CC BY
66
conjugative crossing on the basis of V. cholerae avirulent strain 170 Hly‘ eluded into diagnostic test systems designed to detect toxigenic V. cholerae
serogroup 0139. V. cholerae 170 Hly' (рГЕМЗ) strain thus obtained, can be strains among various serogroups.
used as a carrier for other genes coding for protective antigens, and as a
producing strain that is capable of synthesizing cholera toxin В subunit in- Поступила 16.02.04
УДК 616.981.51
А.Ю.Корсакова, Н.И.Микшис, Ю.А.Попов, Н.П.Коннов, М.Н.Киреев, Н.А.Подборонова, Т.А.Полунина, О.В.Новикова, О.М.Кудрявцева
ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ Б-СЛОЯ СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Осуществлено выделение белков с молекулярной массой 94 кДа из культуральных фильтратов и клеточных стенок бесплазмидных штаммов возбудителя сибирской язвы. Проведена идентификация выделенных белков биохимическими и электронно-микроскопическими методами. Установлено, что выделенные белки являются
компонентами S-слоя Bacillus anthracis.
Введение
Bacillus anthracis - возбудитель острой зооан-тропонозной инфекции, представляет собой грампо-зитивные спорообразующие бактерии, синтезирующие токсин и капсулу. Помимо капсулы, вегетативные клетки сибиреязвенного микроба окружены S-слоем. Наличие S-слоя характерно для многих представителей бактериальных видов. Его функции состоят в сохранении формы клеток, защите от агрессивных факторов среды, участии в молекулярной адгезии и фильтрации, во взаимодёйствии с клетками про- и эукариот [5, 11, 12].
S-слой возбудителя сибирской язвы составляет почти 10 % от всей массы клеточного белка и представлен двумя белками, обозначенными Sap и ЕА1 [6, 9]. Белки S-слоя В. anthracis имеют одинаковую молекулярную массу - 94 кДа. Их синтез детерминирован хромосомными генами sap и eag, идентифицированными Etienne-Toumelin I. et al. в 1995 г. [6]. Установлено, что белки Sap и ЕА1 последовательно присутствуют на клеточной поверхности. На начальных стадиях роста синтезируется Sap, затем в течение стационарной фазы роста сибиреязвенного микроба происходит замещение Sap на ЕА1 и выделение Sap в супернатант [6, 10, 11]. По данным ряда авторов, антигены S-слоя В. anthracis обладают им-муногенными свойствами и, следовательно, могут быть использованы в создании сибиреязвенных вакцин [4, 7, 11].
Задачей настоящего исследования было получение в препаративных количествах очищенных белков S-слоя В. anthracis с целью дальнейшего их использования в конструировании диагностических и профилактических препаратов.
Материалы и методы
Штаммы. В работе использованы бесплазмид-ный производный вакцинного штамма В. anthracis Sterne 34F2 - В. anthracis Sterne 34F2AT (рХОГ рХ02~) и его протеазонегативный дериват - В. anthracis Sterne 34F2AT РгГ (Государственная коллекция
патогенных бактерий «Микроб», Саратов).
Питательные среды. В качестве питательных сред использовали L-агар («Difco», США) и среду, предложенную J.Farchaus et al. [8] для выращивания культур при выделении белков S-слоя (S-бульон).
Лабораторные животные. В работе использовали кроликов весом около 2 кг.
Выделение и очистка белка Sap. Выделение и очистку белка Sap проводили согласно процедуре, описанной J.Farchaus et al. [8].
Выделение и очистка белка ЕА1. Штамм В. anthracis Sterne 34F2AT РгГ выращивали в S-бульоне 16 ч с аэрацией при 37 °С. Затем бульонную культуру центрифугировали в течение 30 минут при 10000 об/мин и температуре 4 °С, отбирали супернатанты, а осадки обрабатывали по методу, предложенному J.Ezzel, T.Abshire [7]. Супернатант, содержащий экстрагированный белок, фильтровали через мембранные фильтры (Millipore, 0,22 мкм) и подвергали процедуре осаждения и очистки по М.В.Безносову [1] с собственными модификациями. Экстракт диализовали при 4 °С в течение суток с периодической сменой буферного раствора, содержащего 0,1 М Трис-гидрохлорида и ингибиторы протеаз (pH 8,0). Затем белки сорбировали на гид-роксиапатите (Bio-Rad) в течение 1 ч при 4 °С. Элюцию очищенного белка ЕА1 проводили градиентом концентрации фосфата фосфатного буфера. На последнем этапе препарат диализовали против бидистиллированной воды в течение ночи при 4 °С.
Электрофорез выделенных белков проводили в течение 5 ч в 10 % полиакриламидном геле.
Негативное контрастирование препаратов белков S-слоя для электронной микроскопии. Перед электронной микроскопией дополнительно проводили диализ очищенных препаратов белков Sap и ЕА1 против 10 мМ фосфатного буфера (pH 8,0) - в течение ночи при 4 °С, а затем против 5 мМ ацетата натрия (pH 5) в течение ночи при 4 °С. Очищенный диализом препарат центрифугировали, осадок ре-суспендировали в первом диализном буфере, и разводили 1:10 тем же буфером. Подготовленный таким образом препарат наносили на сетку с углерод-
ной подложкой и высушивали на воздухе. Окрашивали 2 % раствором уранилацетата в течение 1,5-2 мин. Препараты просматривали на электронном микроскопе Hitachi HU-12A (Япония).
Получение специфических антител к Sap и ЕА1 по J.Farchaus et al. [8] с собственными модификациями. Очищенный препарат белка Sap в количестве 100 мкг на одну инъекцию смешивали с равным объемом буфера, содержащего 4 % SDS, 12 % глицерин, 2 % меркаптоэтанол, 0,01 % бромфеноловый синий, 50 мМ Na2C03, и прогревали при 95 °С в течение 10 мин. Очищенный препарат ЕА1 разводили
4 % раствором SDS и прогревали при 95 °С в течение 10 мин. Непосредственно перед иммунизацией препарат белка (Sap или ЕА1) соединяли с равными объемами полного адъюванта Фрейнда и вводили кролику в/м по 0,5 мл в обе лапки и 0,2 мл п/к в спинку 3-кратно с интервалами 4 нед. и 5 сут. Через
5 сут после 3-й иммунизации делали забор крови и выделяли специфические антитела к Sap или ЕА1.
Иммуноэлектронная микроскопия со специфическими антителами, меченнъши коллоидным золотом. Мечение антител коллоидным золотом проводили по методике Л.Дыкмана [2]. Подготовка препаратов для иммуноэлектронной микроскопии осуществляли согласно процедуре, описанной у J.Farchaus et al. [8] с собственными модификациями. Культуру сибиреязвенного штамма подращивали 18 ч в S-бульоне с аэрацией при 37 °С. Бактериальную взвесь центрифугировали, осадок ресуспенди-ровали в фиксаторе, содержащем 4 % параформальдегид и 0,5 % глютаральдегид, выдерживали 1,5 ч при 4 °С. Затем клетки отмывали 5 мМ фосфатным буфером (pH 6,8) и ресуспендировали в нем же до концентрации 3-109мк/мл. На сетку с углеродной подложкой наносили висячую каплю подготовленного препарата и выдерживали 1,5 мин, затем инкубировали при комнатной температуре последовательно со следующими растворами: для неспецифической сорбции, содержащим 0,1 % бычий сывороточный альбумин, - 15 мин; для специфической сорбции - кроличьи антитела к Sap/EAl - 50 мин, 5 мМ фосфатный буфер (pH 6,8) - три раза по 5 мин; для специфической иммуносорбции - кроличьи антитела к Sap/EAl, меченные коллоидным золотом, -45 мин, 5 мМ фосфатный буфер (pH 6,8) - три раза по 5 мин; 1 % водный раствор OSO4- 1,5 мин. Окрашивали 1,5 % раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) или 2 % раствором уранилацетата в течение 1,5-2 мин. Препараты просматривали на электронных микроскопах JEM-7A и Hitachi HU-12А (Япония).
Определение аминокислотного состава белков осуществляли по методике S.Moore, W.Stein [3] на базе Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов АН России (Саратов).
Результаты и обсуждение
Учитывая данные о возможной деградации белков S-слоя под влиянием собственных протеоли-тических ферментов [8], для их выделения в препаративных количествах мы использовали стабильный протеазонегативный (РгГ) спонтанный мутант бес-
плазмидного производного вакцинного штамма В. anthracis Sterne 34F2. Штамм получен ранее в результате температурной элиминации pXOl и спонтанной мутации, приводящей к значительному снижению протеолитической активности.
Культуру В. anthracis Sterne 34F2AT РгГ выращивали в S-бульоне 16 ч с аэрацией при 37 °С. Затем бактериальную взвесь центрифугировали, супернатант порционно подвергали многоступенчатой процедуре осаждения и очистки. В результате получено несколько серий препарата с общим содержанием белка - 200 мг. После последнего этапа очистки осуществляли электрофорез в акриламидном геле. Электрофоретическая подвижность очищенных препаратов из супернатанта штамма В. anthracis Sterne 34F2AT РгГ соответствовала молекулярной массе 94 кДа. Прочно связанный с клеточной стенкой бактерий белок ЕА1 [7] извлекали экстракцией SDS-буфером. В результате получено 90 мг очищенного препарата белка. Электрофорез в полиакриламидном геле показал, что молекулярная масса экстрагированного белка составляла 94 кДа.
С целью идентификации выделенных белков в качестве компонентов, принадлежащих к S-слою сибиреязвенного микроба, проводили электронномикроскопическое исследование белковой структуры. Для этого очищенные препараты белков Sap и ЕА1 дополнительно дважды диализовали и затем осуществляли негативное контрастирование. В результате электронной микроскопии удалось выявить характерное для S-слоя регулярное строение белка - паракристаллическую решетку (рис. 1). На представленном рисунке отчетливо заметно упоря-
n'\\“ 1' .■' п- . - , \
1-. w Л *б «} 1 ^
к1; 'jr.) Л -д,CV' V. ’ ' ■’=*:»«і
Рис. 1. Электронно-микроскопическая картина структуры белка S-слоя
доченное расположение цилиндрических пор. Их диаметр равен 7-10 нм. Такие же структуры описаны авторами, ранее проводившими исследование S-слоя В. anthracis [5, 6, 7, 9, 10].
Дополнительным методом идентификации белков является определение соотношения составляющих их аминокислот. Для белков S-слоя различных микроорганизмов выявлены определенные особенности аминокислотного состава. Они содержат значительное количество неполярных аминокислот -40-60 %; примерно в равных соотношениях кислые и основные - по 15 %; и не содержат (или содержат доли процента) метионина и цистеина [6, 9, 11, 12]. Аминокислотный анализ выделенных нами белков показал, что неполярные аминокислоты составляют у Sap - 53,5 и у ЕА1 - 34,1 %. Соотношение кислых и основных для Sap - 16,3 и 20 %, соответственно, а для ЕА1 - 20 и 20,8 %. Метионин и цистеин в обоих белковых препаратах не обнаружены. Следовательно, аминокислотный состав выделенных белков соответствует составу протеинов, образующих S-слои бактериальных клеток.
Локализацию антигенов на поверхности клеток сибиреязвенного микроба определяли с помощью иммуноэлектронной микроскопии с меченными коллоидным золотом антителами к выделенным белкам. Для электронной микроскопии штамм
В. anthracis Sterne АТ выращивали, как описано выше. Предварительно клетки осаждали центрифугированием и интенсивно отмывали фосфатным буфером, после чего проводили связывание неспецифических рецепторов бычьим сывороточным альбумином. Часть специфических рецепторов блокировали антителами к Sap или ЕА1. В результате на
Рис. 2. Результаты иммуноэлектронной микроскопии клеток штамма В. anthracis SterneAT
электронно-микроскопических фотографиях большая часть меченых антител как к Sap, так и к ЕА1 располагалась на клеточной поверхности, отдельные частицы встречались в межклеточном пространстве. Как видно на рис. 2, поверхность клетки штамма В. anthracis SterneAT почти сплошь покрыта непроницаемой для электронов меткой, по периферии отчетливо видны скопления частиц коллоидного золота. По локализации меченых антител можно судить о принадлежности выделенных нами белков к поверхностным клеточным структурам сибиреязвенного микроба.
Таким образом, на основании данных электрофоретического анализа, результатов электронно-микроскопических и иммуномикроскопических исследований, а также изучения аминокислотного состава можно утверждать, что выделенные белки являются компоненами S-слоя В. anthracis - Sap и ЕА1. Белки S-слоя В. anthracis предполагается использовать в дальнейшей работе для конструирования диагностических и профилактических препаратов.
Работа выполнена в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» по теме: «Разработка и совершенствование средств и методов профилактики и лечения опасных и особо опасных заболеваний».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.Безносов М.В. Выделение и изучение специфических антигенов В. anthracis с целью конструирования диагностических и профилактических препаратов: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Саратов, 1997. - 22 с. - 2. Дыкман Л.А. Развитие методологии иммуноанализа почвенных ассоциативных бактерий с использованием препаратов коллоидного золота: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Саратов, 1996. - 24 с. -3. Практическая химия белка / Под ред. А.Дарбре (Пер. с англ.). - М.: Мир, 1989. - 629 с. - 4. Ariel N., Zvi А., Makarova К. et al. // Infect. Immun. - 2003. - Vol. 71. - P. 4563^t579. - 5. Bahl H., Scholz H., Bayan N. et al. IIFEMS Microbiol. Rev. - 1997. - Vol. 20. - P. 47-98. - 6. Etienne-Toumelin I., Sirard J., Duflot E. et al. II J. Bacteriol. -1995.-Vol. 177.-P. 614-620. - 7. Ezzell J., AbshireT.// Infect. Immun. - 1988. - Vol. 56, N 2. - P. 349-356. -8. Farchaus I., Ribot W., Downs M. et al. // J. Bacteriol. -1995. - Vol. 177. - P. 2481-2489. - 9. Mesnage S., Tosi-Couture E., Mock M. et al. // Mol. Microbiol. - 1997. -Vol. 23. - P. 1147-1155. - 10. Mesnage S., Tosi-Couture E., Gounon P. et al. II J. Bacteriol. - 1998. - Vol. 180. - P. 52-58. -11. Mock М., Fouet A. II Microbiol. Rev. - 2001. - Vol. 55. -P. 647-671. - 12. Sleytr U., Messner P. // J. Bacteriol. -1998. - Vol. 170. - P. 2891-2897.
A.Yu.Korsakova, N.F.Mikshis, Yu.A.Popov, N.P.Konnov, M.N.Kireyev, N.A.Podboronova, T.A.Polunina, O.V.Novikova, O.M.Kudryavtseva
Isolation of the S-Layer Proteins of Bacillus anthracis
Russian Anti-Plague Research Institute "Microbe", Saratov
Proteins with molecular weight of 94 kDa isolated from cultural filtrates and cell walls of Bacillus anthracis, the agent of anthrax, were identified using biochemical and electron-microscopic methods to show that these proteins were components of B. anthracis S-layer.
Поступила 17.11.03
