CC BY
0INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" _25-26 SEPTEMBER, 2024_
ИДЕНТИФИКАЦИЯ МЕСТНЫХ ШТАММОВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS И МЕТИЦИЛЛИН-РЕЗИСТЕНТНЫХ S. AUREUS (MRSA) МЕТОДОМ РТ-ПЦР
1Муродова Ижобатхон Абдулбоси кизи, 2Ибрагимов Адил Ахмедович, 3Шарафитдинова Гульнара Хакимовна, 4Ли Лариса Тимофеевна
1докторант PhD, ТашНИИВС, 2д.б.н., зав. лаб. высокие технологии, ТашНИИВС, 3зав.
лаб. бактериологии, РНЦСМП, 4зав. лаб. микробиологии, ТашНИИВС https://doi.org/10.5281/zenodo.13833361
Аннотация. Staphylococcus aureus является одним из наиболее важных патогенов как внутрибольничных, так и внебольничных инфекций со значительным уровнем заболеваемости и смертности пациентов во всем мире. За последние несколько десятилетий, после появления антибиотиков, появление и распространение метициллин-резистентного S. aureus (MRSA) остается сложной проблемой общественного здравоохранения. Цель исследования. Идентификация штаммов MRSA методом ПЦР из местных изолятов S. aureus. Материалы и методы. MRSA штаммы были идентифицированы методом РТ-ПЦР. Выводы. Среди 42 штаммов S. aureus, выявлены 23 изолята с фенотипом MRSA. Ключевые слова: S. aureus, MRSA, ПЦР.
Annotation. Staphylococcus aureus is one of the most important pathogens of both nosocomial and community-acquired infections with significant morbidity and mortality rates in patients worldwide. Over the past few decades, after the advent of antibiotics, the emergence and spread of methicillin-resistant S. aureus (MRSA) has remained a complex public health problem. The purpose of the study. Identification of MRSA strains by PCR from local S. aureus isolates. Materials and methods. MRSA strains were identified by RT-PCR. Conclusions. Among the 42 strains of S. aureus, 23 isolates with the MRSA phenotype were identified. Key words: S. aureus, MRSA, PCR.
Долзарблиги. Staphylococcus aureus ham kasalxonada, ham jamiyatda orttirilgan infektsiyalarning eng muhimpatogenlaridan biri bo'lib, butun dunyo bo'ylab bemorlarda sezilarli darajada kasallanish va o'limga olib keladi. So'nggi bir necha o'nyilliklar davomida, antibiotiklar paydo bo'lganidan beri, metitsillinga chidamli S. aureus (MRSA) paydo bo'lishi va tarqalishi sog'liqni saqlashning qiyin muammosi bo'lib qolmoqda. Tadqiqot maqsadi. Mahalliy S. aureus izolatlaridan PCR yordamida MRSA shtammlarini aniqlash. Materiallar va usullar. MRSA shtammlari RT-PCR yordamida aniqlandi. Xulosa. 42 S. aureus shtammlari orasida MRSA fenotipiga ega 23 izolat aniqlangan.
Kalit so'zlar: S. aureus, MRSA, ПЗР.
ВВЕДЕНИЕ
Staphylococcus aureus является одним из наиболее важных патогенов как внутрибольничных (ВБИ), так и внебольничных инфекций (ВНБИ) со значительным уровнем заболеваемости и смертности пациентов во всем мире [5]. S. aureus как потенциальный патоген вызывает различные инфекции, включая поверхностные и
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" _25-26 SEPTEMBER, 2024_
глубокие кожные инфекции, инфекции мягких тканей, бактериемию, эндокардит, остеомиелит, пневмонию, синдром токсического шока и синдром стафилококковой чешуйчатой кожи [7]. За последние несколько десятилетий, после появления антибиотиков, появление и распространение метициллин-резистентного S. aureus (MRSA) остается сложной проблемой общественного здравоохранения [12].
Штаммы MRSA, характеризующиеся наличием гена mec A, который и кодирует пенициллинсвязывающий белок (PBP2-a), обладают устойчивостью ко многим антибиотикам, включая пенициллин и другие бета-лактамы [8, 9].
Распространение и молекулярная эпидемиология MRSA в мире
Для MRSA характерна высокая степень клональности популяции. В 1970-1980 гг. MRSA стали абсолютным лидером в структуре внутригоспитальных инфекций. Тем не менее частота регистрации случаев таких инфекций в разных странах колеблется в очень широком диапазоне. Европейской системой по надзору за распространением резистентности (European Antimicrobial Resistance Surveillance Network - EARS-Net), представлены данные, где показана доля выявляемых MRSA в разных странах за 2013 г. [4].
В таких странах, как Румыния, Италия, Греция, Португалия, Мальта, частота выявления MRSA очень высока (35-65%), в Африке доля MRSA колеблется в пределах 2550%. Азия - один из неблагоприятных регионов, где соотношение CA-MRSA и HA-MRSA составляет 25 и 75%. Особенно неблагоприятна ситуация в Корее, Шри-Ланке и Вьетнаме. [6]. В России частота встречаемости MRSA может колебаться от 0 до 80% в зависимости от стационара и географического региона [2].
Диагностика инфекций, вызываемых MRSA, детекция
метициллинрезистентности
Шире всего молекулярные методы применяются при диагностике бактериемии (сепсиса) и при скрининге на носительство MRSA, т.е. в тех ситуациях, когда скорость ответа имеет существенное значение. В случае бактериемии (сепсиса) быстрый ответ необходим для принятия решения об антибактериальной терапии, а в случае скрининга -для принятия решения о необходимости изоляции пациента. Скрининг на носительство широко распространен в Европе и США, где это исследование применяется в системе инфекционного контроля для предотвращения импорта MRSA в стационары.
При всей перспективности молекулярной диагностики классические методы вряд ли утратят свое значение в обозримом будущем. Если классическая микробиологическая диагностика инфекций, вызываемых MRSA, ничем не отличается от диагностики других стафилококковых инфекций, то детекция метициллинрезистентности имеет некоторые особенности [1].
Цель исследования. Идентификация штаммов MRSA методом ПЦР из местных выявленных изолятов S. aureus.
Материалы и Методы. В этой работе были исследованы изоляты 85 пациентов женского и мужского пола всех возрастов, с диагнозом инфекция, при Республиканском научном центре скорой медицинской помощи города Ташкента. Исследуемые изоляты были выделены из крови, раны, выделений трахеальной трубки, глаз, ушей, мочи,
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" _25-26 SEPTEMBER, 2024_
абсцесса и спинномозговой жидкости (СМЖ) и тестированы на выявление Staphylococcus aureus.
Бактериальные изоляты субкультивировали на чашках-Петри с кровяным агаром (Merck, Германия) и инкубировали при 37°C в течение 24 часов. Среди 85 исследуемых изолятов, 42 изолята были идентифицированы как штаммы стафилококков S. aureus с использованием фенотипических лабораторных методов, таких как морфология колоний, окрашивание по Граму и обычные биохимические тесты, включая тест на каталазу, ферментацию маннита, продукцию ДНКазы и реакцию коагулазы плазмы [11]. Все фенотипически идентифицированные стафилококки хранили в триптиказо-соевом бульоне (TSB; Merck, Германия), содержащем 20% глицерина, и хранили при температуре -70°C для дальнейшего молекулярного исследования.
Для выявления штаммов с фенотипом MRSA среди исследуемых изолятов S. aureus, использовали коммерческий набор РТ-ПЦР. Процедуру ПЦР проводили по протоколу производителя «АмплиСенс-MRSA-скрин-титр-FL». РТ-ПЦР проводили на приборе аплификаторе - «ДНК-Технология», Россия. Молекулярно биологические тесты методом РТ-ПЦР были проведены в лаборатории «Высокие технологии» при ТашНИИВС.
Результаты и обсуждение.
Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) - наиболее частый патоген человека, вызывающий различные гнойные процессы: инфекции кожи и мягких тканей (ИКМТ), остеомиелиты, пневмонии, бактериемии. Кроме того, S. aureus является представителем нормальной микробиоты человека, считается, что он встречается у 30-60% человеческой популяции и бессимптомно колонизирует слизистые оболочки носа, подмышечные впадины, пах, подколенную область. Как известно, внедрение первых Р-лактамов почти полностью решало проблему стафилококковых инфекций, связанных с хирургическим вмешательством. Однако у стафилококков достаточно быстро появилась устойчивость к пенициллину за счет приобретения плазмидной Р-лактамазы.
В 1960-х гг. вскоре после внедрения в практику пенициллин-азостабильных Р-лактамов (метициллин) были описаны первые S. aureus, устойчивые к этим антибиотикам (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) [6]. Достаточно быстро было установлено, что устойчивость к метициллину является маркером устойчивости ко всем Р-лактамам, известным в то время. Впервые появившись в Англии, MRSA теперь циркулируют на всей планете [1].
Способность MRSA вызывать широкий спектр заболеваний человека основана на сочетании факторов хозяина и факторов бактериальной вирулентности [9]. Существует несколько факторов риска, которые повышают риск заражения MRSA у пациентов, включая возраст, длительность госпитализации, начальное лечение антибиотиками, тяжелое основное заболевание, хирургическое вмешательство и ослабленный иммунитет хозяина [3, 9].
В этой работе было проведено исследование внутри больничной инфекции (ВБИ) на тест S. aureus у 85 пациентов - микробиологическим и молекулярно биологическими методами, среди которых было выявлено 42 пациента с диагнозом - инфицированные c S. aureus.
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" _25-26 SEPTEMBER, 2024_
Микробиологическим методом, на чашках-Петри представлены результаты в выявлении S. aureus на кровяном агаре, где явно показан рост колоний и гемолиз этой бактерии (рис-1). Далее по общей приятой микробиологическим и биохимическими методами, эти же изоляты были тестированы на плазмокоагулазу, маннит и ДНКазу -второй стандартный или таргетный тест на идентификацию S. aureus. Как показано на рис-1 (справа в пробирках), исследуемые эти же изоляты были идентифицированы как Staphylococcus aureus.
Рис-1. Выявление и определение S. aureus микробиологическим и биохимическими методами
Таким образом, полученные наши результаты микробиологического и биохимического эксперимента на идентификацию ВБИ местных штаммов у пациентов на S. aureus согласуются с результатами других авторов [7-9].
Детекция S. aureus с фенотипом MRSA методом РТ-ПЦР
В наших исследованиях, после идентификации микробиологическими и биохимическими методами, 42 изолята были идентифицированные как S. aureus (рис-1). В целях этой работы, эти же исследуемые изоляты S. aureus были тестированы на фенотип MRSA методом ПЦР (рис-2).
Полученные результаты после ПЦР были статически анализированы и выявлены изоляты с фенотипом MRSA. Среди 42 изолятов S. aureus 23 изолята были идентифицированы с фенотипом MRSA.
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" 25-26 SEPTEMBER, 2024
• в â
m -э® Ф» ™ 1SM Щ
Рис-2. РТ-ПЦР, идентификация изолятов S. aureus на фенотип MRSA
Выводы. Бактериальным, микробиологическим, биохимическим и молекулярно биологическим методами ПЦР, среди 42 штаммов S. aureus, выявлены 23 изолята MRSA. В резистентных штаммах S. aureus к метициллину, показано участие гена mecA в формировании штаммов с фенотипом MRSA.
Заключение. До сих пор MRSA по количеству летальных исходов и экономических затрат на лечение входит в одну тройку с такими инфекционными заболеваниями человека, как туберкулез и СПИД. Однако понимание механизмов распространения и соблюдения крайне жестких превентивных мер (по принципу «search and destroy» - «найти и уничтожить») по сдерживанию MRSA привели к значительному снижению уровня этой инфекции в Европе и США. Такой опыт, безусловно, необходимо внедрять и в нашей стране.
Если в первой половине 2000-х гг. практически не было препаратов (кроме, ванкомицина) для лечения MRSA, то в настоящее время существует много альтернатив, и при условии проведения рациональной антимикробной химиотерапии можно добиться высокой эффективности лечения и свести проблему MRSA к минимуму. Более того, уже не одно десятилетие ведутся разработки по созданию стафилококковой вакцины на основе ДНК и РНК аптамеров внедрение которой, возможно, способствовало бы снижению риска развития внутрибольничных MRSA-инфекций.
Список используемой литературы:
1. Гостев В.В., Сидоренко С.В. Метициллинрезистентные золотистые стафилококки: проблема распространения в мире и России. Ж. Фарматека. 2015, №6. С. 2-12. https://elibrary.ru/title_about.asp?id=9504.
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS"
_25-26 SEPTEMBER, 2024_
2. Abdurrahman G, Schmiedeke F, Bachert C, Bröker BM, Holtfreter S. Allergy-a new role for T cell superantigens of Staphylococcus aureus? Toxins. 2020;12(3):176.
3. Baranovich T., Potapov V., Yamamoto T. The first isolation of Panton-Valentine leukocidin (PVL) positive community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus (CA-MRSA) in Russia. Euro Surveill. 2007;12(3):E0703154.
4. EARS-Net database. http://ecdc.europa.eu/en/activities/surveillance/EARS-Net/database/Pages/database.aspx.
5. Garbacz K, Wierzbowska M, Kwapisz E, Kosecka-Strojek M, Bronk M, Saki M, et al. Distribution and antibiotic-resistance of different Staphylococcus species identified by matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) isolated from the oral cavity. J Oral Microbiol. 2021;13(1):1983322.
6. Jevons M. Celbenin - resistant Staphylococci. Br. Med. J. 1961;5219(1):124-25.
7. Li Z, Zhuang H, Wang G, Wang H, Dong Y. Prevalence, predictors, and mortality of bloodstream infections due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus in patients with malignancy: systemic review and meta-analysis. BMC Infect Dis. 2021;21:74.9.
8. Montazeri E. A., Khosravi A. D., Khazaei S., Sabbagh A. Prevalence of methicillin resistance and superantigenic toxins in Staphylococcus aureus strains isolated from patients with cancer. BMC Microbiology volume21, Article number: 262 (2021): 3-9.
9. Rashidi Nezhad R, Meybodi SM, Rezaee R, Goudarzi M, Fazeli M. Molecular characterization and resistance profile of methicillin resistant Staphylococcus aureus strains isolated from hospitalized patients in intensive care unit, Tehran-Iran. Jundishapur J Microbiol. 2017;10(3):e41666.
10. Schaumburg, F., Alabi A.S., Peters G., Becker K. New epidemiology of Staphylococcus aureus infection in Africa. Clin. Microbiol. Infect. 2014;20(7):589-96.
11. Tille P. Bailey & Scott's diagnostic microbiology-E-book. St. Louis: Elsevier Health Sciences; 2015. p. 307-27
12. Turner NA, Sharma-Kuinkel BK, Maskarinec SA, Eichenberger EM, Shah PP, Carugati M, et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: an overview of basic and clinical research. Nat Rev Microbiol. 2019;17(4):203-18
