CC BY
28ЭНЕРГИЯ БИОМАССЫ
ENERGY OF BIOMASS
Статья поступила в редакцию 16.02.12. Ред. рег. № 1219 The article has entered in publishing office 16.02.12. Ed. reg. No. 1219
УДК [579.81::57.086.126:661.183.3-036]::[662.7-029+574]-027
ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ КЛЕТКИ CHLORELLA VULGARIS ДЛЯ РЕШЕНИЯ ЗАДАЧ АЛЬТЕРНАТИВНОЙ ЭНЕРГЕТИКИ И ЭКОЛОГИИ
А.Б. Никольская, А.В. Холстов, И.В. Лягин, Ф. Мамедова, Е.Н. Ефременко, С.Д. Варфоломеев
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН 119334 Москва, ул. Косыгина, д. 4 Тел.: +7(495)9393170, факс: +7(495)9395417, e-mail: [email protected]
Заключение совета рецензентов: 11.03.12 Заключение совета экспертов: 15.03.12 Принято к публикации: 20.03.12
В работе показана возможность накопления биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris C-1 для использования ее в качестве источника получения альтернативных топлив в результате культивирования при исходном введении инокулята в виде клеток, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта, в среду, содержащую глицерин - отход производства биодизеля. Наилучшие результаты были получены при использовании миксотрофных условий культивирования. Оптимальная концентрация вносимого в среду иммобилизованного инокулята была 54 г с.в./л. Достигнутый выход биомассы составил 8,65 г с.в./м2/сут, что было в 3,5 раза больше, чем в ранее известных аналогичных исследованиях.
Ключевые слова: микроводоросли, иммобилизация, биомасса, продуктивность, экология, биотопливо.
IMMOBILIZED CHLORELLA VULGARIS CELLS IN SOLUTION OF ALTERNATIVE ENERGY AND ECOLOGY TASKS
A.B. Nikolskaya, A.V. Holstov, I.V. Lyagin, F. Mamedova, E.N. Efremenko, S.D. Varfolomeyev
N.M. Emanuel Institute of Biochemical Physics, RAS 4 Kosygin str., Moscow, 119334, Russia Phone: +7 (495) 939-3170, Fax: +7 (495) 939-5417, e-mail: [email protected]
Referred: 11.03.12 Expertise: 15.03.12 Accepted: 20.03.12
The possible biomass accumulation of microalgae Chlorella vulgaris C-1 for application as a source for production of alternative biofuels was shown in the work using the cells, immobilized into poly(vinyl alcohol) cryogel, as inoculum for cultivation in the medium containing glycerol being waste of biodiesel production. The best results were obtained under mixotrophic cultivation. Optimal concentration of immobilized inoculum added to medium was 54 g d.w./L. The achieved biomass yield was 8.65 g d.w./m2/d, and that was 3.5-times higher as compared to already known analogues of the investigation.
Keywords: microalgae, immobilization, biomass, productivity, ecology, biofuel.
Сведения об авторе: инженер ИБХФ РАН.
Образование: химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова.
Область научных интересов:
физическая и аналитическая химия, биотоплива. Публикации: 10.
Анна Борисовна Никольская
Александр Викторович Холстов
Сведения об авторе: аспирант 3 г/о ИБХФ РАН.
Образование: химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова.
Область научных интересов: биофизика и аналитическая химия. Публикации: 3.
Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология» № 04 (108) 2012 © Научно-технический центр «TATA», 2012
Илья Владимирович Лягин
Сведения об авторе: канд. хим. наук, научный сотрудник ИБХФ РАН.
Образование: химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова.
Область научных интересов: биохимия, биотехнология.
Публикации: 22.
Сведения об авторе: аспирант 1 г/о.
Образование: химический факультет СПбГУ.
Область научных интересов: биохимия, биотехнология. Публикации: 1.
Фахрия Мамедова
Елена Николаевна Ефременко
Сведения об авторе: д-р биол. наук, профессор, старший научный сотрудник ИБХФ РАН.
Образование: Технологический институт пищевой промышленности, Москва.
Область научных интересов: биофизика, биотехнология.
Публикации: более 100.
Сведения об авторе: член-корр. РАН, д-р хим. наук, профессор, директор ИБХФ РАН.
Образование: химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова.
Область научных интересов:
физическая химия, биофизика. Публикации: более 200.
Сергей Дмитриевич Варфоломеев
Введение
В качестве одного из перспективных источников возобновляемой энергии сегодня рассматривается биомасса микроводорослей (МВ), из которой могут быть получены различные виды биотоплива: биодизель, биоэтанол, биоводород, биогаз [1-4]. Привлекательность использования биомассы МВ для получения биотоплив обусловлена технической простотой процесса культивирования этих микроорганизмов с использованием либо минимальных питательных сред, состоящих преимущественно из минеральных солей [5], либо сточных вод различных предприятий [6]. В последнем случае процесс культивирования МВ приобретает огромное значение для экологии, так как позволяет скомбинировать получение биомассы с очисткой сточных вод и поглощением С02, который загрязняет окружающую среду. Основное внимание при культивировании МВ уделяется продуктивности процесса и максимальному уровню накопления биомассы клеток [7]. Установлено, что исходная концентрация клеток в реакторе для культивирования МВ имеет большое значение для рациональной организации процесса [8]. Создавать исходно высокую плотность клеток, инокулируемых в среду, можно с помощью иммобилизации МВ и таким образом влиять на скорость нарастания потомственных клеток (биомассы).
Теоретический анализ
Введение в среду для культивирования посевного материала инокулята в высокой концентрации МВ может обеспечить использование клеток в иммобилизованной форме. Иммобилизация клеток на пористых носителях позволяет создавать и удерживать в реакторе высокую концентрацию клеток. В случае МВ иммобилизация наиболее эффективно может быть проведена путем введения клеток в объем заранее сформированного полимерного гидрогеля. В качестве полимерной основы таких гидрогелей известно использование альгината кальция, агара, к-карра-гинана и полиакриламида [9-10]. Носитель, в котором осуществляется иммобилизация клеток МВ, должен, с одной стороны, обеспечивать благоприятные условия для массообменных процессов и сохранения высокой метаболической активности клеток, а с другой - не препятствовать постепенному выходу из полимерной матрицы потомственных клеток МВ и их накоплению в среде в свободном виде.
Ранее было установлено, что носителем для иммобилизации клеток МВ, удовлетворяющим указанным требованиям, является криогель поливинилового спирта (ПВС) [11]. При этом весьма эффективным способом иммобилизации клеток в порах этой предварительно сформированной полимерной матрицы оказалось центрифугирование, обеспечивающее при-
International Scientific Journal for Alternative Energy and Ecology № 04 (108) 2012
© Scientific Technical Centre «TATA», 2012
А.Б. Никольская, А.В. Холстов, И.В. Лягин и др. Иммобилизованные клетки Chlorella vulgaris
нудительное введение клеток в поры носителя под действием внешних, в частности центробежных сил (5000-14000 g) [12]. Было установлено, что для максимально успешного проникновения клеток в поры носителя под действием центробежных сил необходим правильный подбор соотношения размера пор носителя и размера клеток. Так, для зеленых МВ размер пор криогеля ПВС должен составлять 1-10 мкм. Использование раствора полимера определенной концентрации (7-13%) на этапе формирования носителя позволяет получать матрицу с размером пор, необходимым для успешного введения в нее клеток МВ [12].
В данной работе для получения источника концентрированного инокулята в виде иммобилизованных клеток МВ использовалась культура Chlorella vulgaris С-1, способная накапливать высокие концентрации биомассы в миксотрофных условиях [13]. Для иммобилизации этих клеток с целью накопления их биомассы как источника получения альтернативных топ-лив впервые использовался криогель ПВС, но введение клеток в этот носитель осуществлялось не под действием центробежных сил, а в результате принудительной фильтрации клеточной суспензии зеленых МВ через слой криогеля ПВС.
Таким образом, целью работы было исследование возможности накопления биомассы МВ для использования ее в качестве источника получения альтернативных топлив в результате культивирования в миксотрофных условиях при исходном введении в среду инокулята в виде клеток, иммобилизованных в криогель ПВС. Для создания миксотрофных условий культивирования клеток МВ использовалась среда, содержащая глицерин в качестве основного источника углерода. Выбор глицерина в качестве субстрата для накопления биомассы МВ был не случайным. Глицерин как отход производства биодизеля составляет 10% от его объема, и сегодня его получение достигло 1 млн т/год. Использование глицеринсо-держащих сред для культивирования МВ может позволить существенно снизить экологическую нагрузку, возникающую при решении задач альтернативной энергетики (при современном производстве биодизеля).
Методика эксперимента
Основным объектом исследования в работе были клетки зеленых микроводорослей Chlorella vulgaris C-1 [14], рост которых поддерживался на среде Та-мийя [15]. Накопление биомассы проводилось в фо-тобиореакторе (Labfors 4 Lux, Infors AG, Швейцария) без регулярного принудительного механического перемешивания. Для сравнения уровня накопления биомассы зеленых МВ использовались автотрофные, гетеротрофные и миксотрофные условия культивирования [16]. В первом случае культивирование проводили при 25 °С и 24-часовом режиме освещения под лампами Osram Fluora 77 (30 Вт). Воздух, содержащий 1% об. CO2, барботировался через суспен-
зию выращиваемых клеток. В миксотрофных условиях культивирование проводилось так же, как и в фотоавтотрофных условиях, однако в среду Тамийя дополнительно вводили 5,4 г/л глицерина [13]. В случае гетеротрофного режима культивирования в отличие от миксотрофного режима не использовалось круглосуточное освещение.
Рост клеток контролировался спектрофотометри-чески (спектрофотометр Agilent UV-8453, оборудованный термостатируемой ячейкой, Германия) при 540 нм. pH среды контролировался потенциометри-чески (рН-метр Corning Pinnacle 530, Швейцария). Определение концентрации накапливающейся биомассы проводилось гравиметрически с определением концентрации сухих веществ и влажности анализируемых образцов по известным методикам [17].
Микроскоп БИОМЕД (Россия) использовался для микроскопирования образцов с МВ. Концентрация внутриклеточного АТФ в клетках, иммобилизованных к криогеле ПВС, определялась люциферин-люциферазным методом по известной методике [18] с использованием реагента ОАО Люмтек (Россия).
Для иммобилизации клеток рода Chlorella путем «замораживания-оттаивания» раствора полимера с разной концентрацией были приготовлены образцы криогеля ПВС по известной методике [12] в виде листовых блоков размером 220*220 мм. Масса одного блока составляла 72±2 г сух.в. В процессе иммобилизации суспензию предварительно выращенных клеток МВ (3,5-106 кл./мл, 1 л) прокачивали перистальтическим насосом (ColeParmer MasterFlex L/S, США) со скоростью 70 мл/ч через листовой блок криогеля, зафиксированный в фильтрационной установке ФД-293-3 (НПК «Биотест», Россия). В результате были получены образцы листового пласта полимерного носителя с введенными в его поры клетками МВ. Далее такие листовые блоки с введенными в них клетками МВ помещались в питательную среду в фотобиореактор в концентрации, предусмотренной целями эксперимента, и проводилось культивирование клеток с целью накопления биомассы так же, как и в случае использования свободных клеток в качестве инокулята. Определение содержания липи-дов, углеводов и белков в клетках МВ проводилось по известным методикам [19-21].
Результаты и их обсуждение
В связи с тем, что были изменены условия введения клеток в матрицу носителя в процессе их иммобилизации в криогель ПВС по сравнению с ранее известными [12], первоначально в работе был подобран тот образец криогеля ПВС, который обеспечивал иммобилизацию максимальной концентрации клеток МВ. С этой целью в одинаковых условиях в образцы криогеля ПВС, сформированные при использовании растворов полимера разной концентрации (табл. 1), были введены клетки Chlorella vulgaris в условиях проточной системы. Для оценки эффективности про-
Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология» № 04 (108) 2012 © Научно-технический центр «TATA», 2012
веденного процесса иммобилизации живых клеток МВ в порах носителя была определена концентрация АТФ в исследуемых образцах криогеля ПВС. Как известно, АТФ является основным метаболитом, характерным для живых клеток, и его концентрация в любом анализируемом образце отражает численность в нем живых клеток [18]. Анализ концентрации АТФ в разных образцах криогеля ПВС с введенными в них клетками МВ (табл. 1) позволил отдать предпочтение носителю, сформированному из 11%-го раствора полимера.
Таблица 1
Концентрация АТФ в образцах криогеля ПВС, полученных при иммобилизации клеток Chlorella vulgaris в поры носителя, сформированного при использовании растворов полимера с разной концентрацией
Table 1
Concentration of ATP in the samples of PVA cryogel, obtained after Chlorella vulgaris cells immobilization in pores of carrier, formed from polymer solutions with various concentrations
Концентрация раствора ПВС, использованного для формирования криогеля, % [АТФ], 10"11 моль/г носителя с иммобилизованными клетками
7 7,9±0,4
9 13±5,0
11 20±4,0
13 15±0,7
Иммобилизованные таким образом клетки МВ далее параллельно со свободными клетками вносились в питательную среду в одной и той же концентрации (1%) для культивирования и накопления биомассы в условиях миксотрофного роста. Согласно литературным данным, культивирование клеток рода Chlorella с целью накопления их биомассы в условиях миксотрофии, то есть при наличии освещения и подаче CO2 в среду, содержащую органический источник углерода, характеризуется максимальной эффективностью процесса [22].
В данной работе, в отличие от других исследований [13, 23], впервые было проведено сравнительное исследование накопления биомассы зеленых МВ в различных условиях роста при использовании иммобилизованного инокулята и глицерина, а не глюкозы, в качестве органического источника углерода при миксотрофном росте клеток (табл. 2). Было установлено, что скорость накопления биомассы в миксо-трофных условиях на глицеринсодержащей среде в 1,75 и 3,2 раза превышает тот же параметр, получаемый, соответственно, в гетеротрофных и автотроф-ных условиях. При этом исходная форма инокулята (свободные или иммобилизованные клетки) практически не влияла на общую тенденцию изменения продуктивности процесса по биомассе при смене условий культивирования МВ.
Таблица 2
Продуктивность процесса накопления биомассы МВ (мг сух. в ./л / сут) при использовании в качестве инокулята свободных или иммобилизованных клеток Chlorella vulgaris, культивирование которых проводилось в различных условиях
Table 2
Productivity of the biomass accumulation process
(mg d.w./L/d) realized with use of free or immobilized Chlorella vulgaris cells as inoculum during cultivation under various conditions
Форма клеток в инокуляте Условия
авто-трофные гетеротрофные миксо-трофные
Свободные 26±5 43±3 82±7
Иммобилизованные 25±3 45±4 79 ±8
Далее исследование проводилось с использованием только иммобилизованных клеток в миксотроф-ных условиях роста. Варьировалась концентрация носителя с иммобилизованными в нем клетками Chlorella vulgaris, которую вводили в реактор для накопления биомассы МВ, с целью определения ее влияния на продуктивность процесса (табл. 3). Было установлено, что увеличение исходной концентрации иммобилизованных клеток, вводимых в среду вместе с носителем, приводит к значительному повышению скорости накопления потомственных свободных клеток в среде. При этом использование концентрации криогеля ПВС с включенными в него клетками выше 54 г сух.в./л оказалось нецелесообразным, так как не приводило к существенному улучшению продуктивности процесса в применяемых условиях культивирования. Остаточная концентрация глицерина в среде при этом не превышала 0,4 г/л, то есть степень потребления субстрата составляла 80%.
Таблица 3
Влияние исходной концентрации носителя
с иммобилизованными в нем клетками Chlorella vulgaris, вводимого в реактор для накопления биомассы МВ, на продуктивность процесса по биомассе в миксотрофных условиях
Table 3
Influence of initial concentration of the carrier with immobilized Chlorella vulgaris cells, added to reactor for microalgae biomass accumulation, on the process productivity under mixotrophic conditions
Концентрация носителя с иммобилизованными клетками в питательной среде (г сух.в./л) 9±1 27±1 54±2 72±2
Продуктивность процесса накопления биомассы МВ (мг сух.в./л/сут) 79±8 237±10 314±16 331±18
International Scientific Journal for Alternative Energy and Ecology № 04 (108) 2012
© Scientific Technical Centre «TATA», 2012
А.Б. Никольская, А.В. Холстов, И.В. Лягин и др. Иммобилизованные клетки Chlorella vulgaris ...
Расчеты, произведенные с учетом известной площади поверхности носителя (0,0363 м2), имевшего указанную массу, позволили оценить продуктивность использованного образца иммобилизованных клеток в единицах, часто применяемых для оценки эффективности роста клеток МВ. Полученная величина составила 8,65 г сух. в./м2/сут. Здесь необходимо отметить, что у исследованного в данной работе варианта иммобилизованных клеток имеется аналог, представляющий собой клетки Chlorella sp., иммобилизованные методом абсорбции в объеме подложки, изготовленной на основе пенополистирола [24]. Известно, что такой иммобилизованный инокулят в оптимизированных условиях позволяет в горизонтальном реакторе в миксотрофных условиях максимально накапливать 2,57 г сух. в./м2/сут биомассы клеток МВ, которую собирают специальными скребками с поверхности полимерного носителя. Сравнение характеристик разработанного и известного из литературы варианта иммобилизованных клеток Chlorella sp. [24] позволяет заключить, что образец, полученный в этом исследовании в результате принудительного введения клеток Chlorella vulgaris в поры криогеля ПВС, обеспечивал в миксотрофных условиях превышение эффективности накопления биомассы клеток по отношению к его аналогу более чем в 3,5 раза.
Биомасса свободных клеток МВ, полученная в результате культивирования иммобилизованного в криогель ПВС инокулята, была сконцентрирована центрифугированием (8 000 g, 10 мин, центрифуга Avanti J-25, США) и использована для сравнительного анализа ее биохимического состава с составом клеток, которые выращивались при использовании инокулята в виде свободных клеток МВ (табл. 4).
Таблица 4
Биохимический состав клеток МВ, полученных в результате использования в качестве инокулята свободных или иммобилизованных клеток Chlorella vulgaris
Table 4
Biochemical content of microalgal biomass obtained as result of use of free or immobilized Chlorella vulgaris cells as inoculum
Биомасса МВ, полученная при использовании инокулята в виде клеток липиды, % белки, % углеводы, %
свободных 21,3±1,1 22,8±3,0 55,5±5,9
иммобилизованных 20,5±1,5 23,5±2,2 54,9±3,8
Анализ содержания липидов, углеводов и белков в двух образцах клеток показал их практическую идентичность, подтвердив, таким образом, возможность использования иммобилизованного инокулята для накопления клеток МВ без изменения их биохи-
мического состава, постоянство которого крайне важно для переработки биомассы в биотоплива в промышленных условиях при реализации отработанных технологических режимов.
Заключение
Резюмируя изложенное, можно заключить, что проведенные исследования позволили выявить и продемонстрировать высокоэффективный способ получения биомассы МВ в качестве возобновляемого источника энергии для получения альтернативных видов топлива, предусматривающий решение экологической проблемы, связанной с утилизацией глицеринсодер-жащих отходов топливной промышленности в качестве компонента питательной среды. Показана целесообразность использования миксотрофных условий для накопления биомассы клеток Chlorella vulgaris при использовании инокулята в виде иммобилизованных клеток, поскольку эти условия обеспечили увеличение продуктивности процесса в 1,75 и 3,2 раза в сравнении с гетеро- и автотрофным режимом роста клеток. Применение криогеля ПВС для получения иммобилизованного инокулята в сравнении с носителями, ранее применявшимися для этой же цели [24], позволило существенно улучшить (более чем в 3,5 раза) скорость накопления биомассы МВ, которая по своим биохимическим характеристикам оказалась аналогичной той, что накапливалась в экспериментах при использовании инокулята в виде свободных клеток.
Авторы выражают благодарность Министерству образования и науки РФ за финансовую поддержку (ГК № 16.512.11.2181).
Список литературы
1. Mata T.M., Martins A.A., Caetano N.S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review // Renew. Sustain. Energ. Rev. 2010. Vol. 14. P. 217-232.
2. Singh J., Gu S. Commercialization potential of microalgae for biofuels production // Renew. Sustain. Energ. Rev. 2010. Vol. 14. P. 2596-2610.
3. Demirbas A. Use of algae as biofuel sources // Energ. Convers. Manag. 2010. Vol. 51. P. 2738-2749.
4. Heerenklage J., Maxfield T., Zapf A., Adwiraah H., Wieczorek N., Koerner I. Anaerobic digestion of microalgae - possibilities and limits // Proceedings Venice 2010, Third International Symposium on Energy from Biomass and Waste. Venice, Italy. 8-11 November 2010.
5. John R.P., Anisha G.S., Nampoothiri K.M., Pandey A. Micro and macroalgal biomass: a renewable source for bioethanol // Bioresour. Technol. 2011. Vol. 102. P. 186-193.
6. Woertz I., Feffer A., Lundquist T., Nelson Y. Algae Grown on Dairy and Municipal Wastewater for Simultaneous Nutrient Removal and Lipid Production for Biofuel Feedstock // J. Environ. Eng. 2009. Vol. 135, No. 11. P. 1115-1122.
Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология» № 04 (108) 2012 © Научно-технический центр «TATA», 2012
7. Lee. Y.-K. Microalgal mass culture systems and methods: their limitation and potential // J. Appl. Phycol. 2001. Vol. 13. P. 307-315.
8. Цоглин Л.Н., Габель Б.В., Фалькович Т.Н., Се-мененко В.Е. Фотобиореакторы закрытого типа для культивирования микроводорослей // Физиология растений. 1996. Т. 43, № 1. С. 149-155.
9. Hameed M.S.A., Ebrahim O.H. Biotechnological potential uses of immobilized algae // Int. J. Agr. Biol. 2007. Vol. 9, No. 1. P. 183-192.
10. Moreno-Garrido I. Microalgae immobilization: current techniques and uses // Bioresour. Technol. 2008. Vol. 99. P. 3949-3964.
11. Lozinsky V.I., Bakeeva I.V., Presnyak E.P., Damshkaln L.G., Zubov V.P. Study of cryostructuring of polymer systems. XXVI. Heterophase organic-inorganic cryogels prepared via freezing-thawing of aqueous solutions of poly(vinyl alcohol) with added tetramethoxysilane // J. Appl. Polym. Sci. 2007. Vol. 105, No. 5. P. 2689-2702.
12. Патент РФ 2426779 МПК7 C12N 1/12, C12N 11/02, C12Q 1/06, G01N 33/18. Биосенсор на основе клеток микроводорослей для определения тяжелых металлов и гербицидов в водных системах / Ефре-менко Е.Н., Холстов А.В., Воронова Е.Н., Конюхов И.В., Погосян С.И., Рубин А.Б. // Бюллетень Изобретения и полезные модели. 2011. № 23.
13. Heredia-Arroyo T., Wei W., Ruan R., Hu B. Mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris and its potential application for the oil accumulation from non-sugar materials // Biomass Bioenergy. 2011. Vol. 35, No. 5. P. 2245-2253.
14. Цоглин Л.Н., Акыев А.Я. О2-газообмен и накопление биомассы в клеточном цикле Chlorella IPPAS C-1 в зависимости от содержания О2 в куль-туральной среде // Физиология растений. 1994. Т. 41, № 2. С. 203-208.
15. Hase E., Morimura Y., Tamiya H. Some data on the growth physiology of Chlorella studied by the technique of synchronous culture // Arch. Biochem. Biophys. 1951. Vol. 69. P. 149-165.
16. Liang Y., Sarkany N., Cui Y. Biomass and lipid productivities of Chlorella vulgaris under autotrophic, heterotrophic and mixotrophic growth conditions // Biotechnol. Lett. 2009. Vol. 31. P. 1043-1049.
17. Tang H., Chen M., Garcia M.E.D., Abunasser N., Simon K.Y., Salley S.O. Culture of microalgae Chlorella minutissima for biodiesel feedstock production // Biotechnol. Bioeng. 2011. Vol. 108, No. 10. P. 22802287.
18. Ефременко Е.Н., Татаринова Н.Ю. Влияние длительного хранения клеток микроорганизмов, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта, на их выживаемость и биосинтез целевых метаболитов // Микробиология. 2007. Т. 76, № 3. C. 383-389.
19. Folch J., Lees M., Stanley G.H.S. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. Vol. 226, No. 1. P. 497-509.
20. Dawson R.M.C., Elliott D.C., Elliott W.H., Jones K.M. Data for Biochemical Research (Third Edition). Oxford: Oxford Science Publications, 1986.
21. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. Vol. 28, No. 3. P. 350-356.
22. Chen C.-Y., Yeh K.-L., Aisyah R., Lee D.-J., Chang J.-S. Cultivation, photobioreactor design and harvesting of microalgae for biodiesel production: a critical review // Bioresour. Technol. 2011. Vol. 102. P. 71-81.
23. Liang Y., Sarkany N., Cui Y. Biomass and lipid productivities of Chlorella vulgaris under autotrophic, heterotrophic and mixotrophic growth conditions // Biotechnol. Lett. 2009. Vol. 31. P. 1043-1049.
24. Johnson M.B., Wen Z. Development of an attached microalgal growth system for biofuel production // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. Vol. 85. P. 525-534.
International Scientific Journal for Alternative Energy and Ecology № 04 (108) 2012
© Scientific Technical Centre «TATA», 2012
