам демиелини-зации. В то же время у больных РС отчетливо выявляются признаки «истощения провоспалительного ответа» в виде снижения продукции провоспали-тельных цитокинов после стимуляции, в том числе и IL-6, который усиливает пролиферацию Т-клеток, увеличивает антителообразование плазматическими клетками, ускоряет превращение Т-лимфоцитов в цитотоксические Т-лимфоциты-эффекторы [22, 23] и является фактором переключения на Th2 иммунный ответ. Таким образом, истощение или антагонистическое действие других цитокинов на IL-6 приводит к снижению стимулированной продукции IL-6 и свидетельствует о недостаточности механизмов переключения Thl на Th2 ответ. Стабильный, без ожидаемого снижения уровень IL-2, индуцирующего транскрипцию гена CD95L (в том числе в CD8+ лимфоцитах), свидетельствует об участии этого цитокина в процессах демиелинизации, что находит подтверждение в публикациях других авторов [18].
У носителей DR2 антигена обнаружены повышенные количества всех исследуемых субпопуляций лимфоцитов по сравнению с DR2 (-) больными. Несмотря на то, что DR2 повышает
риск развития РС, у БИ2 (+) по сравнению с 0112 (-) пациентами установлены менее выраженные нарушения клеточного иммунитета. При этом отсутствовали достоверные различия между обеими группами пациентов в степени тяжести и активности процесса, что может свидетельствовать о преимущественном значении для особенностей заболевания других показателей иммунитета, например, цитокинового статуса. Это подтверждается установленными сниженными уровнями стимулированной продукции 1Ь-6, 1Ь-8, ТОТ-а (что характерно и для многих хронических иммунопатологических процессов) в общей группе больных РС, причем у ОИ2 (+) пациентов различие более значимо. Последнее служит косвенным доказательством того, что Э112 (+) аллель находится в неравновесном сцеплении с аллелями TNF-
а, которые обеспечивают низкие уровни продукции данного цитокина, о чем имеются сообщения в связи с проблемами иммунологии СПИДа [5]. В свою очередь, учитывая реципрокные взаимоотношения между ТОТ-а, для которого установлена наиболее тесная связь с присутствием БИ2 антигена, и 11.-8, становится очевидной причина повышения продукции 1Ь-8: Преактивация клеток иммунной системы в сочетании со сниженными функциональными возможностями лимфоцитов отвечать на антигенную стимуляцию.
Выводы
1. При РС выявлены изменения клеточного иммунитета в виде лимфопении со снижением абсолютных значений всех субпопуляций Т-лимфоцитов в сыворотке крови (СЭЗ, СЭ4, СЭ8) и повышением содержания лимфоцитов с активационным маркером СБ25 и экспрессирующих НЬА II.
2. Отсутствие изменений в продукции Т-клеточ-ного ростового фактора (1Ь-2), индуцирующего транскрипцию гена РаэЬ С08+ лимфоцитов, и увеличение числа клеток, несущих СБ95, свидетельствует об активации процессов апоптоза лимфоцитов при РС. Апоптоз лимфоцитов при РС, очевидно, носит защитный характер, функция которого состоит в уничтожении активированных лимфоцитов.
3. Увеличение содержания в сыворотке провос-палительных цитокинов ТОТ-а и 1Ь-8, продуцируемых, в основном, ТЫ, свидетельствует о преобладании Т хелперного ответа 1 типа у больных РС. Значимое изменение продукции 1Ь-4 и 1Ь-6 отражает подключение ТЬ2 ответа в связи с неэффективностью ТЫ ответа.
4. В112 принадлежность у пациентов РС не связана с тяжестью иммунологических нарушений, а
характеризует лишь предрасположенность к возникновению PC.
Список литературы
1. Алаев Б.А. Этнические факторы, связь с патогенезом и географией рассеянного склероза // Журн. Невропатол. и психиатрии.-1992.-Т.92, вып. 2.-С.9-12.
2. Бисага Г.Н., Калинина Н.М., Акимов С.Б. и др. // Сборник трудов юбилейной научной конференции, посвященной 100-летию клиники нервных болезней им. Аствацатурова М.И. С-Пб.: 1997.- С. 27.
3. Демина Т.Л., Гусев Е.И., Бойко А.Н., Пинегин Б.В. Цитокины в иммунопатогенезе рассеянного склероза // Журн. невропатол. и психиатрии,- 1997.-Т.97, ВЫП.5.-С. 68-73.
4. Завалишин И.А., Невская О.М., Кулов Б.Б. Антигены гистосовместимости при ретробульбар-ном неврите и рассеянном склерозе // Журн. невропатол. и психиатрии,-1989.-Т.89, вып.4,-С.55-58.
5. Калинина Н.М. Роль цитокинов в иммунопатогенезе и клинических проявлениях ВИЧ-инфек-ции: Автореф. дис.... докт. мед. наук. - СПб., 1996,-35 с.
6. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача.. СПб.: ТОО издательство Гиппократ., 1998. - 156 с.
7. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев
A.А. Эндогенные иммуномодуляторы. СПб.: Гиппократ, 1992,—256 с.
8. Прокофьев В.Ф., Грибачева И.А., Коненков
B.И. и др. Иммуногенетические маркеры рассеянного склероза в Западной Сибири // Журн. невропатол. и психиатрии,- 1988,- Т.88, вып. 12.- С. 49-52.
9. Чекнев С.Б. Патогенез рассеянного склероза: иммуностимуляция или иммунодефицит // Иммунология.- 1994.-№ 2,- С. 9-17.
10. Brod S.A., Nelson L.D., Khan М. et al. Brod SA, Nelson LD, Khan M, Wolinsky JS Increased in vitro induced CD4+ and CD8+ T cell IFN-gamma and CD4+ T cell IL-10 production in stable relapsing multiple sclerosis // Int. J. Neurosci.- 1997.-Vol.90, N (3-4).-P.187-202.
11. Del Prete G. The concept of type-1 and type-2 helper T cells and their cytokines in humans. // Int. Rev. Immunol.- 1998,- Vol.16, N 3-4,- P. 427-455.
12. Falcone М., Bloom B.R. Falcone M, Rajan AJ, Bloom BR, Brosnan CF J Immunol 1998 May 15;160(10):4822-4830 A critical role for IL-4 in regulating disease severity in experimental allergic encephalomyelitis as demonstrated in IL-4-deficient C57BL/6 mice and BALB/c mice //J. Exp. Med.-1997,- Vol.185, N.5.- P. 901-907.
13. Ferrante P., Fusi M.L., Saresella M. et al. Cytokine production and surface marker expression in acute and stable multiple sclerosis: altered IL-12 production and augmented signaling lymphocytic activation molecule (SLAM)- expressing lymphocytes in acute multiple sclerosis//J. Immunol.- 1998,- Vol. 160, N. 3,- P. 1514-1521.
14. Hermans G„ Stinissen P., Hauben L. et al. Hermans G, Stinissen P, Hauben L, Van den Berg-Loonen E, Raus J, Zhang J Cytokine profile of myelin basic protein-reactive T cells in multiple sclerosis and healthy individuals // Ann. Neurol.- 1997.- Vol.42, N.I.- P.18-27.
15. Hohnoki K., Inoue A., Koh C.S. Hohnoki K, Inoue A, Koh CS Elevated serum levels of IFN-gamma, IL-4 and TNF-alpha/unelevated serum levels of IL-10 in patients with demyelinating diseases during the acute stage // J. Neuroimmunol.- 1998,- Vol.87, N.l-2.- P.27-32.
16. Ishida H., Ota H., Yanagida H. et al. An ambulance between Thl and Th2-like cytokines in patients with autoimmune diseases - differential diagnosis between Thl dominant autoimmune diseases and Th2 dominant autoimmune diseases. // Nippon. Rinsho.- 1997.- Vol. 55, N.6.- P.1438-1443.
17. Moreau T, Coles A, Wing M et al. Transient increase in symptoms associated with cytokine release in patients with multiple sclerosis. // Mult. Scler.-1996.- Vol.l, N.6.- P.357-365.
18. Refaeli Y., Abbas A.K. Role of cytokine in autoimmunity // Eur. Cytokine. Netw.- 1998.- Vol. 9 (3 Suppl).- P. 81-82.
19. Sandberg-Wollheim M., Ciusani E., Salmaggi A. et al. An evaluation of tumor necrosis factor microsatellite alleles in genetic susceptibility to multiple sclerosis. // Mult. Scler.- 1995.- Vol.l, N.3.- P. 181-185.
20. Söderström M„ Hillert J., Link J. et al. Expression of IFN-gamma, IL-4, and TGF-beta in multiple sclerosis in relation to HLA-Dw2 phenotype and stage of disease. // Mult. Scler.- 1995.- Vol.l, N.3.- P.173-180.
21. Sotgiu S., Serra C., Marrosu M.G. et al. Genetic susceptibility to multiple sclerosis in Sardinians: an immunological study. // Acta Neurol. Scand.- 1998.-Vol.98, N.5.- P.314-317.
22. Takai Y., Wong G.G., Clark S.C. et al. B cell stimulatory factor-2 is involved in the differentiation of cytotoxic T lymphocytes. //J Immunol 1988; 140(2): 508-512.
23. Uyttenhove C., Coulie P.G., Van Shick J. T cell growth and differentiation induced by interleu-kin-HPl/IL-6, the murine hybridoma/plasmacyto-ma growth factor. //J Exp Med 1988; 167(4): 1417-1427.
24. Vandevyver C., Raus P., Stinissen P. et al. Polymorphism of the tumour necrosis factor beta
gene in multiple sclerosis and rheumatoid arthritis. // Eur. J. Immunogenet.- 1994.- Vol. 21, N.5.- P.377-382.
25. Wandinger KP, Wessel K, Trillenberg P, Hei-
ndl N, Kirchner H Effect of high-dose methylpredniso-lone administration on immune functions in multiple sclerosis patients. // Acta Neurol. Scand.- 1998,- Vol.97, N. 6,- P.359-365.
поступила в редакцию 07.06.2002 отправлена на доработку 05.09.2002 принята к печати 17.09.2002
