ПОЛУНЕПРЕРЫВНЫЙ И НЕПРЕРЫВНЫЙ ПРОЦЕСС НАКОПЛЕНИЯ БИОМАССЫ КЛЕТОК МИКРОВОДОРОСЛЕЙ CHLORELLA VULGARIS В МИНЕРАЛЬНОЙ СРЕДЕ Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

ЭНЕРГИЯ БИОМАССЫ

ENERGY OF BIOMASS

Статья поступила в редакцию 04.02.13 Ред. рег. № 1527

The article has entered in publishing office 04.02.13. Ed. reg. No. 1527

УДК 620.952

ПОЛУНЕПРЕРЫВНЫЙ И НЕПРЕРЫВНЫЙ ПРОЦЕСС НАКОПЛЕНИЯ БИОМАССЫ КЛЕТОК МИКРОВОДОРОСЛЕЙ CHLORELLA VULGARIS В МИНЕРАЛЬНОЙ СРЕДЕ

Е.Н.Ефременко1, А.Б. Никольская1, Ф.Т. Мамедова1, О.В. Сенько1, Л.И. Трусов2

1 Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова, Ленинские горы 1/3, г. Москва, Россия, 119991, тел: +7(495)939-31-70, факс: +7(495) 939-54-17,

email: elena_efremenko@list.ru

2 Ассоциация делового сотрудничества в области передовых комплексных технологий «Аспект», пр-т Вернадского 86, г. Москва, Россия, 119571, тел: +7 (495)434-80-91, факс: +7 (495) 936-88-46, email: aspect@aspect.ru

Заключение совета рецензентов 11.02.13 Заключение совета экспертов 14.02.13 Принято к публикации 18.02.13

Целью настоящей работы являлось исследование основных характеристик полунепрерывного и непрерывного процессов накопления биомассы клеток микроводорослей Chlorella vulgaris в минеральной среде.

На первом этапе работы реализован процесс полунепрерывного накопления биомассы клеток Chlorella vulgaris, исследовано влияние условий культивирования на характеристики процесса. Рассчитаны основные кинетические параметры. Продемонстрирована возможность длительного поддержания культуры клеток зеленых микроводорослей C. vulgaris в минеральной среде в полунепрерывном режиме.

Далее был реализован процесс накопления биомассы зеленой микроводоросли C. vulgaris, осуществляемого в непрерывном режиме. Продемонстрирована возможность масштабирования процесса. Установлено, что при использовании 20 л фотобиореактора можно проводить наращивание и поддержание культуры клеток C. vulgaris в концентрации 8-10 г/л в течение не менее 50 суток.

Ключевые слова: микроводоросли, возобновляемый источник энергии, накопление биомассы, непрерывный процесс.

SEMICONTINUOUS AND CONTINUOUS PROCESS OF ACCUMULATION OF MICROALGAE BIOMASS OF CHLORELLA VULGARIS CELLS

IN MINERAL MEDIUM

E.N. Efremenko1, A.B. Nikolskaya1, F.T. Mamedova1, O.V. Senko1, L.I. Trusov2

'Chemistry Department Moscow State University, Lenin's Hills 1/3, Moscow, Russia, 119991 Phone: +7 (495) 939-3170, Fax: +7 (495) 939-5417, e-mail: elena_efremenko@list.ru

2 "Aspect" Association, Vernadsky prospect 86, Moscow, Russia, 119571, Phone: +7 (495) 434-80-91, Fax: +7 (495) 936-8846, e-mail: aspect@aspect.ru

Referred 11.02.13 Expertise 14.02.13 Accepted 18.02.13

Determination of main characteristics of semicontinuous and continuous processes of biomass accumulation of microalgae Chlorella vulgaris cells in mineral medium was the goal of this work.

At the first stage of the work the process of semicontinuous accumulation of Chlorella vulgaris cell biomass was realized and the influence of cultivation conditions on characteristics of the process was investigated. Possible prolonged maintenance of the culture of green microalgae C. vulgaris in the mineral medium under semicontinuous conditions was demonstrated.

Further, the process of biomass accumulation of C. vulgaris cells in continuous regime was carried out. Possible scaling of the process was revealed. It was established that 20 l-photobioreactor can be successfully applied for biomass production at concentration of 8-10 g/l and long-term maintenance (at least 50 days) of C. vulgaris cells.

Keywords: microalgae, renewable energy source, biomass accumulation, continuous process.

International Scientific Journal for Alternative Energy and Ecology № 02 (119) 2013

© Scientific Technical Centre «TATA», 2013

Елена Николаевна Ефременко

Сведения об авторе: доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией экобиокатализа кафедры химической энзимологии Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Образование: Технологический институт пищевой промышленности, Москва Область научных интересов: биотехнология, биохимия, биофизика Публикации: более 100 научных публикаций

Сведения об авторе: доктор технических наук, профессор, генеральный директор Ассоциации «Аспект»

Образование: Московский институт стали и сплавов, Москва

Область научных интересов: руководитель научной школы в области нанопористых материалов, активно работает в области энергетики и энергосбережения, эффективного использования возобновляемых источников энергии, водородной и биоэнергетики, в частности в рамках сотрудничества с Международным энергетическим агентством, Европейской Ассоциацией биомассы, Международного Партнерства по водородной энергетике.

Публикации: автор 4-х монографий, более 200 научных публикаций, обладатель 73 патентов

Лев Ильич Трусов

Никольская Анна Борисовна

Сведения об авторе: младший научный сотрудник кафедры химической энзимологии Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Образование: Химический факультет МГУ имени М.В.Ломоносова, Москва Область научных интересов: биофизика, биотехнология Публикации:8

Мамедова Фахрия Тахир Кызы

Сведения об авторе: аспирантка Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова Образование: Химический факультет Санкт-Петербургского Государственного университета, Санкт-Петербург

Область научных интересов: биотехнология Публикации: 4

Сенько Ольга Витальевна

Сведения об авторе: научный сотрудник кафедры химической энзимологии Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

Образование: Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова, Москва

Область научных интересов: биотехнология, экология Публикации: 30

Введение

Поиск альтернативных возобновляемых непищевых источников сырья для получения различных продуктов в настоящее время весьма актуален. Биомасса микроводорослей отвечает всем требованиям, предъявляемым к таким субстратам, а также она обладает рядом преимуществ перед целлюлозосодержащим сырьем, используемым для аналогичных целей: отсутствие твердой оболочки и лигнина; при выращивании микроводорослей происходит утилизация в больших количествах углекислого газа; культивирование биомассы можно

проводить в самых различных условиях, а изменяя состав питательной среды можно оказывать значительное влияние на биохимический состав получаемой биомассы [1].

Одной из перспективных культур, с точки зрения возможности промышленного использования, является зеленая микроводоросль Chlorella vulgaris, характеризующаяся высокими скоростями роста [24]. Однако для достижения рентабельности процессов получения конечных продуктов, в частности, биодизеля, из биомассы

микроводорослей, необходимо проводить исследования по масштабированию процессов

Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология» № 02 (119) 2013 © Научно-технический центр «TATA», 2013

накопления биомассы с заданными

характеристиками, обеспечивающими максимальный выход конечного продукта, а также по организации такого процесса в непрерывном режиме.

Целью настоящей работы являлось исследование основных характеристик полунепрерывного и непрерывного процессов накопления биомассы клеток микроводорослей C. vulgaris в минеральной среде.

Теоретический анализ

В настоящее время разработки технологических схем выращивания микроводорослей с использованием различных типов фотобиореакторов ведут многие корпорации, начиная с таких мировых гигантов в энергетической области, как Chevron, Shell, и заканчивая корпорациями De Beers, Nestle, для которых энергетический бизнес не является профильным, а также потребители топлива -компании Boing, Chrysler, NextDiesel и т.д. Работы направлены на снижение себестоимости получаемой биомассы микроводорослей путем использования для выращивания открытых естественных водоемов, водоемов очистных сооружений, попутных газов электростанций, применения комбинированных способов использования открытых и закрытых систем для выращивания [5]. Подавляющая часть (около 99%) коммерческого производства осуществляется в фотобиореакторах с открытой поверхностью. Фотобиореакторы используются для выращивания микроводорослей в фототрофных условиях при естественном освещении и температуре окружающей среды такими компаниями, как Royal, Dutch Shell (на Гавайских островах), Algae BioFuels (США, Алабама), Aquaflow Bionomic Corporation (Новая Зеландия), Mitsubishi (Япония) и др. [5]. Крупнейшим в Европе производителем микроводорослей является биотехнологическая компания Ingrepro B.V. (Нидерланды). Компания известна большим опытом в реализации технологических схем выращивания микроводорослей в стрессовых условиях с целью получения обогащенной липидами биомассы. В частности, одним из основных объектов ее разработок, задействованных в технологических схемах фототрофного культивирования, являются клетки рода Chlorella [5, 6]. В фотобиореакторах открытого типа в фототрофных условиях культивирует микроводоросли компания Seambiotic (Израиль). Микроводоросли последовательно культивируют сначала в колбах - так наращивается инокулят, затем в баках - так увеличивается объем инокулята, а после этого они переносятся в открытые бассейны различных размеров [7].

Таким образом, есть примеры успешной реализации технологических схем, аналогичных предлагаемой и реализуемых через накопление

инокулята и переноса его из одного фотобиореактора в другой.

Методика эксперимента

Микроорганизмы и их культивирование В работе использовались клетки зеленых микроводорослей Chlorella vulgaris C-1 (Коллекции института физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН).

Для культивирования культуры микроводорослей использовалась минеральная среда Тамийя [8].

Измерение оптической плотности суспензии клеток микроорганизмов и pH среды

Рост клеток микроорганизмов отслеживался спектрофотометрически на спектрофотометре Agilent UV-853 (Германия), оборудованном термостатируемой ячейкой, при длине волны 540 нм. Коэффициент пропорциональности между оптической плотностью суспензии клеток и концентрацией биомассы клеток определялся экспериментально из калибровочных кривых для исследуемой культуры микроорганизмов.

Значение pH приготовленных сред и отбираемых в процессе экспериментов проб контролировались с помощью рН-метра Corning Pinnacle 530 (Швейцария).

Определение кинетических параметров процессов с использованием клеток микроводорослей C. vulgaris

При проведении расчетов предполагалось, что изучалась закрытая (периодическая) система, в которой существенные для роста компоненты в процессе роста клеток не поступали в систему дополнительно и не покидали ее в течение каждого цикла. В закрытой системе скорость роста биомассы в конечном итоге стремится к нулю либо из-за недостатка субстрата, либо из-за ингибирования продуктом при его дальнейшем накоплении [9].

С учетом вышеизложенного положения удельная скорость роста / представляет собой скорость роста единицы популяции: dC = /С-dt, dü/dt = /С,

где t - время роста культуры, ч; С -концентрация клеток в момент времени t, г/л; / -удельная скорость роста клеток, ч-1.

На участке экспоненциального

(логарифмического) роста удельная скорость роста постоянна, она определялась из уравнения: lnC = lnC0 + /-t,

где С0 - начальная концентрация клеток, г/л.

Результаты и их обсуждения

На первом этапе работы было исследовано влияние условий (полунепрерывных и непрерывных) культивирования клеток зеленых микроводорослей рода Chlorella в течение продолжительного периода

International Scientific Journal for Alternative Energy and Ecology № 02 (119) 2013

© Scientific Technical Centre «TATA», 2013

времени на характеристики процесса накопления биомассы.

Для проведения полунепрерывного процесса культивирования микроводорослей по окончании первого цикла выращивания клеток половина объема суспензии накопившейся биомассы заменялась в реакторе на свежую среду. Подобная процедура повторялась первоначально с интервалом в 6 суток, затем в 3 суток. Результаты эксперимента представлены на рис. 1. Объем реактора в данном случае составил 750 мл, соотношение объемов жидкой и газовой фазы составило 0,4.

30 т

0 -1-1-1-1-1-1-1

0 5 10 15 20 25 30 35

Время, сутки

Рис. 1. Кинетика полунепрерывного культивирования культуры C. vulgaris. Пунктиром отмечено время замены % объема суспензии клеток в реакторе порцией свежей среды

того же объема Fig. 1. Kinetics of semicontinuous cultivation of C. vulgaris cells.

Dotted line shows time of % volume of cell suspension replacement in reactor by the same volume of fresh nutritional medium

Как следует из рис. 1, такой режим культивирования клеток позволил накапливать стабильно до 30 г/л биомассы клеток C. vulgaris в минеральной среде в течение нескольких циклов, сократив продолжительность самих циклов.

Величины удельных скоростей роста клеток C. vulgaris, достигнутые в каждом цикле их выращивания, суммированы в табл. 1. На основании этих данных был сделан вывод о том, что удельная скорость роста клеток напрямую зависит от исходной концентрации клеток микроводорослей, создаваемой в начале периода их культивирования. Так, для 4-го цикла накопления биомассы микроводорослей (с 26 по 28 сутки культивирования) при исходной концентрации клеток 14,6 г/л, удельная скорость роста составила 0,54 сут-1, что превысило в 1,3 раза аналогичную величину в случае 1-го цикла культивирования клеток C. vulgaris (с 0 по 13 сутки культивирования) в минеральной среде и при исходной концентрации клеток 0,15 г/л (табл. 1).

Таким образом было показано, что возможно длительное поддержание культуры клеток зеленых микроводорослей C. vulgaris в минеральной среде в полунепрерывном режиме. При этом процедуру внесения свежей среды возможно было осуществлять многократно, и она сопровождалась увеличением скорости накопления биомассы клеток

C. vulgaris и достижением стабильно высоких ее значений.

Таблица 1.

Значения удельной скорости роста клеток (ц) и скорости накопления биомассы (V) клеток C. vulgaris в полунепрерывном режиме их культивирования в минеральной среде

Table 1.

Values of cell growth specific rate (ц) and biomass accumulation velocity (V) of C. vulgaris cells at semicontinuous process of cells cultivation in mineral medium

Описанный способ культивирования клеток оказался эффективным не только в реакторах объемом 750 мл, но и в реакторах объемом 5 л. Соотношение объемов жидкой и газовой фазы для них также составляло 0,4. Кинетика роста клеток C. vulgaris в этих реакторах отображена на рис. 2.

Первые три цикла поддержания культуры зеленых микроводорослей осуществлялись путем замены ^ объема суспензии клеток на свежую среду, а следующие 4 цикла проводились путем замены лишь 20% объема суспензии клеток от общего объема жидкой фазы в реакторе.

Как видно на рис. 2, в реакторе объемом 5 л даже при внесении малого количества свежей среды было возможным весьма успешное культивирование клеток зеленых микроводорослей C. vulgaris в минеральной среде в полунепрерывном режиме. Конечная концентрация клеток в каждом цикле достигала значений 31-32 г/л.

Накопленная таким образом биомасса клеток C. vulgaris в дальнейшем использовалась для осуществления непрерывного режима

культивирования в экспериментальном

лабораторном фотобиореакторе (ООО «Аспект»,

Время, сутки

Рис. 2. Поддержание культуры C. vulgaris в минеральной

среде в полунепрерывном режиме в 5 л-реакторе. Пунктиром отмечено время частичной замены суспензии клеток в реакторе на аналогичный объем свежей среды

Номер цикла 1 2 3 4

культивирования

Р, сут-1 0,42±0,06 0,48±0,08 0,49±0,07 0,54±0,09

V, г/л/сут 1,53±0,03 2,79±0,05 2,49±0,05 5,56±0,12

§ 15

20

10

Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология» № 02 (119) 2013 © Научно-технический центр «TATA», 2013

Fig. 2. Maintenance of C. vulgaris cells at semicontinuous process conducted in 5 l-reactor with mineral medium. Dotted line shows time of some part of cell suspension replacement in the reactor by fresh nutritional medium

изменения рН в процессе культивирования, представленная на рис. 5, показывала, что в среде удалось успешное поддержание почти постоянных характеристик среды.

Рис. 3. Общий вид фотобиореактора, использованного для непрерывного культивирования клеток C. vulgaris в минеральной среде с глюкозой Fig. 3. General view of photobioreactor used for continuous cell cultivation of C. vulgaris cells in mineral medium with glucose

Суспензия клеток зеленых микроводорослей помещалась в бак объемом 20 л, из которого посредством центробежного насоса она прокачивалась со скоростью 20 л/мин через систему стеклянных трубок с внутренним диаметром 35 мм и внешним диаметром 38 мм. Через трубки круглосуточно через силиконовую мембрану барботировался углекислый газ со скоростью 1-2 мл/мин. Также в данной системе осуществлялось постоянное освещение мощностью 5000 Люкс источниками света с длиной волны в интервалах 450-480 нм и 640-700 нм одновременно. Фотобиореактор был оснащен полностью автоматизированной системой контроля pH среды, проводимости среды, температуры культивирования и концентрации растворенного кислорода в среде. Регулярно производилась замена 4 л суспензии клеток C. vulgaris на 4 л свежей среды.

Полученная в непрерывном режиме культивирования в минеральной среде с глюкозой зависимость концентрации и числа клеток C. vulgaris, накапливающихся в среде, от времени представлена на рис. 4.

Видно, что в данном случае оказалось возможным весьма эффективное наращивание и поддержание культуры клеток C. vulgaris в концентрации 8-10 г/л в течение не менее 50 суток культивирования в автоматизированной системе используемого 20 л-фотобиореактора. Кинетика

10 и

с

л

О 8 л т

о

6 1 о

4 м

15 -| ■5 14 -

i 13 -

0

IS 12 -

1 10 ~

Ё 9 С

I 8

¡S 7; 6 5

22 27 32 37 42 47 52

Время, сутки

Рис. 4. Кинетика накопления клеток C. vulgaris в минеральной среде с глюкозой в непрерывном режиме в 20 л-фотобиореакторе: ♦ - концентрация клеток C. vulgaris в среде, о - число клеток C. vulgaris в среде. Пунктиром отмечено время замены 20% объема суспензии клеток

микроводорослей на свежую среду. Fig. 4. Kinetics of C. vulgaris cells accumulation in mineral medium with glucose in continuous process in 20 l-photobioreactor: ♦ - concentration of C. vulgaris cells in medium, о - amount of C. vulgaris cells in the medium. Dotted line shows time of 20% cell suspension replacement in the reactor by fresh nutritional medium

10 1 9,5 -9 -8,5

M 8 -

7,5 ;

7 6,5 6 5,5 5

29 27

Т

25 S a ■a

23 » у

■a

21 »

О

19 17 1 15

32 37 42 47

Время, сутки

Рис. 5. Кинетика изменения основных параметров культивирования клеток C. vulgaris в минеральной среде с глюкозой в непрерывном режиме в 20 л-фотобиореакторе: ♦ - pH среды, о - температура культивирования. Fig. 5. Kinetics of main cultivation parameters change of C. vulgaris cells in mineral medium with glucose at continuous process in 20 l-photobioreactor: ♦ - medium pH, о - cultivation temperature.

Заключение

Таким образом, была показана возможность масштабирования процесса накопления биомассы зеленой микроводоросли C. vulgaris, осуществляемого в непрерывном режиме. Установлено, что при использовании 20 л фотобиореактора можно проводить наращивание и поддержание культуры клеток C. vulgaris в концентрации 8-10 г/л в течение не менее 50 суток. Получаемая таким образом биомасса является

International Scientific Journal for Alternative Energy and Ecology № 02 (119) 2013

© Scientific Technical Centre «TATA», 2013

перспективным источником сырья для производства целого ряда коммерчески значимых продуктов [10].

Работа поддержана государственным контрактом № 16.526.11.6003 Федеральной целевой программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы ".

Список литературы

1. Моисеев И., Тарасов В., Трусов Л. Эволюция биоэнергетики - время водорослей // The Chemical Journal. 2009. T. 12. С. 24-29.

2. Heredia-Arroyo T., Wei W., Ruan R., Hu B. Mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris and its potential application for the oil accumulation from non-sugar materials // Biomass Bioenergy. 2011. Vol. 35, No. 5. P. 2245-2253.

3. Никольская А.Б., Холстов А.В., Лягин И.В., Мамедова Ф.Т., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Иммобилизованные клетки Chlorella vulgaris для решения задач альтернативной энергетики и экологии // «Альтернативная энергетика и экология». 2012. №4. С. 95-100.

4. Francisco E.C, Neves D.B., Jacob-Lopes E., Franco T.T. Microalgae as feedstock for biodiesel production: carbon dioxide sequestration, lipid production and biofuel quality // Journal of Chemical

Technology and Biotechnology. 2010. V. 85, Р. 395403.

5. Храменков С., Козлов М., Щеголькова Н., Дорофеев А. Ресурс особого назначения: Использование потенциала очищенной воды городов для производства биотоплива // Вода Magazine. 2011. Т. 41, № 1. С. 18-22.

6. Babich I.V., van der Hulst M., Lefferts L., Moulijn J.A., O'Connor P., Seshan K. Catalytic pyrolysis of microalgae to high-quality liquid bio-fuels // Biomass and Bioenergy. 2011. Vol. 35. P.3199-3207.

7. Mohammad S.S., Ghobad A.T., Amin K., Roudsari H.V., Reza R.N. Study of different medium effects on growth and biomass of (Nannochloropsis oculata) microalgae // Journal of Marine Sciences and Technology. 2006. Vol. 1-2. P.43-53.

8. Tamiya H., Ywamura T., Shibata K., Hase E., Nihei T. Correlation between photosynthesis and light-independent metabolism in the growth of Chlorella // Biochimica et Biophysica Acta. 1953. V. 1. P. 25-40.

9. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. М.: Фаир-Пресс Гранд, 1999.

10. Efremenko E.N., Nikolskaya A.B., Lyagin I.V., Senko O.V., Makhlis T.A., Stepanov N.A., Maslova O.V., Mamedova F., Varfolomeyev S.D. Production of biofuels from pretreated microalgae biomass by anaerobic fermentation with immobilized Clostridium acetobutylicum cells // Bioresource Technology. V. 114, P. 342-348.

Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология» № 02 (119) 2013 © Научно-технический центр «TATA», 2013