CC BY
7щиты от инфекционных болезней, при проведении XXII Олимпийских зимних игр и XI Паралимпийских зимних игр 2014 в Сочи. Журн. микробиол. 2015,1:109-114.
6. Онищенко Г.Г., Сандахчиев JI.C, Нетесов C.B., Мартынюк P.A. Биотерроризм: национальная и глобальная угроза. Вестник Российской академии наук. 2003, 73 (3): 195204.
7. ОнищенкоГ.Г., Смоленский В.Ю., ЕжловаЕ.Б., Демина Ю.В.,ТопорковВ.П., Топорков A.B., Ляпин М.Н., Кутырев В.В. Актуальные проблемы биологической безопасности в современных условиях. Часть 2. Понятийная, терминологическая и определительная база биологической безопасности. Вестник Российской академии медицинских наук. 2013,11:4-11.
8. Онищенко Г.Г., Шапошников A.A., Субботин В.Г., Простакишин Г.П., Аветисов Г.М. Обеспечение биологической, химической и радиационной безопасности при террористических актах. Под ред. Г.Г. Онищенко. М., 2005.
9. ПоповаА.Ю.,ДеминаЮ.В., ЕжловаЕ.Б., КуличенкоА.Н., РязановаА.Г.,МалеевВ.В., Плоскирева A.A., Дятлов И.А., Тимофеев B.C., НечепуренкоЛ.А., Харьков В.В. Вспышка сибирской язвы в Ямало-Ненецком автономном округе в 2016 году, эпидемиологические особенности. Проблемы особо опасных инфекций. 2016,4:42-46.
10. Попова А.Ю., Сафронов В.А., Boira M.Y., Куклев Е.В., Кедрова О.В., Удовиченко С.К., Лопатин A.A., Раздорский A.C., Ежлова Е.Б., Смоленский В.Ю., Кутырев В.В. Эпидемиологические особенности болезни, вызванной вирусом Эбола, в странах Западной Африки в 2013-2015 гг. Проблемы особо опасных инфекций. 2015, 3:42-48.
Поступила 10.06.17
Контактная информация: Ефременко Дмитрий Витальевич, к.м.н.,
355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15, р.т. (8652)26-03-12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
М.П.Червакова, Т.Н.Шаров, И.А.Баркова, А.М.Барков, Д.В.Викторов, А.В.Топорков
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ИММУНОГЕННЫХ БЕЛКОВ ШТАММОВ BACILLUS ANTHRACIS В MALDITOF MS
Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт
Цель. Идентификация иммуногенных белков штаммов Bacillus anthracis, продуцируемых в условиях, имитирующих организм хозяина. Материалы и методы. В работе использованы культуральные фильтраты изогенных вариантов штамма B.anthracis 575/122: R02 (pXOl- рХ02+); ROI (рХ01+ рХ02); ROO (pXOl" рХ02 ), полученные в условиях, имитирующих организм хозяина. В одномерном электрофорезе и иммуноблотганге с гипериммунными сыворотками определены иммунодоминантные белки, которые идентифицированы в MALDI TOF MS. Результаты. В иммуноблотинге выявлены белки м.м. 97 —14,1 кДа. Белок 90 кДа штамма B.anthracis 575/122 R01 в MALDI TOF MS идентифицирован как протективный антиген м.м. 85,810 кДа, белок м.м. 60 — как GMP синтаза м.м. 57,239 кДа. В культуральных фильтратах трех штаммов определено два общих антигена: белок с м.м. 97 кДа, идентифицированный как ЕА 1 В. anthracis м.м. 91,361 кДа и белок м.м. 45 кДа — как энолаза В. anthracis м.м. 46,418 кДа. Заключение. Таким образом, условия, имитирующие организм хозяина, способствуют продукции иммунодоминантных белков В. anthracis. В MALDI TOF MS подтверждены данные по молекулярно-весовой характеристике протективного антигена и белка ЕА1, а также ряда протеаз В. anthracis. Результаты могут быть использованы при выделении этих белков с целью усовершенствования диагностических и вакцинных препаратов.
Журн. микробиол., 2018, № 1, С. 52—57
Ключевые слова: Bacillus anthracis, иммунодоминантные белки, одномерный электрофорез, иммуноблотгинг, MALDI TOF MS
M.P.Chervakova, T.N.Sharov, I.A.Barkova, A.M.Barkov, D.V.Viktorov, A.V.Toporkov
IDENTIFICATION OF IMMUNOGENIC PROTEINS OF STRAINS OF BACILLUS ANTHRACIS IN MALDITOF MS
Volgograd State Research Institute for Plague Control, Russia
Aim. Identification of obtained in host-simulated conditions immunogenic proteins of isogenic variants of Bacillus anthracis 575/122. Materials and methods. We used culture filtrate of isogenic variants of B. anthracis 575/122: R02 (pXOl" pX02+); R01 (pX01+ pX02"); R00 (pXOl" pX02 ), obtained in host-simulated conditions. In the one-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting with hyperimmune serums immunodominant proteins, that have been identified in MALDI TOF MS. Results. Immunoblotting revealed proteins with molecular masses in range 97 — 14.1 kDa. 90 kDa protein from strain B. anthracis 575/122 R01 in MALDI TOF MS was identified as protective antigen with 85.810 kDa. Protein with molecular mass 60 kDa was identified as GMP synthase with molecular mass 57.239 kDa. In the culture filtrates of three strains two common antigen were identified: protein with molecular mass 97 kDa, identified as B. anthracis EA 1 with molecular mass 91.361 kDa protein and 45 kDa protein as enolase B. anthracis with molecular mass 46.418 kDa. Conclusion. Thus, the conditions that simulate the host can promote the production of immunodominant proteins of B. anthracis. The data about molecular-weight characteristics of protective antigen and EA 1 protein as well as some of proteases of B. anthracis are confirmed by the MALDI TOF MS. The results can be used for isolation of these proteins to improve the diagnostic and vaccine preparations.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2018, No. 1, P. 52-57
Key words: Bacillus anthracis, immunodominant proteins, dimensional electrophoresis, immunoblotting, MALDI TOF MS
ВВЕДЕНИЕ
Bacillus anthracis — грамположительная спорообразующая бактерия. Капсула и экзотоксин являются основными факторами вирулентности, которые детерминируются плазмидами токсинообразования (pXOl) и капсулоо-бразования (рХ02). Продукция токсинов и капсулы возможна in vitro, когда микроорганизм выращивают в анаэробных условиях при температуре 37°С в минимальной безбелковой питательной среде с бикарбонатом. Считается, что таким образом создаются условия, подобные встречающимся в организме хозяина (in vivo) [15].
В настоящее время изучаются нативные белки В. anthracis, секретируемые во внеклеточную среду (секретомы), которые участвуют во взаимодействии хозяин — патоген, что делает их потенциальными мишенями для иммуноде-текции и иммунопрофилактики [7, 8, 10 — 12].
Цель исследования — идентификация иммуногенных белков штаммов В. anthracis, продуцируемых в условиях, имитирующих организм хозяина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы изогенные варианты вирулентного штамма В. anthracis 575/122, отличающиеся по набору плазмид вирулентности: ток-синпродуцирующий В. anthracis 575/122 ROI (рХ01+ рХ02"); капсулосодержа-щий В. anthracis 575/122 R02 (pXOl" рХ02+); бесплазмидный В. anthracis 575/122 R00 (pXOl" рХ02) [1].
Штаммы засевали на сердечно-мозговой агар, инкубировали втечение ночи (16 часов) при 37°С. Единичные колонии суспендировали в 2 мл R среды
[ 13] и 1 мл полученной суспензии засевали в 100 мл R среды с 0,25% (вес/объем) глюкозы, инкубировали при 37°С в течение 4 часов со встряхиванием при 120 оборотах в минуту. Затем по 10 мл бактериальных взвесей переносили в колбы объемом 500 мл, содержащие 100 мл R среды с 0,25% глюкозы и 0,85% бикрбоната натрия (вес/объем). Три колбы помещали в условия, моделирующие организм хозяина (анаэробные), в СО2 инкубатор, при 37°С с 5% СО2. КФ выращивали 18 часов, стерилизовали через фильтр с диаметром пор 0,20 мкм, концентрировали в 10 раз на ультрафильтре РМ10 «Amicon».
Осаждение белков бесклеточных культуральных фильтратов (КФ), одномерный электрофорез и иммуноблоттинг проводили по методике, описанной ранее [1, 2]. Белковые фракции из полиакриламидных гелей вырезали, промывали и обрабатывали тоипсином в соответствии с протоколом A. Shevchenko et al. [14]. Пептиды после трипсинолиза идентифицировали в MALDI-TOF MS, в качестве матрицы использовали раствор альфа-циано-4-гидрок-сикоричной кислоты (10 мг/мл) в 0,1% трифторуксусной кислоты и 50% аце-тонитрила. Масс-спектры получали с использованием масс-спектрометра Axima Performance™ (Shimadzu) в режиме «Linear Mode» и анализировали с использованием the Mascot Daemon software package (Matrix Science, Boston, MA). Параметры поиска были: число пропущенных сайтов гидролиза не более одного, точность определения массы ±0,5 Da.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Проведен элекгрофоретический анализ белков КФ трех генотипов штамма В. anthracis 575/122 (рис.). Наибольшее количество интенсивно окрашенных полос определялось у штамма В. anthracis 575/122 R01. Все штаммы про-
97,4
тшш.у 9 66,2 4
5
6
39,2
26,6
М R02 RQ1ROO
т
ЯП
JB
R02 R01 ROO
R02 R01 ROO
А Б В
Иммунодоминантные белки КФ изогенных вариантов В. anthracis 575/122, выращенных в условиях, моделирующих организм хозяина.
А — электрофорез; Б — иммуноблотинг с гипериммунной кроличьей сывороткой; В — иммуноблоттинг с сывороткой зараженной морской свинки. М — маркеры м.м.; R02 — КФ В.anthracis 575/122 R02; R01 - КФ B.anthracis 575/122 ROI; ROO - КФ B.anthracis 575/122 ROO.
Иммунодоминантные белки культуральных фильтратов изогенных вариантов штамма В. anthracis 575/122, идентифицированные в MALDITOF MS
Белок м.м.(кДа)*
В. anthracis 575/122R01
В. anthracis 575/122 R02
В. anthracis 575/122R00
97 Белок ЕА191,361 кДа Белок ЕА191,361 кДа Белок ЕА191,361 кДа
90 Протективный антиген Отсутствовал** Отсутствовал
85,810 кДа
87 Отсутствовал Не идентифицирован Не идентифицирован
60 GMP синтаза 57,239 кДа Отсутствовал Отсутствовал
45 Энолаза 46,418 кДа Энолаза 46,418 кДа Энолаза 46,418 кДа
40 Ацетил гамма глутамил фосфат редуктаза Отсутствовал Отсутствовал
Bacillus amyloliquefaciens 37, 925 кДа
Примечание.* Мм определена по элекгрофоретической подвижности, ** на электрофореграмме не окрашивался.
дуцировали белок 97 кДа. Белок с м.м. 87 кДа не визуализировался в КФ В. anthracis 575/122 ROI. В КФ В. anthracis 575/122 R02 выявлялись электрофо-ретические фракции, сходные с фракциями КФ В. anthracis 575/122 ROI, за исключением ПА, но они были слабо окрашены. Следует отметить, что КФ содержали компоненты, которые не окрашивались Кумасси, но реагировали с гипериммунными сыворотками (кроличьей и морской свинки), что может свидетельствовать об их небелковой природе либо незначительном содержании. В связи с чем, для MALDI TOF MS использованы иммунодоминантные белки, которые выявлялись антисыворотками и окрашивались Кумасси — белки м.м.: 97, 90, 60, 45, 40 кДа токсинпродуцирующего штамма В. anthracis 575/122 R01, 97, 87 и 45 кДа бесплазмидного В. anthracis 575/122 R00 и капсу-лосодержащего В. anthracis 575/122 R02 штаммов.
Белковые полосы, окрашенные Кумасси, вырезали из полиакриламидно-го геля, промывали и обрабатывали трипсином в соответствии с методикой [14]. Протеины идентифицировали в MALDI TOF MS с помощью программного обеспечения MASCOT, сравнивая полученные масс-спектры с референтными значениями базы данных SWISS-PROT. Результаты проведенной идентификации представлены в табл.
ОБСУЖДЕНИЕ
Наряду с известными факторами вирулентности В. anthracis (например, ПА, ОФ, ЛФ) определен ряд антигенов, которые могут стать основой для диагностических тест-систем и вакцин [8,11,12]. Рекомбинантные белки обладают недостаточной иммуногенностью, в том числе, вследствие отсутствия у них патоген-ассоциированных молекулярных структур микроорганизмов, взаимодействующих с рецепторами врожденного иммунитета [4]. В связи с чем, представлялось целесообразным изучение нативных белков, накапливаемых in vitro, с последующей идентификацией иммунодоминантных антигенов, экспрессируемых in vivo [7,15].
В настоящем исследовании одномерный электрофорез в полиакриламид-ном геле с додецилсульфатом натрия, иммуноблотгинг и MALDI TOF MS использовали для выявления и идентификации иммунодоминантных антигенов КФ изогенных вариантов штамма В. anthracis 575/122. Одномерный электрофорез был выбран нами из-за возможности последующего препаративного накопления белков.
Штаммы трех генотипов В. anthracis 575/122 выращивали в условиях, мо-
делирующих среду хозяина, что подразумевает инкубацию в жидкой R-среде при 37°С и 5% С02 [7, 13,15]. Электрофоретическая картина при разделении белков КФ штаммов В. anthracis 575/122 ROO и ROI не отличалась от картины, описанной ранее [1,2]. Мажорными белками капсулосодержащего штамма В. anthracis 575/122 R02 были белки с м.м. 97 и 87 кДа. При этом другие электро-форетические фракции R02 штамма совпадали со штаммом R01, но очень слабо окрашивались, несмотря на увеличение белковой нагрузки при нанесении на гель. Это можно объяснить влиянием продуктов транскрипции генов асрА и atxA на экспрессию генов В. anthracis. Ген atxA, расположенный на плазмиде pXOl, контролирует экспрессию путем активации или подавления более сотни генов, отвечающих за вирулентность, расположенных на обеих плазмидах и хромосоме. Механизм взаимного регулирования генов асрА и atxAflO конца не изучен [9].
Иммуноблоттинг с белками КФ штаммов, выращенных в анаэробных условиях, проводили с гипериммунными сыворотками кролика и морской свинки. Таким образом, выявляли иммунодоминантные антигены, экспрес-сируемые in vivo, которые накапливали in vitro в условиях, моделирующих организм хозяина [7, 15]. Иммунные сыворотки реагировали с белками м.м. 97,90,60,45,40 кДатоксинпродуцирующего штамма (В. anthracis 575/122 ROI) 97, 87 и 45 кДа бесплазмидного (В. anthracis 575/122 ROO) и капсулосодержащего (В. anthracis 575/122 R02) штаммов.
Иммунодоминантные белки, окрашенные Кумасси, идентифицировали в MALDI TOF MS, для интерпретации масс-спектрометрических данных использовали базу данных SWISS-PROT, которая на сегодняшний момент является одной из самых надежных. Данные о каждом белке, внесенном в эту базу, тщательно верифицированы и включают в себя такую информацию, как вариации структуры, функции белка, ссылки на публикации и многое другое [3]. Белок токсинпродуцирующего штамма 90 кДа был определен, как ПА м.м. 85,810 кДа. По литературным данным ПА имеет молекулярную массу 82,684 кДа, летальный фактор (ЛФ) — 90,337 кДа, отечный фактор (ОФ) — 88,808 кДа [6]. В проведенном исследовании белки, соответствующие ЛФ и ОФ, определены не были. Поданным Lamonica J.M. et al. (2007), при проведении протеомного анализа ПА, ОФ и ЛФ были выявлены в КФ вирулентного штамма RA3 (рХ01+, рХ02+). Однако в токсинпродуцирующем штамме RA3R (рХ01+) ОФ и ЛФ не идентифицированы, а ПА был определен в значительно более низком количестве. Авторы связывают это с подавлением транскрипции генов pXOl, в связи с потерей плазмиды рХ02. Влияние асрВ, гена регулятора рХ02, на гены pXOl не изучалось [10].
В нашем исследовании белки м.м. 87 кДа КФ штаммов В. anthracis 575/122 R02 и В. anthracis 575/122 R00 при помощи MALDI TOF MS идентифицировать не удалось, но их м.м. совпадает с м.м. белка Sap В. anthracis (86,7 кДа) [10].
Белки м.м. 60 кДа и 40 кДа токсинпродуцирующего штамма были идентифицированы, как GMP синтаза В. anthracis м.м. 57,239 кДа и ацетил гамма глутамил фосфат редуктаза В. amyloliquefaciens м.м. 37, 925 кДа.
При одномерном разделении белков КФ трех вариантов штамма В. anthracis 575/122 определено два общих антигена: белок с м.м. 97 кДа, идентифицированный как ЕА 1 В. anthracis (м.м. 91,361 кДа), белок м.м. 45 кДа, идентифицированный как энолаза В. anthracis (м.м. 46,418 кДа).
Энолаза B.anthracis является иммунодоминантным антигеном и фактором вирулентности, позволяет бактериям приобретать поверхностно-связанную
протеолитическую активность путем связывания плазминогена в организме инфицированного хозяина [5, 7, 15].
Иммунодиагностические свойства ПА и белка ЕА 1, выделенных препаративным электрофорезом, были изучены нами в предыдущих исследованиях [2]. Белок м.м. 46,418 кДа накоплен в препаративном электрофорезе, его свойства не изучались.
Таким образом, в MALDITOF MS идентифицированы иммунодоминант-ные антигены изогенных вариантов В. anthracis 575/122. Данные белки В. anthracis продуцируются in vivo, могут быть накоплены в препаративном электрофорезе (in vitro) и использованы для усовершенствования диагностических и вакцинных препаратов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Барков A.M., Новоженина А.В., Порохня С.В., Ткаченко Г.А., Липницкий А.В. Характеристика изогенных вариантов Bacillus anthracis с различным содержанием плазмид вирулентности. Журн. микробиол. 2015, 1:17-22.
2. Баркова И.А., Червакова М.П., Барков A.M., Новоженина А.В., Викторов Д.В. Диагностическое значение некоторых иммунодоминантных белков изогенных вариантов Bacillus anthracis. Клиническая лабораторная диагностика. 2016, 61 (12): 833838.
3. Краснов Н.В., Лютвинский Я.И., Подольская Е.П. Масс-спектрометрия с мягкими методами ионизации в протеомном анализе. Научное приборостроение. 2010, 20 (4): 5-20.
4. Семенов Б.Ф., Зверев В.В., Хаитов P.M. Прогноз развития вакцинопрофилактики в первые десятилетия XXI века. Иммунология. 2009,6: 324-335.
5. Agarwal S., Kulshreshtha P., Bambah Mukku D. et al. Alpha-Enolase binds to human plasminogen on the surface of Bacillus anthracis. Biochim. Biophys. Acta. 2008,1784 (7-8): 986994.
6. Boyer A. E., Gallegos-Candela M., Lins R.C. et al. Quantitative mass spectrometry for bacterial protein toxins — a sensitive, specific, high-throughput tool for detection and diagnosis. Molecules. 2011, 16: 2391-2413.
7. Chitlaru T., Gat O., Grosfeld H. et al. Identification of in vivo-expressed immunogenic proteins by serological proteome analysis of the bacillus anthracis secretóme. Infect. Immun. 2007,75: 2841-2852.
8. Chitlaru Т., Zaide G., Ehrlich S. et al. HtrA is a major virulence determinant of Bacillus anthracis. Molecular Microbiology. 2011, 81 (6): 1542-1559.
9. Fouet A. AtxA, a Bacillus anthracis global virulence regulator. Res. Microbiol. 2010, 161: 735-742.
10. LamonicaJ.M., Wagner M., EschenbrennerM. etal. Comparative secretóme analyses of three Bacillus anthracis strains with variant plasmid contents. Infect. Immun. 2005, 73: 36463658.
11. Liu X., Wang D., Ren J. et al. Identification of the immunogenic spore and vegetative proteins of Bacillus anthracis vaccine strain A16R. PLoS ONE. 2013, 8 (3): e57959.
12. Pflughoeft K. J., Swick M.C., Engler D. A. et al. Modulation of the Bacillus anthracis secretóme by the immune inhibitor Al protease. J. Bacteriol. 2014,196 (2): 424-435.
13. Ristroph J.D., Ivins B.E. Elaboration of Bacillus anthracis antigens in a new, defined culture medium. Infect. Immun. 1983, 39:483-486.
14. Shevchenko A., Tomas H., Havlis J. et al. In-gel digestion for mass spectrometry characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 2006, 1 (6): 2856-2860.
15. Walz A., Mujer С., Connolly J. et al. Bacillus anthracis secretóme time course under host-simulated conditions and identification of immunogenic proteins. Proteome Science. 2007,5: 11.
Поступила 20.07.17
Контактная информация: Червакова Маргарита Павловна, 400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7, р.т. (8442)37-37-74
