Идентификация сальмонеллезов птиц метод ПЦР в формате мультеплекс Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ЭФФЕКТИВНОЕ № 4 май

2019

животноводство 2019

инновационная д /г глуц-ч® кормовая добавка ААЬОИТ-ЬИLI www.albit.vet

Ь

КГ

■ JA

Si /'

*

ieto 1:^16.24411/Д999-007А-2 о i ■

|УДК|619^79?842^4:577.212.3-Щй!8: 57.088.1^Мь- - ^

ЩЕеминатА* Втицеводства»

! IV

ПШ^ .«В.сУро^сийскийТнаучнО-ИсслеДоВател^ ^

еВоДСТВа»—

V

Га 1!

ИДЕНТИФИКАЦИЯ САЛЬМОНЕЛЛЕЗОВ ПТИЦ МЕТОД ПЦР В ФОРМАТЕ МУЛЬТЕПЛЕКС

Аннотация. Задачей настоящего исследования является разработка метода одновременного обнаружения ДНК микроорганизмов рода Salmonella, с применением диагностической панели методом полимеразно цепной реакции в формате мультиплекс. Были получены уникальные последовательности сиквенсов гена invA, а также sefA, по их генетическому маркеру — гену spvA для разных серовариантов сальмонелл. Специфичность праймеров была оценена с помощью программы BLAST на сервере NCBI. Исследование проб, содержащих патологические агенты бактериальной природы методом ПЦР, подтвердило специфичность выбранных праймеров. Таким образом, метод может быть предложен для исследования проб разного состава для выявления геномов S. Jyphimurium, S. Infantis, S. Еnteritidis.

Ключевые слова: сальмонеллез, птица, праймеры, диагностика, олигонуклеотиды, ПЦР.

Annotation. The objective of this study is to develop a method for simultaneous detection of DNA of microorganisms of the genus Salmonella, using a diagnostic panel consisting of microprobes for PCR in strips with immobilized test systems by polymerase chain reaction in the multiplex format. Unique sequences of the sequence of invA gene and sefA were obtained by their genetic marker — Spa gene for different serovariants of Salmonella. The specificity of primers was evaluated using the BLAST program on the NCBI server. The study of samples containing pathological agents of bacterial nature by PCR confirmed the specificity of the selected primers. Thus, the method can be proposed for the study of samples of different composition to identify the genomes of S. Typhimurium, S. Infantis, S. Enteritidis.

Keywords: salmonellosis, poultry, primers, diagnostics, oligonucleotides, PCR.

Сальмонеллез — является тяжелым инфекционным заболевание и на сегодняшний день продолжает наносить серьезный экономический ущерб птицеводческим хозяйствам. К данному заболеванию восприимчивы большинство видов птиц. Бактерии рода Salmonella являются возбудителем, они культивируются во многих питательных сред до 9-11 месяцев, а также обладают способностью сохранятся даже при воздействии высоких температур. Большинстве случаев сальмонеллы вызывают заболевания желудочно-кишечного тракта у птиц и осложняется течение болезни такими проявлениями как артрит, пневмония, поражение головного мозга, матки [1].

Характерной особенностью данного заболевания у птиц является то, что переболевшие особи продол-

жают выделять возбудителя в окружающую среду и представляют таким образом серьезную опасность для потребителей, так как человеческий организм чрезвычайно восприимчив к сальмонеллам.

Рост заболеваемости сальмонеллезом животных и людей обуславливает необходимость разработки современных высокочувствительных и специфичных методов экспресс диагностики болезни, выявления бактерионосителей, мониторинга кормов для животных, а также первичного животного продукта, полуфабрикатов и готового продукта животного происхождения.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени может сдать одним из приоритетных направлений развития в диагностики данного заболевания, так как позволяет повысить чувствительность исследования и уменьшить время обнаружения возбудите-

- Тематический номер «Птицеводство» бизнес-партнер номераальбит-бмов

agroyug.ru

Таблица1.

Последовательности праймеров и зондов

62

Определяемый вид Ген Праймеры и зонд Размер амплико-на, п.о.

SEFA-1 GGCTTCGGTATCTGGTGGTGTG 97

Б.ЕПвгШсМз SEFA-2 GTCATTAATATTGGCTCCCTGAATA

Флюоресцирующий зонд SEFA CCACTGTCCCGTTCGTTGATGGACA

Б.ТурЫтипит Б. ^апЙБ !пу-1 TGTCGTCATTCCATTACCTACC 288

!пу-2 ACGGTGACAATAGAGAAGACAAC

Флюоресцирующий зонд INVA TCTGGTTGATTTCCTGATCGCA

ля, за счет сокращения одной из стадии методики — электрофореза [2].

Разнообразные гены сальмонелл могут быть рассмотрены в качестве генетических маркеров. Отмечено наличие у сальмонелл такого гена как spvA, который находится на большой плазмиде вирулентности и имеющейся у 81% изолятов [3].

Также выявлено некоторыми исследователями нахождение такого гена как ^А, необходимого для инвазии, установленного с помощью метода ПЦР [4, 5]. Имеются сообщения о применении с целью идентификации сальмонелл видоспецифического фрагмента гена fimA, кодирующий основную субъединицу фим-брий, который имеется у абсолютно всех представителей рода сальмонелл и в том числе, у не имеющих жгутиков представителей, таких как S. РиИошт. Для идентификации некоторых сероваров ряд исследователей используют детекцию гена sefA [6].

Материалы и методы

С целью визуализации и множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей из базы

данных были отобраны сиквенсы генов для разных серовариантов сальмонелл. При помощи программы Меда5 было проведено выравнивание выбранных сиквенсов по гену ^А, подбирали схожие у абсолютно всех серовариантов сальмонелл фрагменты, находящиеся в основном в первой половине гена.

При анализе вторичных структур и возможной неспецифической гибридизации, используемых олиго-нуклеотидов при планировании мультиплексных смесей (смесей, объединяющих несколько пар праймеров и зондов) использовали РптегВ1^. Специфичность выбранных олигонуклеотидов оценивали, сравнивая их последовательности с последовательностями ДНК, представленными в базе данных GenBank.

Для испытания мультиплексной диагностической панели использовали штаммы микроорганизмов S. Enteridis, S. ТурЫтипит, S. ^ап^. Штаммы были получены из коллекции Всероссийского научно-исследовательского института птицеводства отдела микробиологии. Все штаммы микроорганизмов обладали типичными для них культурально-морфоло-

ЭФФЕКТИВНОЕ № 4 май

2019

животноводство 2019

инновационная кормовая добавка

Альбит-БИО www.albit.vet

63

гическими,биохимическими,антигенными и биологическими свойствами. В качестве диагностической панели, использовали микропробирки для ПЦР в стри-пах с крышками. Каждый стрип с раскапанными реакционными смесями на основе видоспецифических праймеров предназначен для анализа 1 образца и содержит от 3 пробирок с раскапанными реакционными смесями предназначенными для одновременного выявления возбудителей бактерии рода Salmonella серовариантов S. Enteridis, S. Typhimurium, S. Infantis.

Экстракцию бактериальной ДНК проводили с использованием набора «АмплиПрайм ДНК — сорб В», ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия в соответствии с инструкцией изготовителя. При выделении ДНК из исследуемого материала в качестве отрицательного контроля использовали 100 мкл бидистил-лированной воды.

Экстракт ДНК в количестве 5 мкл вносили в 25 мкл мультипраймерной ПЦР-смеси, содержащей из расчета на одну реакцию: а) 2,5 х Реакционной смеси — 10 мкл; б) 25 мМ МдС12-1мкл; в) праймеры прямые и обратные для генов invA и sefA — по 1 мкл каждого; г) зонды, специфичные для invA и sefA гена, — по 0,5 мкл; д) деионизованную воду — до 25 мкл.

ПЦР в реальном времени проводили с помощью прибора BioRad CFX96. Результаты считали достоверными только в случае корректного прохождения реакции в пробирках с положительным и отрицательным контролями амплификации.

Амплификацию осуществляли c использованием следующего режима: предварительная денатурация 95 °C — 5 мин; 35 циклов (95 °C — 30 сек., 58 °C — 20 сек, 72 °C — 20 сек). Детекцию флюоресценции проводили после каждой стадии отжига на каналах FAM и Yellow.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Результативность и специфичность метода ПЦР находится в зависимости от таких показателей как: универсальности подобранных праймеров, темпера-турно-временного режима, буферного состава реакционной смеси.

В процессе постановки мультиплексной ПЦР-ре-акции с применением праймеров, позволяющей идентифицировать виды S. Tythimurium, S. Infantis, S. Enteritidis в результате анализа была выбрана область специфичных для генов invA и sefA, образующих различные профили фрагментов, в зависимости от сероварианта сальмонелл. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов представлены в таблице 1.

Специфичность выбранных олигонуклеотидов на этапе расчетов была проанализирована с использованием программы nucleotide Blast NCB. Были подобраны опытным путем оптимальной концентрации ионов Mg2+ (2,5 мМ MgCl2), прямого и обратного праймеров (10-12 пМ), флуоресцентного ДНК-зонда (6-8 пМ) для ПЦР в моноварианте. На следующем

этапе работ была оптимизирована и апробирована мультиплексная ПЦР. Разработанный мультиплексный вариант ПЦР был также оптимизирован по содержанию ионов Mg2+ (2,5 мМ MgCl2), зонда (8 пМ), прямого и обратного праймеров Реакция амплификации в формате «мультиплекс» была оптимизирована для отжига праймеров при температуре 58 C°.

Анализ результатов разработанных диагностических панелях основан на так называемом «пороговом методе», включающем определение значения порогового цикла реакции Ct как точки пересечения графика накопления ДНК и пороговой линии. Кривая флуоресценции исследуемой пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции. Пороговая величина одинаковая для всех образцов, задается пользователем или программным обеспечением и учитывает наличие фоновой составляющей. Область фоновой составляющей представляет собой наименьшее значение флюоресценции, но выше фона каждого образца, куда не должны попадать ни участки экспоненциального роста, ни район выпадающих значений в начале кривой накопления ДНК. Чем меньше Ct, тем больше в нём было целевой ДНК в начальный момент времени. ДНК образцов, в которых флуоресцентный сигнал не достигает пороговой величины за время проведения реакции, не содержит целевых последовательностей. Образец считали положительным,

Исследуемые образцы проб на S. Tythimurium считаются положительными, если значение Ct по каналу FAM менее 33 цикла. Положительными на S. Enteritidis считаются пробы, в которых имеются четкие экспоненциальные кривые с выходом на плато к концу реакции по каналу JOE менее 33 цикла. Для проб в которых содержится ДНК S. Infantis считаются положительными кривые с выходом на плато к концу реакции по каналу Yellow менее 33 цикла. Образец считали отрицательным, если по каком-либо из трех каналов значение Ct отсутствовало.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы нами была разработана диагностическая панель, представленная из микропробирок для ПЦР в стрипах с крышками с раскапанными смесями, позволяющая проводить идентификацию и видовую дифференциацию одновременного обнаружения ДНК микроорганизмов S. Tythimurium, S. Infantis, S. Enteritidis, являющихся наиболее частыми контаминантами окружающей среды, представляющих наибольшую опасность для человека. Была оценена диагностическая и аналитическая чувствительности набора. Было экспериментально показано, что разработанный набор реагентов обладает высокой специфичностью. Предлагаемый ПЦР-метод в формате мультиплекс может быть доступен для массового исследования и проведения мониторинга на территории РФ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Антигенные формулы сероваров сальмонелл. / Под ред.П.А.Д. Гримонт. Ф. — КсВейль, 9-е издание — Тверь: ООО издательство «Триада» 2012. — 148с.

2. Rapid outbreak assessment. Unusual increase of Salmonella Mikawasima infections in humans // European Centre for Disease Prevention and Control, Stockholm, 28 November 2013. — P. 1-9.

3. Lan R. Population structure, origins and evolution of major Salmonella enterica clones / Lan R., Reeves P. R., Octavia S // Infect Genet Evol. — 2009. — Vol. 9(5). — P. 996-1005.

4. Julie R. Recent Multistate Outbreaks of Human Salmonella Infections Acquired from Turtles: A Continuing Public Health Challenge / R. Julie // Clinical Infectious Diseases. — 2010. — Vol. 50. — P. 554-559.

5. Rapid risk assessment. Multi-country outbreak of Salmonella Stanley infections // European Centre for Disease Prevention and Control, Stockholm, 27 July 2012. — P. 1-6.

6. Hopkins K. L. Standardisation of multilocus variable-number tandem-repeat analysis (MLVA) for subtyping of Salmonella enterica serovar Enteritidis / Hopkins K. L., Peters T. M., de Pinna E. and others // Euro Surveill. — 2011. — Vol. 16(32).