CC BY
64
УДК 637.136.3:66.095.261
Хлнвка 1.М., астрант, 'Цкарнк О.Й., д. с/г н., професор , 2Т. Боцер © slyvka.88@ukr.net, 1515агук o@yahoo.com 1Лье1вський нацюнальний ушверситет ветеринарног медицины та бютехнологт ¡мет С. З. Гжицького, м. Лье1е,, Украгна 2Жешуеський ушеерситет, м. Кольбушоео, Польща
1ДЕНТИФ1КАЦ1Я МОЛОЧНОКИСЛИХ БАКТЕР1Й 13 ЗАСТОСУВАННЯМ КОМПЛЕКСУ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИХ
МЕТОД1В
МолочнокислI бактерп належать до групи м1крооргашзм1в, ят е основою для створення пробютичних препарат1в, що позитивно впливають на здоров'я людини. Вони широко використовуються в харчовт промисловост1, беручи участь в процес виробництва I тдтримщ св1жост1 продукту та одночасно знижують потребу у використанш в штучних консервантгв.
Метою роботи було диференцтвати молочнокислI бактерш, видтенг з овечого сиру, виготовленого в умовах високоггрног полонини Путильського району Чертвецьког област1. Для досягнення щег мети використано метод випадковог ампл1ф1кацп пол1морфног ДНК (RAPD-PCR) та ампл1ф1кацт регюну м1жгенног дглянки 16SI 23S rRNA.
Анал1з результат1в свгдчить, що бактер1альна флора, яка бере участь у виробництв1 сиру досить р1зномаштна. Нам вдалося отримати 8 ргзних генетичних профшв, як1 вказують на ¡снування восьми груп бактерш. Дослгджуваннг МКБ не можуть бути в1днесен1 до конкретного виду через в1дсутшсть схожих генетичних профшв референтних штам1в.
Метод RAPD-PCR е дощльним при визначенн1 р1зномаштност1 МКБ в кглькгсному вгдношент, але не достатшм з точки зору яюсного анал1зу. Остльки, молочнокисла флора, яка ¡зольована гз овечого сиру Карпатського регюну Украгни, не вивчена, то використання методу RAPD-PCR е початковим етапом в гг дослгджент.
Ключовi слова: молочнокислI бактерп, молекулярно-генетичн методи, ¡дентифжащя, пол1меразна ланцюговареакц1я, ампл1ф1кац1я, гетерогеншсть.
УДК 637.136.3:66.095.261
ХИ.Н. Сливка, аспирант, ХО.И. Цисарык, д. с/г н., професор, 2Т. Боцер 1Львовский национальный университет ветеринарной медицины и биотехнологий имени С. З. Гжицкого, Украина 2Жешувский университет, г. Кольбушово, Польша
ИДЕНТИФИКАЦИЯ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ КОМПЛЕКСА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ
МЕТОДОВ
Молочнокислые бактерии относятся к группе микроорганизмов, которые являются основой для создания пробиотических препаратов, которые положительно влияют на здоровье человека. Они широко используются в пищевой промышленности, участвуя в процессе производства и поддержке
© Сливка 1.М., Щсарик О.Й., Т. Боцер, 2014
280
свежести продукта и одновременно снижают потребность в использовании искусственных консервантов.
Целью работы было дифференцировать молочнокислые бактерий, выделенные из овечьего сыра, изготовленного в условиях высокогорной долины Путильского района Черновицкой области. Для достижения этой цели использован метод случайной амплификации полиморфной ДНК (RAPD-PCR) и амплификации региона межгенного участка 16S i 23S rRNA.
Анализ результатов показывает, что бактериальная флора, которая участвует в производстве сыра весьма разнообразна. Нам удалось получить 8 различных генетических профилей, которые указывают на существование восьми групп бактерий. Исследование МКБ не могут быть отнесены к конкретному виду за отсутствия похожих генетических профилей референтных штаммов.
Метод RAPD-PCR является целесообразным при определении разнообразия МКБ в количественном отношении, но не достаточным с точки зрения анализа. Поскольку молочнокислая флора, которая изолирована с овечьего сыра Карпатского региона Украины, не изучена, то использование метода RAPD-PCR есть начальным этапом в ее исследовании.
Ключевые слова: молочнокислые бактерии, молекулярно-генетические методы, идентификация, полимеразная цепная реакция, амплификация, гетерогенность.
UDC 637.136.3:66.095.261
JI.M. Slyvka, O.Y. xTsisaryk, 2T. Bocer
1Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S. Z. Gzhytskyj, Lviv, Ukraine 2University of Rzeszow, Kolbuszowa, Poland
THE APPLICATION OF THE COMPLEX OF MOLECULAR-GENEIC METHOD FOR IDENTIFICATION OF LACTIC ACID BACTERIA
Lactic acid bacteria belong to the group of microorganisms, that are basis for creation of probiotic, that positively influence on a health man. They are widely used in food industry, participating in the of production and to support of freshness of product and also reduce a requirement in the use at artificial preservatives.
Our purpose was to identify LAB, isolated from ewe 's cheese produced in the alpine mountain valley of Putyla district of Chernivtsi region. The random amplification of polymorphic DNA(RAPD-PCR) and amplification of region of intergenic area of 16S and 23S rRNA have been used to achieve this purpose.
The analysis of results testifies that bacterial flora that participates in the production of cheese various enough. 8 different genetic profiles that specify on existence of eight groups of bacteria we succeeded to get. Investigated LAB can not be attributed to a specific type because of the lack of similar genetic profiles of reference strains.
The method RAPD-PCR is appropriate in determining the diversity LAB quantitatively, but not sufficient in terms of qualitative analysis. Since lactic flora, which is isolated from ewe's cheese Carpathian region of Ukraine, has not been studied, the use of RAPD-PCR method is the first step in its study.
281
Key words: lactic acid bacteria, molecular genetic methods, identification, polymerase chain reaction amplification, heterogeneity.
Вступ. Молочноки^ бактери (МКБ) все бшьше привертають велику увагу науковщв створенням на !х 0CH0Bi пробiотичних препаратiв з метою оздоровлення оргашзму людини [1]. Питання видiлення, селекци й удосконалення штамiв МКБ, якi продукують бiологiчно активш речовини, е актуальними в даний час [2].
Бiохiмiчнi та морфолопчш властивостi лактобактерiй на сьогоднi е основним i единим критерiем мiжродовоl i видово! приналежностi цих мiкроорганiзмiв. Проте численнi данi, що стосуються особливостей !х бюлоги, морфологи та бiохiмil, все одно часто виявляються недостатнiми, а iнодi тiльки ускладнюють визначення дослiджуваних об'ектiв, а саме встановлення !х таксономiчного положення. Тому альтернативою класичнш бiохiмiчнiй щентифжаци е метод генотипування з використанням полiмеразноl ланцюгово1 реакци (англ. Polymerase Chain Reaction) [3].
Метою роботи е застосування комплексу генетично-молекулярних методiв для вивчення генетичного рiзноманiття штамiв МКБ, яю були видiленi традицiйного харчового продукту украшщв - бринзи. Варто вщзначити, що генетичний аналiз бактерiальноl флори, видшено1 з овечого сиру, виготовленого в домашшх умовах на теренах украшських Карпат, буде зроблено вперше.
Для вивчення генетичного полiморфiзму ДНК МКБ, використовували молекулярно-генетичний метод PCR з випадковими праймерами RAPD-PCR (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA) та метод риботипування (амплiфiкацiя регiону мiж генами 16S i 23S rRNA).
RAPD-PCR - це метод, який дозволяе проводити аналiз генома без точного знання його послщовностей, вш заснований на PCR, що проводиться на геномнш ДНК. На вщмшу вiд стандартно1 полiмеразноl ланцюгово1 реакци використовують один праймер, як правило, з довжиною вщ 10 до 20 пар основ. Залежно вiд способу диференщаци можна застосовувати бiльше праймерiв. Ц праймери з довiльною послiдовнiстю, як правило, шщшють амплiфiкацiю фрагментiв ДНК в рiзних областях генома одночасно [4].
Риботипування - один з методiв генетичного типування. Метод полягае у роздшенш мiкроорганiзмiв завдяки високш гетерогенностi генiв i кодуючих рибосомальних РНК (рРНК) мало1 i велико1 субодиницi прокарiотичноl рибосоми. Цi гени вкладеш в оперон rrn, який е характерним для вах бактершних мiкроорганiзмiв. Мiж послiдовностями, вiдповiдальними за синтез 16S, 23S i 5S рРНК, е полiморфнi дiлянки рiзноl послiдовностi i розмiру. Вони е щеальними для використання у фшогенетичних дослiдженнях [5].
Розробка нових та оптимiзацiя вiдомих молекулярно-генетичних методiв шдикаци i точно1 видово1 iдентифiкацil МКБ е актуальним i практично потрiбним завданням, якому придiляеться велика увага закоронних i вiтчизняних дослiдникiв [6].
282
Матер1али та методи дослщження. MaTepianoM для дослщжень був овечий сир буц (бринза, до моменту солшня), виготовлений в умовах високопрно! полонини Путильського району Чершвецько! oблaстi. Об'ектом дoслiджeння слугували мiкpoopгaнiзми, iзoльoвaнi i3 овечого сиру. Предметом дослщження були морфолого-культуральш та гетерогенш влaстивoстi iзoльoвaних МКБ. 1з дoслiднoгo зразка сиру було iзoльвaнo 28 чистих культур МКБ.
Визначення приналежност видiлeних бaктepiй до роду Lactobacterium проводили за ГОСТ 10444.11-89 «Продукти харчовт Методи виявлення молочнокислих мiкpopгaнiзмiв».
Для iзoляцi! чистих культур МКБ використовували метод пoсiву десятикратних розведень дослщжуваного мaтepiaлу на твepдi пoживнi середовища MRS та М17, що мютили 2% агару Поживш середовища були пpигoтoвaнi на oснoвi дистильовано! води i стepилiзoвaнi в aвтoклaвi при тeмпepaтуpi 121 °С, тиску 1 атм, протягом 15 хв. Метод виявлення молочнокислих паличок базувався на !х здaтнoстi розвиватися на поживному сepeдoвищi MRS. Для iзoляцi! лaктoкoкiв використовували середовище М17. 1нкубацш молочнокислих паличок здiйснювaли в анаеробних та мжроаерофшьних умовах за температури +38 °С, iнкубaцiю лактокоюв при тeмпepaтуpi +25 °С та +42 °С. Пiсля iнкубувaння на твердих поживних середовищах oкpeмi КУО МКБ переносили у рщке поживне середовище MRS та М17 для нарощення бюлопчно! маси для подальшо! iзoляцi! геномно! ДНК бaктepiй.
1золяцш геномно! ДНК проводили, використовуючи нaбip Genomic Mini фipми A&A Biotechnology згщно з iнстpукцieю виробника. Визначення концентраци i чистоти iзoльoвaнo! ДНК проводили на спeктpoфoтoмeтpi NanoDrop 2000 фipми Thermo Scientific.
Амплiфiкaцiю ДНК виконано на oснoвi PCR з використанням праймера 1254 (Sigma-Aldrich). Нуклеотидна секвенщя стартера 1254, який використаний для RAPD-PCR, була 5'- CCGCAGCCA -3'. PCR для дшянки 16S-23S рРНК проведено з використанням пари пpaймepiв 16-1A та 23-1В (Sigma-Aldrich). Нуклеотидна послщовшсть для пpaймepiв, що були викopистaнi для PCR-ITS {англ. internal transcribed spacer PCR):16-1A 5'- GTCGGAATCGCTAGTAATCG -3' та для 23-1В 5'- GTCGGAATCGCTAGTAATCG -3'.
Реакцшна сумш для RAPD-PCR та PCR-ITS складалась iз дистильовано! води, dNTP, буферу, пoлiмepaзи Taq, стapтepiв 1254 (RAPD-PCR), 16-1A та 231В (PCR-ITS) та матриц ДНК.
Амплiфiкaцiю виконували за допомогою термоциклера Mastercycler Gradient фipми Eppendorf, беручи до уваги температури плавлення пpaймepiв i лiтepaтуpнi дaнi щодо умов проведення RAPD-PCR та PCR-ITS [7].
Для проведення RAPD-PCR застосовано режими, що представлено в таблиц 1.
Електрофорез в агарозному гeлi здiйснeнo в aпapaтi фipми Bio-Rad. Приготовлено 1,5% агарозний гель i розведення буферу 1xTBE (TrisHCl, H3BO3,
283
EDTA). Для вiзуалiзацil ДНК в агарозний гель додавали бромистий етидш (EtBr) у розрахунку 0,5 мг/мл. Фотографування виконували у трансiлюмiнаторi G-Box (Syngene). Кшьккть амплiфiкованого ДНК визначали на основi маркера молекулярное' маси GeneRuler 1kb DNA Ladder фiрми Fermentas (рис 1).
Таблиця 1
Режими проведення RAPD-PCR__
Етап Температура (°C) Час (хв.) Кшьшсть цикл1в
Денатуращя 94 5
Приеднання стартера 36 5 4
Елонгащя 72 5
Денатуращя 94 1
Приеднання стартера 36 1 30
Елонгащя 72 2
Кшцеве подовження 72 10 1
PCR-ITS проведено при режимах , що представлено в таблиц 2.
Таблиця 2
Режими проведення PCR-ITS
Етап Температура (°C) Час Кшьшсть цикл1в
Денатуращя вступна 94 5 хв. 1
Денатуращя 94 40 с. 35
Приеднання стартера 55 45 с.
Елонгащя 72 60 с.
Кшцеве подовження 72 7 хв. 1
GeneRuler™ 1 kb Plus DNA Ladder
□'GeneRuler™ 1 kb Plus DNA Ladder, ready-to-use
1Ч> llu/О.Ь jjg_%
20000 20.0 4.0
X 10000 20.0 4.0
7000 20.0 4.0
5000 75.0 15.0
4000 20.0 4.0
3000 20.0 4.0
_ 2000 20.0 4.0
- 1500 80.0 16.0
— 1000 25.0 5.0
— 700 25.0 5.0
— 500 75.0 15.0
400 25.0 5.0
— 300 25.0 5.0
— 200 25.0 5.0
— 75 25.0 5.0
0.5 ggflare. 8 cm length gel, 1XTAE. 7 V/cm, 45 mln
Рис.1 Маркер величини ДНК GeneRuler 1kb DNA Ladder
Для порiвняльного аналiзу амплiфiкованих фрагментiв ДНК використано референтш штами МКБ iз колекци Katedry Mikrobiologii Przemyslowej i Zywnosci (промислово1 мкробюлоги i продовольства) Uniwersytetu Warminsko-Mazurskiego, Rzeczpospolita Polska). У роботi
284
використано 12 штамiв МКБ: Lactococcus lactis spp. lactis 6; Lactococcus lactis ssp. cremoris; Lactococcus lactis ssp. lactis 1267; Lactococcus lactis subsp. lactis var. diacetylactis; Lactobacillus plantarum 295/1; Lactobacillus brevis 211; Enterococcus faecalis; Lactobacillus plantarum 21; Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus; Lactobacillus acidophilus 43/15; Lactobacillus brevis 32; Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides.
Результати дослщжень. Вперше проведено aHani3 6aKTepianbH0i мжрофлори овечого сиру i3 застосуванням комплексу мжробюлопчних та генетично-молекулярних методiв RAPD-PCR та PCR-ITS.
За морфолого-культуральними властивостями МКБ вщносилися до родин Lactobacteriaceae та Streptococcaceae та трьох pedis Lactobacterium, Lactococcus i Streptococcus.
1золяцш геномно! ДНК виконано i3 28 чистих культур МКБ. Концентрацш та чистоту iзольовaноl ДНК представлено у таблиц 3.
Таблиця 3
Результати визначення ступеня чистоти i концентрацп iзольовано'l геномно'' ДНК i3 дослщжуваних культур МКБ_
№ 1золяту МКБ Концентращя ДНК нг/мкл Чистота ДНК А260/А280 № 1золяту МКБ Концентращя ДНК нг/мкл Чистота ДНК А260/А280
1 84,7 1,81 15 93,7 1,69
2 83,6 1,80 16 185,4 1,63
3 72,4 1,81 17 87,3 1,78
4 113,4 1,82 18 145,2 1,69
5 96,6 1,66 19 53,6 1,73
6 87,5 1,78 20 122,2 1,62
7 77,0 1,78 21 189,7 1,60
8 94,4 1,80 22 134,0 1,62
9 84,3 1,76 23 103,8 1,75
10 164,1 1,61 24 78,9 1,83
11 79,5 1,76 25 87,6 1,67
12 86,8 1,81 26 107,3 1,78
13 95,6 1,77 27 73,4 1,86
14 76,6 1,81 28 82,6 1,68
Амплiфiкацiю гена 16S рРНК i дiлянки мiж генами, що кодують 16S i 23S рРНК, проведено для пiдтвердження якост видшено! ДНК i подальшого И використання, як матриц для методу RAPD-PCR. Праймери, що використанi в реакци були гомологiчнi висококонсервативнiй дшянщ. Таким чином, при вiдсутностi продукту амплiфiкацil потрiбно автоматично дисквалiфiкувати даний зразок i виключити його iз подальших дослiджень. Пiсля електрофоретичного аналiзу, продукти амплiфiкацil були виявленi в кожному з аналiзованих зразкiв (рис. 2, рис. 3). Тшьки в одному випадку (амплiфiкацiя гена 16S рРНК, зразкок 15) вихiд реакци не був найвищим. Але при проведенш
285
PCR-ITS, кшькють iзольованоl ДНК е достатньою i реакщя вiдбуваeться позитивно.
Л1 1 2 3 4 5 6 Т'] 8 9 10Д1 12 13 Н15 16 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
П — —
• ip 1-И-К
I« И,. «ööifflJJ,
Рис. 2. Електрофоретичне розд1лення продукт1в амп.^фнкацп
гена 16S рРНК.
М- маркер молекулярног маси (GeneRuler 1kb DNA Ladder). Доргжки №1-28 - дослгджуеат зразки МКБ. Дор1жка №15 - брак продукту PCR.
Ml 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 13 14151617 18 19 20 2122 23 24 25 26 27 28
t kMÜ<| уЦшУНУии
Рис. 3. Електрофоретичне розд1лення продукт1в ампл1ф1кац1я пол1морфного рег1ону, що кодуеться 16S i 23S рРНК (PCR-ITS)
М- маркер молекулярног маси (GeneRuler 1kb DNA Ladder).
Доргжки №1-28 - дослгджуеат зразки МКБ.
Результати, отримаш при проведенш RAPD-PCR дали можливкть встановити значний стутнь гетерогенност всерединi дослщжуваних штамiв МКБ. Оскiльки, кожний окремий iзолят МКБ характеризувався рiзною кшькктю амплiфiкованого ДНК i вiдподно рiзною кiлькiсть ix молекулярно! маси. Профш амплiфiкацil ДНК дослiджуваниx iзолятiв МКБ, що отримаш тд час роздшення в електрофоретичному полi, представлено на рисунку 4.
На рисунку 5 представлен профш амплiфiкацil ДНК референтних штамiв МКБ отриманi при електрофоретичному роздшенш Електрофорез референтних штамiв МКБ проведено для порiвняння iз отриманими профшями ДНК дослiджуваниx штамiв МКБ.
286
Ml 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 М
М 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 М
Рис. 4. Електрофоретичнероздтення продукты RAPD-PCR.
М—маркер молекулярног маси (GeneRuler 1kb DNA Ladder). Доpiжки № 1 - 28 до^джуват зразки МКБ
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 М
Рис. 5. Електрофоретичне роздшення продукпв RAPD - PCR.
М - маркер молекулярно! маси (GeneRuler 1kb DNA Ladder ).
Доргжкн № 1-12 референтш штами МКБ. 1 - Lactococcus lactis spp. lactis 6, 2 - Lactococcus lactis ssp. cremoris, 3 - Lactococcus lactis ssp. lactis 1267, 4 - Lactococcus lactis subsp. lactis var. diacetylactis, 5 - Lactobacillus plantarum 295/1, 6 - Lactobacillus brevis 211, 7 - Enterococcus faecalis, 8 - Lactobacillus plantarum 21, 9 - Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, 10 - Lactobacillus acidophilus 43/15, 11- Lactobacillus brevis 32, 12- Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides.
287
При проведенш порiвняльного ан^зу профшв амплiфiкащl дослщжуваних МКБ та референтних штамiв МКБ пiсля проведення RAPD-ПЛР не вдалося вiдшукати спiльних електрофоретичних зразкiв. Що в свою чергу не дае нам можливостi визначити, якi МКБ беруть участь у процес виробництва сиру. Але за схожютю електрофоретичних профшв мiж дослiджуваними штамами МКБ, !х можна об'еднати у 8 груп, що вказуе на юнування восьми груп бактерш, якi були iзольованi iз сиру.
Дослiджуванi зразки МКБ, яю вiднесенi до певних груп представлено в таблиц 4.
Таблиця 4
Групп дослщжуваних зразкт МКБ, що мають под1бш генетичш профн.л пiд час використання RAPD-PCR_
Номер групи, що мають Номери дор1жок електрофоретичних зшмшв, що мають
под1бний генетичний профшь схож! генетичш профш
I 1,3,4,6,7,9,10,13,14
II 2,8,14,21,22,25,26,27,28
III 11,12,16
IV 17,18
V 19,20
VI 5
VII 15
VIII 23
За результатами амплiфiкащl випадково полiморфноl ДНК дослiджуваних штамiв МКБ можна встановити !х мiжродиннi зв'язки та стверджувати про !х гетерогенш властивостi всерединi родини Lactobacteriaceae. Встановлення родинних зв'язкiв кожного виду та щентифжащя на видовому i штамовому рiвнi вимагатиме застосування iнших молекулярно-генетичних методiв аналiзу.
Висновки. Пiдсумовуючи проведену роботу, вважаемо застосування методу RAPD-PCR доцшьним при визначеннi рiзноманiтностi МКБ в кшьккному вiдношеннi, але не найкращим з точки зору якюного аналiзу. Оскiльки, молочнокисла флора, яка iзольована iз овечого сиру Карпатського регюну Укра1ни, не вивчена абсолютно, то використання методу RAPD-PCR е початковим етапом в И дослщженш. За аналiзом електрофоретичних знiмкiв, можемо стверджувати, що бактерiальна флора дослщжуваного овечого сиру е рiзноманiтна i володiе досить гетерогенними властивостями, оскшьки И не вдалося порiвняти iз референтними штамами.
Перспективи подальших дослщжень. Подальшi дослiдження будуть спрямованi на застосування додаткових методiв дослiдження. Одним iз таких методiв е аналiз полiморфiзму довжин рестрикцiйних фрагментiв (RFLP-PCR), який при спiвввставленннi iз уже отриманими результатами дасть можливкть бшьш детально охарактеризувати iзольовану молочнокислу флору iз овечого сиру. Однак, визначення остаточно! приналежностi iзолятiв МКБ можливо
288
провести iз застосуванням секвенування гена 16S рРНК або полiморфноl дшянки мiж генами 16S i 23S рРНК.
Л1тература
1. Bondarenko V.М. i drugie. Probiotyky i mehanizmy ih lechebnogo deystvija [Probiotics and their mechanisms of therapeutic action] Eksperymentalna klinicheskaja gastroenterologija, 2004. no. 3. pp. 83 - 87 (in Ukrainian).
2. Herich R., Levkutvet M., (2002) Lactic acid bacteria, probiotics and immune system. Vet. Med. - Czech, 47, (6): 169-180.
3. Kovalenko N.K, Laschevskyy V.V. Primenenija metoda polymeraznoj tsepnoj reaktsii (PCR) dlja identyfikatsij molochnyh bakterij [Application of the polymerase chain reaction (PCR) for identification of lactic acid bacteria]. Molochna promyslovist' — Dairy Industry, 2003 vol. 1, no 4, pp. 24-25 (in Ukrainian).
4. Tingej S.V., del Tufo J.P. Genetic analysis with random amplified polymorphic DNA markers Plant Physiol, 1993, 101, рр. 349-352.
5.Bouchet V., H. Huot, R. Goldstein (2008) Molecular genetic basis of ribotyping. Clin. Microbiol. Rev. April 2008 vol. 21 no. 2 262-273.
6. Точилина А.Г. Индикация и идентификация бактерий рода Lactobacillus с использованием полимеразной цепной реакции/ Точилина А.Г., Новикова Н.А., Соколова К.Я., Соловьева И.В., Белова И.В., Иванова Т.П .// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008, №3. - С. 69-73.
7. Mora D., Ricci G., Guglielmetti S., Daffonchio D., Fortina M. G. (2003) 16S-23S rRNA intergenic spacer region sequence variation in Streptococcus thermophiles and related dairy streptococci and development of a multiplex ITS-SSCP analysis for their identification. Microbiology 149, 807-813.
Рецензент - к.б.н., професор ушверситету Гачак Ю.Р.
289
