CC BY
22tularensis subspecies holarctica in natural waters. Intern. J. Microbiol. 2011, Article ID 851946, 10 p. doi:10.1155/2011/851946.
12. Christova I., Gladnishka T. Prevalence of infection with Francisella tularensis, Borrelia burg-dorferi sensu lato and Anaplasma phagocytophilum in rodents from an endemic focus of tu-laremia in Bulgaria. Ann. Agric. Environ. Med. 2005, 12 (1): 149-152.
13. Gyuranecz M., Rigo K., Dan A. et.al. Investigation of the ecology of Francisella tularensis during an inter-epizootic period. Vfector-Borne and Zoonotic Diseases. 2011, 11 (8): 10311035.
14. Kaysser P., Seibold E., Mätz-Rensing K. et.al. Re-emergence oftularemia in Germany: Presence of Francisella tularensis in different rodent species in endemic areas. BMC Infectious Diseases. 2008, 8 (157): 1-6.
15. Versage J.L., Severin D.D.M., Chu M.C., Petersen J.M. Development of a multitarget realtime taqman PCR assay for enhanced detection of Francisella tularensis in complex specimens. J. Clin. Microbiology. 2003, 41 (12): 5492-5499.
16. Zhang F., Liu W., Chu M.C. et al. Francisella tularensis in rodents, China. Emerg. Infect. Dis. 2006, 12 (6): 994-996.
Поступила 27.06.14
Контактная информация: Мещерякова Ирина Сергеевна, д.б.н.,
123098, Москва, ул.Гамалеи, 18, р.т. (499)193-63-65
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
И.А.Баркова, А.В.Новоженина, А.М.Барков, С.В.Порохня, Г.А. Ткаченко, А.В.Липницкий
ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОГЕННЫХ ВАРИАНТОВ BACILLUS ANTHRACIS С РАЗЛИЧНЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ПЛАЗМИД ВИРУЛЕНТНОСТИ
Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт
Цель. Получение и характеристика по основным культурально-морфологическим и антигенным свойствам изогенных вариантов штаммов Bacillus anthracis, отличающихся по наличию плазмид вирулентности. Материалы и методы. В работе использованы вирулентные штаммы B.anthracis 81/1, 575/122 и вакцинные — B.anthracis СТИ, 55, Sterne. Изогенные варианты, отличающиеся по наличию плазмид вирулентности, получали путем температурной элиминации плазмид, а также при выращивании сибиреязвенных штаммов на среде с канамицином. Штаммы охарактеризованы по культурально- морфологическим, биохимическим свойствам. Методом полимеразной цепной реакции определено наличие плазмид вирулентности. Антигенные свойства изучены в реакции иммунодиффузии с растущими культурами с сыворотками к протективному антигену и белкам S-слоя, электрофорезе, иммуноблоттинге. Результаты. Из вирулентных штаммов B.anthracis 81/1, 575/122 и вакцинных СТИ, 55, Sterne получены изогенные варианты: моноплазмидные токсинпродуцирующие (81/1 R01, 575/122 R01) и капсулосодержащие (81/1 R02, 575/122 R02), и бестлазмидные (81/1 R00, 575/122 R00, СТИ R00, 55 R00, Sterne R00), отличающиеся по наличию плазмид вирулентности. Штаммы обладали типичными культурально-морфологическими свойствами, отличались по биохимическим и антигенным свойствам. Культуральные фильтраты токсинпродуцирующих штаммов содержали белки сибиреязвенного токсина, безплазмидных штаммов — содержали белки, молекулярные массы которых соответствуют молекулярным массам белков S-слоя ЕА1 и Sap. Заключение. Данные штаммы могут быть использованы для изучения изменчивости и протеомного анализа возбудителя сибирской язвы, а также выделения антигенов с целью оценки их иммунодиагностического значения.
Журн. микробиол., 2015, № 1, С. 17—22
Ключевые слова: Bacillus anthracis, плазмиды вирулентности, изогенные варианты
2. ЖМЭИ 1 № 11 17
I.A.Barkova, A.V.Novozhenina, A.M.Barkov, S. V.Porokhnya, G.A. Tkachenko, A. V.Lipnitsky
CHARACTERISTICS OF ISOGENIC VARIANTS OF BACILLUS ANTHRACIS WITH VARIOUS CONTENT OF VIRULENCE PLASMIDS
Volgograd Research Institute of Plague Control, Russia
Aim. Production and characteristics by main cultural-morphologic and antigenic properties of isogenic variants Bacillus anthracis, that differ by the presence of virulence plasmids. Materials and methods. B. anthracis 81/1, 575/122 virulent and B. anthracis STI, 55, Sterne vaccine strains were used in the study. Isogenic variants, that differ by the presence of virulence plasmids, were obtained by temperature elimination of plasmids, as well as during cultivation of anthrax strains in medium with kanamycin. The strains were characterized by cultural-morphologic, biochemical properties. The presence of virulence plasmids was determined by polymerase chain reaction method. Antigenic properties were studied in immune diffusion reaction with growing cultures with sera against protective antigen and S-layer proteins, electrophoresis, immune blotting. Results. Isogenic variants were produced from virulent strains B. anthracis 81/1, 575/122 and vaccine strains STI, 55, Sterne: mono-plasmid toxin-producing (81/1 R01, 575/122 R01) and capsule-containing (81/1 R02, 575/122 R02), and plasmid-less (81/1 R00, 575/122 R00, STI R00, 55 R00, Sterne R00), that differ by the presence of virulence plasmids. Strains had typical cultural-morphologic properties, differed by biochemical and antigenic properties. Cultural filtrates of toxin-producing strains had protein of anthrax toxin; plasmid-less strains — had proteins, that had molecular masses corresponding to molecular masses of S-layer EA1 and Sap proteins. Conclusion. These strains may be used to study variability and proteomic analysis of anthrax causative agent, as well as for isolation of antigens with the aim of evaluating their immune diagnostic significance.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 1, P. 17—22
Key words: Bacillus anthracis, virulence plasmids, isogenic variants
ВВЕДЕНИЕ
Bacillus anthracis является грамположительной, палочковидной, неподвижной, факультативно анаэробной спорообразующей бактерией. Вирулентность для животных и человека, а также устойчивость к неблагоприятным условиям окружающей среды спор обусловили использование B.anthracis в качестве объекта биотерроризма [3, 6].
Предметом протеомных и биоинформационных исследований являются сравнительный анализ секреции белков, поиск иммунодоминантных антигенов, что может иметь значение при определении патогенности, терапевтических и диагностических маркеров, разработке вакцин. Для данных целей были использованы изогенные варианты штаммов, в том числе с различной биохимической активностью, выращенные в определенных условиях [5, 9, 12, 14, 16].
Наша работа посвящена получению и характеристике изогенных вариантов B. anthracis, которые в дальнейшем будут использованы для сравнительного про-теомного анализа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы два вирулентных штамма B. anthracis 81/1, 575/122 (рХО1+, рХО2+) и три вакцинных штамма СТИ, 55, Sterne (рХО1+, рХО2-), полученные из коллекции живых культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.
Элиминацию резидентных плазмид из клеток B. anthracis проводили по методикам [11, 13]. При удалении плазмиды рХО2 вместо новобиоцина использован канамицин в концентрации 2 мкг/мл. Штаммы, выраставшие в R-форме на сре-
де для капсулообразования в атмосфере СО2, клонировали с неоднократными пересевами.
Изучение продукции токсина, капсулы и антигенов S-слоя in vitro проводили в реакции иммунодиффузии с растущими культурами (РИДРК). В качестве питательной среды, обусловливающей продукцию капсулы и токсина, использовали плотную питательную среду, которую получали смешиванием равных объемов двойной концентрации сердечно-мозгового агара («Difco», USA) и компонентов R-среды [15] с нормальной лошадиной сывороткой (15%). Для определения продукции протективного антигена (ПА) и белков S-слоя использовали соответствующие сыворотки [1].
Определяли биологические свойства, служащие критерием видовой идентификации, такие как морфология клеток в мазках, тест на подвижность, тесты на лецитиназу, фосфатазу, чувствительность к бактериофагу диагностическому сибиреязвенному ГАММА А-26, пенициллину, протеолитическую активность [2, 4, 6].
Для выявления плазмид вирулентности B.anthracis использовали набор реагентов для выявления ДНК «АмплиСенс® Bacillus anthracis-FRT» (ЦНИИ эпидемиологии, Москва), гены pag A (pXO1), capA (pXO2), а также экспериментальные серии мультиплексной амплификационной тест-системы для идентификации и дифференциации B.anthracis (Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт), которая позволяла обнаруживать гены, кодирующие плазмидные факторы вирулентности — cya (рХО1), capC (рХО2) и хромосомный маркер sap.
Вирулентность штаммов оценивали на модели экспериментальной инфекции у мышей, которых заражали подкожно споровыми взвесями в дозах от 5 до 1х106 спор. Учитывали динамику смертности животных в опытных и контрольных группах. Контрольную группу заражали исходными вирулентными штаммами. Продолжительность наблюдения — 10 суток.
Электрофоретический анализ белков бесклеточных культуральных фильтратов (КФ) токсинпродуцирующих и бесплазмид-ных штаммов проводили в полиакриламид-ном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Белки КФ осаждали ацетоном — к одному объему 0,5 мл охлажденного КФ добавляли два объема охлажденного ацетона, смесь помещали в морозильник на 3 ч, затем центрифугировали при 12000 об/мин 5 мин. Осадок растворяли из расчета 1 мг сырого осадка в 1мкл дистиллированной воды, а затем добавляли равный объем лизирующей смеси. Иммуноблоттинг проводили с кроличьими сыворотками, полученными к фракциям культуральных фильтратов, соответствующих ПА и белкам S-слоя [1].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для получения штаммов B. anthracis 81/1 R02 и 575/122 R02, содержащих плазмиду рХО2, вирулентные B.anthracis 81/1 и 575/122 пассировали в L-бульоне при температуре 42,5°С в течение 10 — 15 суток с регулярными контрольными высевами на сывороточный агар. Колонии, выраставшие
Рис. 1. Реакция иммунодиффузии в геле с растущими культурами изогенных вариантов штамма B. anthracis 575/122.
Сыворотки: 1 — анти Sap; 2 — анти ПА; 3 — анти ЕА1. А — слева B. anthracis 575/122 (рХО1 + , рХО2+); справа B. anthracis 575/122 R02 (рХО1-, рХО2+). Б — слева B. anthracis 575/122 R01 (рХО1+, рХО2-); справа B. anthracis 575/122 R00 (рХО1-, рХО2-).
в R- и RS-форме, клонировали. Штаммы B. anthracis 81/1 R02 росли на сывороточной среде в R-форме, а B. anthracis 575/122 R02 — в RS-форме. В РИДРК образовывали линии иммунопреципитации только с сыворотками к антигенам S-слоя (рис. 1). По всей видимости, отсутствие роста в S-форме обусловлено элиминацией плазмиды рХО1, несущей единый регулирующий ген AtxA [10].
Полученные штаммы были вирулентны для мышей при подкожном заражении в дозе 100 спор и более, при вскрытии павших животных наблюдали полнокровие внутренних органов, гиперемию и набухание слизистой оболочки кишечника, увеличение лимфатических узлов. Аналогичную картину наблюдали и другие исследователи при изучении рХО2+-штаммов [2,4]. В мазках-отпечатках из органов павших животных цепочки типичных палочек окрашивались в синий цвет, капсула имела вид розовой полосы.
Штаммы B. anthracis 81/1 R01 и 575/122 R01, которые содержат плазмиду вирулентности рХО1, получали в течение 20 суток при пересеве штаммов B. anthracis 81/1 и 575/122 в среде с канамицином. Штаммы росли на сывороточной среде в R-форме, в РИДРК образовывали линии иммунопреципита-тов с сыворотками против протективного антигена и антигенов S-слоя (рис. 1). При заражении мышей 1х104 спор и выше наблюдали гибель животных, на вскрытии отмечали отечность и некроз тканей в области введения.
Бесплазмидные штаммы B. anthracis 81/1 R00, 575/122 R00 и СТИ R00, 55 R00, Sterne R00 получа-
1
4
Рис. 3. Иммуноблоттинг белков культуральных фильтратов с сывороткой к КФ B. anthгacis СТИ.
1, 2 — культуральные фильтраты В. апШгашв 575/122 R01 (рХО1+, рХО2-), В. апШгашв 575/122 R00 (рХО1-, рХО2-); 3, 4 — культуральные фильтраты В. апШгашв 81/1 R01(рХО1+, рХО2-), В. апШгашв 81/1 R00 (рХО1-, рХО2-).
Рис. 2. Электрофорез белков культуральных фильтратов B. anthracis.
1 — B. anthracis 55 (рХО1+, рХО2-); 2 — B. anthracis 55 R00 (рХО1-, рХО2-); 3 — B. anthracis СТИ (рХО1+, рХО2-); 4 — B. anthracis СТИ R00 (рХО1-, рХО2-); 5 — B. anthracis 575/122 R01 (рХО1+, рХО2-); 6 — B. anthracis 575/122 R00 (рХО1-, рХО2-); 7 — B. anthracis 81/1 R01 (рХО1+, рХО2-); 8 — B. anthracis 81/1 R00 (рХО1-, рХО2-); 9 — B. anthracis Sterne R (рХО1+, рХО2-); 10 — B. anthracis Sterne R00 (рХО1-, рХО2-).
ли температурной элиминацией плазмиды рХО1, на сывороточной среде росли в R-форме, в РИДРК образовывали линии иммунопреципитации только с сыворотками к антигенам S-слоя (рис. 1), были не вирулентны для мышей.
Гены, кодирующие плазмидные факторы вирулентности — cya и pagA, определены у вирулентных и авирулентных токсинпродуцирующих штаммов. Гены capA, capC, кодирующие белки капсулы — у вирулентных и капсулосодержащих штаммов, хромосомный маркер sap — у всех штаммов.
Полученные варианты, в отличие от вирулентных предшественников, изменяли свои биохимические свойства. B. anthracis 81/1 обладал незначительной протеолитичской активностью, из его производных только капсулосодержащий вариант сохранил данное свойство. Штамм B. anthracis 575/122 обладал лецити-назной активностью, его производные утратили данное свойство, а токсинпро-дуцирующий — приобрел протеолитичскую активность. B.anthracis СТИ и 55 не обладали лецитиназной и протеолитической активностью, а в результате элиминации плазмиды приобрели лецитиназную активность. B. anthracis Sterne отличался высокой протеолитической активностью, а бесплазмидный вариант B. anthracis Sterne R00 ее утратил.
Все штаммы были чувствительны к фагу, неподвижны, не обладали фосфатаз-ной и пенициллиназной активностью.
При электрофоретическом анализе белков установлено, что КФ моноплаз-мидных токсинпродуцирующих штаммов содержали преимущественно белки с молекулярной массой (м.м.) около 90 кДа (рис. 2), которые соответствуют молекулярным массам компонентов сибиреязвенного токсина [8].
Культуральные фильтраты бесплазмидных штаммов содержали белки м.м. 97 и 87 кДа, которые соответствуют молекулярным массам белков S-слоя ЕА1 и Sар, соответственно [12]. Следует отметить, что белки КФ B. anthracis 81/1 R00 от аналогичных белков других штаммов отличались тем, что менее интенсивно окрашивались Кумасси R-250, однако в иммуноблотинге выявлялись сывороткой, полученной к КФ B.anthracis СТИ (рис. 3).
ОБСУЖДЕНИЕ
B.anthracis секретирует в питательную среду большое количество белков, качественный и количественный состав которых зависит от наличия плазмид вирулентности, условий культивирования [9, 12, 14, 16]. В данной работе получены изогенные варианты штаммов B.anthracis 81/1, 575/122, СТИ, 55 Sterne, отличающиеся по наличию плазмид вирулентности. Они обладали типичными культурально-морфологическими свойствами, отличались по биохимической активности. Антигенный профиль КФ вариантов B.anthracis был связан с наличием плазмид.
Как правило, штаммы (рХО1- рХО2+) не образуют капсулу при выращивании на воздухе или на содовом агаре в атмосфере СО2 (0,8% бикарбонатa, 5% CO2). Это можно объяснить тем, что ген atxA плазмиды рХО1 является основным регулятором синтеза капсулы и контролирует экспрессию оперона capBCAD через положительное регулирование генов плазмиды рХО2 acpA и acpB. Однако рост в капсульной форме возможен в условиях, способствующих увеличению экспрессии acpA, в буферных средах при концентрации СО2 20% в атмосфере или в организме хозяина [8]. В нашем исследовании штаммы B. anthracis 81/1 R02 и 575/122 R02 не образовывали колонии в S-форме при определенных условиях выращивания. Капсула визуализировалась в мазках-отпечатках органов зараженных животных.
Одноплазмидные штаммы вызывали гибель мышей, B. anthracis 81/1 R01 и 575/122 R01 в дозе 1х104 спор, а 81/1 R02 и 575/122 R02 — более 100 спор. Основными факторами патогенности B. anthracis являются экзотоксин и капсула. Исследования последних лет выявили существенные различия в уровне вирулентности между культурами B. anthracis, содержащими как обе, так и одну плазмиды
вирулентности, а также ряд факторов патогенности, генетические детерминанты которых локализованы на плазмидах и хромосоме B. anthracis. Наличие у B. anthracis плазмиды рХО1 обусловливает проявления цитопатического эффекта на клетки макроорганизма. Патогенез инфекции для мышей, вызванной капсулосо-держащими штаммами B. anthracis, до конца не ясен. Возможно, он связан с наличием разновидностей плазмиды рХО2 и дополнительных факторов вирулентности, детерминированных плазмидами и хромосомой [2, 4, 10, 12, 14, 16].
Таким образом, полученные штаммы могут быть использованы для изучения изменчивости и протеомного анализа возбудителя сибирской язвы, а также выделения антигенов с целью оценки их иммунодиагностического и патогенетического значения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баркова И.А., Барков А.М., Алексеев В.В., Липницкий А.В., Буханцова Л.В. Продукция белков S-слоя разными штаммами Bacillus anthracis . Проблемы особо опасных инфекций. 2008, В. 98 (4): 29-32.
2. Коготкова О.И., Буравцева Н.П., Еременко Е.И., Ефименко В.И., Цыганкова О.И., Аксенова Л.Ю., Рязанов А.Г., Саркисова Н.В. Характеристика типичного вирулентного тест-штамма 81/1 Bacillus anthracis. Журн. микробиол. 2005, 2: 100-104.
3. Лабораторная диагностика опасных инфекционных заболеваний. Г.Г.Онищенко, В.В.Кутырев (ред.). М., Медицина—Шико, 2009.
4. Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Степанов А.В., Старицын Н.А., Померанцев А.П., Алешкин В.А., Афанасьев С.С. Микробиологическая диагностика сибирской язвы. М., ВУНМЦ МЗ РФ, 1999.
5. Микшис Н.И., Корсакова А.Ю., Болотникова М.Ф. и др. Продукция белков S-слоя штаммами Bacillus anthracis. Биотехнология. 2004, 5: 22-23.
6. Онищенко Г. Г., Кожухов В. В., Васильев Н. Т. и др. Сибирская язва: актуальные проблемы разработки и внедрения медицинских средств защиты. Рук. для врачей. Г.Г.Онищенко и др. (ред.). М., Медицина, 2010.
7. Adone R., Pasquali P., La Rosa G. et al. Sequence analysis of the genes encoding for the major virulence factors ofBacillus anthracis vaccine strain «Carbosap». J. Applied Microbiology. 2002, 93:117-121.
8. Boyer A. E., Gallegos-Candela M., Lins R.C. et al. Quantitative mass spectrometry for bacterial protein toxins — a sensitive, specific, high-throughput tool for detection and diagnosis. J. Molecules. 2011, 16: 2391-2413
9. Chitlaru Т., Gat O., Gozlan Y. et al. Differential proteomic analysis of the Bacillus anthracis secretome: distinct and chromosome CO2 — dependent cross talk mechanisms modulate extracellular proteolytic activites. J. Bacteriol. 2006, 180 (10): 3551-3571.
10. Drysdale M., Bourgogne A., Bourgogne T. Transcriptional analysis of the Bacillus anthracis capsule regulators. J. Bacteriol. 2005, 187 (15): 5108-5114.
11. Green B.D., Battisti L., Koehler T.M. et al. Demonstration of a capsule plasmid in Bacillus anthracis. Infect. Immun. 1985, 49 ( 2): 291-297.
12. Lamonica J.M., Wagner M.A., Echenbrenner M. Comparative secretome analyses of the Bacillus anthracis strains with variant plasmid contents. Infect. Jmmun. 2005, 73 (6): 36463658.
13. Mikesell P., Ivins B.E., Ristroph J.D., Dreiter T.M. Evidence for plasmid — mediated toxin production in Bacillus anthracis. Infect. Immun. 1983, 39: 371-376.
14. Pflughoefta K. J., Swicka M. C., Englerc D. A. et al. Modulation of the Bacillus anthracis secretome by the immune inhibitor A1 protease. J. Bacteriol. 2014, 196 ( 2): 424-435.
15. Ristroph J.D., Ivins B. Elaboration of Bacillus anthracis antigens in new, defained culture medium. J. Infect. Jmmunol. 1989, 39 (1): 483-486.
16. Walz A., Mujer C., Connolly J. et al. Bacillus anthracis secretome time course under host-simulated conditions and identification of immunogenic proteins. Proteome Science. 2007, 5: 11.
Поступила 02.07.14
Контактная информация: Баркова Ирина Анатольевна, к.м.н., 400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7, р.т. (8442)37-37-74
