CC BY
28
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 616.981.51:576.8.097.21
И.А.Баркова, В.В.Алексеев, А.В.Липницкий, А.М.Барков, Л.В.Буханцова ПРОДУКЦИЯ БЕЛКОВ S-СЛОЯ РАЗНЫМИ ШТАММАМИ BACILLUS ANTHRACIS
ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт»
Цель исследования - антигенный анализ и определение принадлежности к S-слою идентичных по молекулярной массе белков, выделенных из культуральных фильтратов B. anthracis. Изучены антигенные свойства белков, продуцируемых штаммами B. anthracis СТИ (рХО1+, рХО2), Davies (рХО1-, рХО2+), 81/1TR (рХО1-, рХО2) , которые элюировались в свободном объеме (фракция 1) при разделении культуральных фильтратов на сверхтонком сефакриле S-300. Показано, что сыворотки к фракциям 1 КФ штаммов B. anthracis СТИ, а также B. anthracis 81/1TR и Davies содержали антитела к неидентичным антигенам. Белки, идентифицированные с помощью сывороток, отнесены к антигенам S-слоя В. anthracis на основании м.м. 94 кДа, характерной для белков S-слоя, локализации на поверхностных структурах вегетативных клеток, а также независимости продукции от плазмид вирулентно сти.
Ключевые слова: B. anthracis, плазмиды вирулентности, культуральные фильтраты, гель-хроматография, белки S-слоя.
Штаммы Bacillus anthracis при культивировании в жидких питательных средах продуцируют большое количество белков, многие из которых кодируются хромосомой [7, 11].
К белкам, кодируемым хромосомой, относятся белки S-слоя - Sap (surface array protein) и EA1 (ex-tractable antigen). Синтез белков S-слоя детерминирован хромосомными генами sap и eag и зависит от AtxA и PagR регулонов, расположенных на плазмиде рХО 1. Поэтому рХО 1+и рХО 1- штаммы различаются по продукции белков S-слоя [13]. Белки Sap и ЕА1 последовательно присутствуют на клеточной поверхности B. anthracis. Совместное сосуществование обоих белков на клеточной поверхности возможно в момент начала синтеза ЕА1 и замещения Sap на ЕА1. В течение стационарной фазы роста замещение белков заканчивается выделением Sap в супернатант [12]. В культуральных супернатантах определяются оба белка, в отличие от ЕА1 белок Sap присутствует в значительном количестве [7, 11, 12].
В предыдущих работах мы сообщали о выделении белков, которые элюировались в свободном объеме (фракция 1) при разделении культуральных фильтратов (КФ) B. anthracis СТИ и 81/1TR на сверхтонком сефакриле S-300 [2, 3] Сыворотка к белку фракции 1 (ФР1) КФ B. anthracis СТИ оказалась пригодной для дифференциации штаммов B. anthracis от спорообразующих бацилл [1, 3]. Принадлежность выделенных белков к антигенам S-слоя не изучалась.
Цель настоящей работы - антигенный анализ и определение принадлежности к S-слою идентичных по молекулярной массе белков, выделенных из культуральных фильтратов штаммов B. anthracis.
Материалы и методы
В качестве штаммов-продуцентов белков S-слоя
изучены: B. anthracis СТИ (рХО1+, рХО2) - од-ноплазмидный токсинпродуцирующий штамм;
B. anthracis Davies (рХО1-, рХО2+) - одноплазмид-ный капсулообразующий штамм (коллекция патогенных бактерий Волгоград НИПЧИ); B. anthracis 81/1 TR (рХО1-, рХО2) - бесплазмидный штамм, полученный температурной элиминацией плазмид [10]. Для определения независимости синтеза белков S-слоя от плазмид вирулентности использованы варианты типичного вирулентного штамма B. anthracis 81/1 - B. anthracis 81/1R (рХО1+, рХО2), B. anthracis 81/1TR (рХО1-, рХО2).
Бесклеточные КФ получали на R-среде, рН 8,0-8,3 [14] и R-среде, обогащенной казаминовы-ми кислотами («Difco», США) из расчета 4 г на 1 л питательной среды. Получение бесклеточных КФ и выделение из них белков гель-хроматографией на сверхтонком сефакриле S-300 при ^=280 нм [2]. Белки КФ осаждали ацетоном. Для этого соединяли равные объемы (по 0,3 мл) охлажденного ацетона и КФ, выдерживали 16 ч при 2 °С, центрифугировали при 12000 об/мин, 5 мин (центрифуга «Sigma 202M»). К осадку добавляли экстрагирующий буфер, состоящий из 5 мМ трис-гидрохлорида, 5 мМ 2-меркапто-этанола, 1 % SDS (рН 9,8), из расчета 10 мкл на 1 мг осадка, прогревали 30 мин при 70 °С, хранили в замороженном состоянии до использования.
Концентрацию белка в КФ и его фракциях, в сыворотках и выделенных из них иммуноглобулинах определяли на спектрофотометре «Perkin-Elmer 550» при ^=280 нм.
Электрофорез в ПААГ в присутствии ДСН и им-муноблоттинг проводили по методике, изложенной в руководстве «Hoefer Scientific Instruments 19881989». San Francisco, СаПйэгша.
Электрофореграммы белков окрашивали Ку-масси R-250 («Serva»). Для определения молекуляр-
ной массы белков применяли маркеры фирмы «Хе-ликон», Россия (м.м. 14,4-97 кДа). Молекулярную массу белков определяли по электрофоретической подвижности с использованием компьютерной программы «LabImage». Иммуноблоты инкубировали с антикроличьими пероксидазными коньюгатами («Медгамал», Россия), визуализировали О-диамино-бензидином («Serva»). Электрофореграммы и иммуноблоты сканировали или фотографировали цифровой камерой «Dimage 323 Konica» (Китай).
Сыворотки к фракциям получали иммунизацией кроликов и изучали в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) и в реакции иммунодиффузии с антигенами растущих культур (РИД РК) [3].
Иммуноглобулины сывороток выделяли полиэ-тиленгликолем, метили флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), использовали в методе флуоресцирующих антител (МФА) [6].
Результаты и обсуждение
Жидкая питательная R-среда была выбрана для получения внеклеточных антигенов в связи с тем, что она обеспечивает не только внутриклеточный синтез белка, но и выделение его во внеклеточное пространство. Кроме того, высокий показатель рН 8,2-8,4 снижает действие протеаз [14]. Однако такая среда оказалась малопродуктивной для выделения белка S-слоя, который продуцировался в значительно большем количестве при выращивании токсинпродуцирующего и бесплазмидного штам-
Oll 280 нм
1 2 3 4 5 6 7 фракции
Рис. 1. Хроматограммы культуральных фильтратов штаммов B. anthracis:
А - культуральный фильтрат B. anthracis СТИ; В - культуральный фильтрат B. anthracis Davies; С - культуральный фильтрат B. anthracis 81/1 TR. Объем геля 2x72 см; объемы культуральных фильтратов, наносимых на гель, 2,5мл; скорость элюирования 25 мл/ч, объем одной пробирки 1 мл. Элюирование маркеров: Д - декстран голубой (81 проб.), Ф - ферритин (114 проб.), К - каталаза (128 проб.), А - альбумин бычий (141 проб.), Х - химотрипсиноген (165 проб.)
мов B. anthracis Steme в богатой питательной среде, включающей дрожжевой экстракт и триптон [9]. Обогащение дрожжевым экстрактом R-среды обуславливало более высокую продукцию белков B. anthracis, однако при фракционировании культуральных фильтратов исключалась регистрация отдельных компонентов в связи с элюцией пигмента в объемах выхода всех фракций. Поэтому для выделения протективного антигена мы использовали R-среду, а для выделения белков S-слоя - R-среду, обогащенную казаминовыми кислотами. Концентрированные на ультрафильтрах HLP10 и PM10 КФ оказались пригодными для фракционирования.
При фракционировании КФ штаммов B. anthracis СТИ, 81/1TR, Davies на сверхтонком сефакриле S-300 обращало внимание наличие сходных по м.м. белков, которые элюировались в свободном объеме -фракция 1. Профиль хроматограмм трех культуральных фильтратов обусловлен межштаммовыми различиями B. anthracis, одним из которых может быть содержание в штамме плазмид вирулентности (рис. 1).
Для КФ бесплазмидного штамма B. anthracis 81/1TR белок ФР1 был доминирующим. Белки других фракций содержались в незначительном количестве и выявлялись непостоянно. При разделении 15 мл этого КФ с концентрацией белка 10,9 мг/мл получена фракция 1 объемом 11 мл с концентрацией белка 1,2 мг/ мл. Для КФ капсулообразующего штамма B. anthracis Davies доминирующими также были белки ФР1, которые элюировались в виде трех не разделившихся пиков. Кроме белков ФР1, в КФ B. anthracis Davies содержались белки меньшей м.м., которые в отличие от КФ B. anthracis 81/1TR постоянно регистрировались в виде фракций 2, 3, 4, 6. При разделении 15 мл КФ B. anthracis Davies с концентрацией белка 12,8 мг/мл получали 10,5 мл ФР1 с концентрацией белка 1,2 мг/ мл. Выход белков ФР1 КФ B. anthracis СТИ был значительно ниже, чем фракций 1 КФ B. anthracis Davies и B. anthracis 81/1TR. С увеличением посевной дозы до 1-104 - 1-105 м.к./мл выход белка ФР1 КФ B. anthracis СТИ увеличивался более чем в 2 раза. Из 15 мл КФ B. anthracis СТИ с концентрацией белка 10,5 мг/ мл (посевная доза 1-103 м.к./мл) и 12,5 мг/мл (посевная доза 2-104 м.к./мл) получали по 10 мл ФР1 с концентрацией белка соответственно 0,110 и 0,280 мг/ мл. Фракция 3 КФ B. anthracis СТИ элюировалась в объеме ферритина (м.м. 440 кДа) [9]. Концентрация белка во ФР3 КФ B. anthracis СТИ существенно не зависела от посевной дозы и составила, соответственно, 0,750 мг/мл и 0,780 мг/мл.
Особенностью КФ токсинпродуцирующего штамма B. anthracis СТИ было наличие в нем доминирующего белка, который элюировался как ФР5. По объему выхода маркерных белков и биологическим свойствам ФР5 охарактеризована как протективный антиген [2]. Выход белков ФР5 существенно не зависел от посевной дозы. Концентрация белка в исходном КФ составила 1,5 мг/мл при посевной дозе 1-103 и 1,7 мг/мл при посевной дозе 2-104 м.к./мл. По-
лученные результаты подтвердили целесообразность использования для выделения ПА посевной дозы 1-103 м.к./мл, которая обусловливала преимущественное содержание его в КФ относительно других белков, продуцируемых B. anthracis СТИ
Для получения сывороток использованы фракции 1, поскольку сыворотка к фракции 1 КФ B. anthracis СТИ характеризовалась видоспецифичностью и позволяла идентифицировать штаммы B. anthracis в РИДРК [2].
При изучении специфичности сывороток в РИД РК установлено, что сыворотка к ФР1 КФ B. anthracis СТИ реагировала с антигеном, не идентичным антигену, выявляемому сыворотками к ФР1 КФ B. anthracis 81/1TR и Davies, а также сывороткой к ФР3 КФ B. anthracis СТИ (рис. 2). Это свидетельствовало о наличии в КФ белков с одинаковой молекулярной массой, но с различными антигенными свойствами, а также белков с различной молекулярной массой, но с одинаковыми антигенными свойствами [11].
Электрофоретический анализ показал, что культуральные фильтраты B. anthracis, 81/1TR, Davies и экстракт клеток B. anthracis СТИ содержали преимущественно белки с м.м. 94 кДа, характерной для белков S-слоя. Культуральный фильтрат B. anthracis СТИ содержал преимущественно белок с м.м. 84 кДа, характерной для протективного антигена, а также белки м.м. 51, 41, 22 кДа, которые, возможно, являются фрагментами протективного антигена, образовавшимися в результате действия собственных протеаз микроорганизма (рис. 3) [5].
В иммуноблоттинге сыворотки к белкам фракций 1 культуральных фильтратов бесплазмидного и токсинпродуцирующего штаммов выявляли белки м.м. 94 кДа, характерной для белков S-слоя, которые выделены из культуральных фильтратов (белок Sap) [4, 9] и экстрагированы из клеток (белок ЕА1) [8]. Следовательно, культуральные фильтраты и экстрак-
Рис. 2. РИД РК антигенов B. anthracis СТИ с сыворотками к фракциям культуральных фильтратов штаммов B. anthracis:
1, 2, 3 - соответственно сыворотки к фракциям 1 культуральных фильтратов B. anthracis СТИ, 81/1TR, Davies; 4 - сыворотка к фракции 3 культурального фильтрата B. anthracis СТИ
ты клеток содержали оба белка S-слоя.
Это позволяет предположить, что основным белком фракции 1 КФ штамма B. anthracis 81/1TR является белок Sap, а B. anthracis СТИ - ЕА1, так как в рХО1+ штаммах белок ЕА1 является основным антигеном S-слоя, так как ген atxA плазмиды рХО 1 репрессирует ген sap. В рХО1- и бесплазмидных штаммах репрессия гена sap исключается, что приводит к резкому увеличению продукции белка Sap [13].
Сыворотка к фракции 5 токсинпродуцирующего штамма выявляла белок м.м. 84 кДа, отсутствовавший в экстрактах клеток штаммов B. anthracis СТИ, 81/1TR, а также белки м.м. 94 кДа, которые при электрофорезе в культуральном фильтрате B. anthracis СТИ практически не определялись. Это свидетельствовало о содержании в сыворотке антител к ПА и к белкам S-слоя (рис. 3).
В РИД РК с изогенными штаммами B. anthracis сыворотки к белкам фракций 1 культуральных фильтратов бесплазмидного и токсинпродуцирующего штаммов выявляли сибиреязвенные антигены, продукция которых не зависела от плазмид вирулентности. Синтез белков S-слоя детерминирован хромосомными генами, что не исключало принадлежность белков фракций 1 к антигенам S-слоя [13].
Меченные ФИТЦ иммуноглобулины сывороток к фракциям 1 КФ B. anthracis 81/1TR, СТИ, Davies в разведении 1:16 - 1:32 окрашивали вегетативные клетки и споры B. anthracis 81/1. Специфическое окрашивание вегетативных клеток и спор подтверждало принадлежность выявляемых антигенов к поверхностным структурам, одной из которых может быть белок ЕА1. Хотя белок ЕА1 не является антигеном спор, он может присутствовать в препаратах
12345 123 123 123
Рис. 3. Электрофорез и иммуноблоттинг белков культуральных фильтратов:
Электрофорез: 1 - маркеры (97 кДА - фосфорилаза В;
66,2 кДа - бычий сывороточный альбумин; 45 кДа - овальбумин;
33 кДа - карбоангидраза; 21,5 кДа - ингибитор трипсина); 2 - экстракт клеток B. anthracis СТИ. Белки культуральных фильтратов штаммов:
3 - B. anthracis Davies; 4 - B. anthracis 81/1TR; 5 - B. anthracis СТИ. Иммуноблоттинг: А - с сывороткой к фракции 5 культурального фильтрата B. anthracis СТИ; Б - с сывороткой к фракции 1 культурального фильтрата B. anthracis 81/1 ТR; В - с сывороткой к фракции 1 культурального фильтрата B. anthracis СТИ.
1 - экстракт клеток B. anthracis 81/1 TR; 2 - экстракт клеток B. anthracis СТИ; 3 - белки культурального фильтрата B. anthracis СТИ
спор как постоянный контаминант [15].
Таким образом, штаммы B. anthracis с разным содержанием плазмид вирулентности при выращивании в питательной Я-среде, обогащенной казами-новыми кислотами, продуцировали идентичные по молекулярной массе белки, которые при фракционировании культуральных фильтратов на сефакриле 8-300 элюировались в свободном объеме. Сыворотки к этим белкам содержали антитела к антигенам, продукция которых не зависела от плазмид вирулентности, реагировали с поверхностными структурами вегетативных клеток, с белками с м.м. 94 кДа культуральных фильтратов и клеточных экстрактов, что явилось основанием считать выделенные белки антигенами 8-слоя.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Барков А.М., Липницкий А.В., Евтеева Е.В. Способ получения сыворотки для идентификации возбудителя сибирской язвы. Патент на изобретение № 2191603 от 27.10. 2002 г
2. Баркова И.А., Липницкий А.В., Барков А.М., Евтеева Е.В. Использование иммуноглобулинов к отдельным внеклеточным антигенам Bacillus anthracis СТИ для идентификации сибиреязвенного микроба. Биотехнология. 2005; 2:91—5.
3. Ермакова И.А., Липницкий А.В., Барков А.М., Евтеева Е.В. Способ выделения высокомолекулярного соматического сибиреязвенного антигена. Патент на изобретение № 2230570 от 20.06.2004 г.
4.Микшис Н.И., Корсакова А.Ю., Болотникова М.Ф. и др. Продукция белков S-слоя штаммами Bacillus anthracis. Биотехнология. 2004; 5:22-3.
5. Носков А.Н., Кравченко Т.Б., Носкова В.П. Выявление функционально-активных доменов в молекулах протективного антигена и летального фактора сибиреязвенного экзотоксина. Вестник РАМН. 1997; 6:20-4.
6. Шаханина К.Л. Приготовление люминисцирующих антител. Иммунология в медицине. Под ред. Левиной Е.Н. М.: Медицина; 1977. 237 с.
7. Chitlaru Т., Gat O. Differential proteomic analysis of the Bacillus anthracis secretome: distinct and chromosome CO2-depen-dent cross talk mechanisms modulate extracellular proteolytic activ-ites. J. Bacteriol. 2006; 188(10):3551-71.
8. Ezzel J., Abshire T. Immunological analysis of cell associated antigens of Bacillus anthracis. Infect. Jmmun. 1988; 56:349-56.
9. Farchaus J.B., Ribot W.J., Downs M., Ezzel J.W. Purification
and Charaterization of the major surface array protein from the avirulent Bacillus anthracis Delta Sterne-i. J. Bacteriol. І995; i77(9):24Si-9.
iG. Green B.D., Laurie Battisti, Kochler T.M. et al. Demonstration of capsule in B. anthracis. Infect. Immun. i9S5; 49(2):29i-7.
11. LamonicaJ.M., WagnerM.A., EchenbrennerM.Comparative secretome analyses of the Bacillus anthracis strains with variant plasmid contents. Infect. Immun. 2GG5; 73(6):3646-5S.
12. Mignot T., Mesnage S., Counture-Tosi E. et al. Developmental switch of S-layer protein syntesis in Bacillus anthracis. Mol. Microbiol. 2GG2; 43:i6i5-2S.
13. Mignot T., Mock M., Fouet A. A plasmid-encoded regulator couples the synthesis of toxin and surface structures in Bacillus anthracis. Mol. Microbiol. 2GG3; 47(4):9i7-27.
14. Ristroph J.D., Ivins B. Elaboration of Bacillus anthracis antigens in new, defained culture medium. Infect. Immun. i 9S9; 39(f):483-б.
15. WillamsD., Turnbough C. Surface layer protein EAi is not a component of Bacillus anthracis spores but is a persistent contaminant in spore preparations. J. Bacteriol. 2GG4; ^б^^бб^.
I.A.Barkova, V.V. Alexeev, A.V.Lipnitsky, А.М.Barkov, L.V.Bukhantsova
Production of S-Iayer proteins by Different Bacillus anthracis Strains
Volgograd Research Anti-Plague Institute
Investigated were antigenic properties of proteins produced by B. anthracis strains STI (рХОІ+, рХО2-), Davies (рХОІ-, рХО2+), Si/iTR (рХОІ-, рХО2-), eluated in void volume (fraction i) at division of cultural filtrates (CF) on superfine sefacryle S-3GG. Sera to fractions І of B. anthracis STI, Si/iTR and Davies CF were shown to contain antibodies to different antigens. The proteins identified with the help of sera were referred to antigens of B. anthracis S-layer relaying on м.м. 94 kDa, characteristic for S-layer proteins, localization on superficial cell structure, and independence of their production from virulence plasmids.
Key words: B. anthracis, virulence plasmids, cultural filtrates, gel chromatography, S-layer proteins.
Об авторах:
Баркова И.А. (н.с.), Алексеев В.В. (директор), Липницкий
А.В. (зам. директора), Барков А.М. (с.н.с.), Буханцова Л.В. (н.с.). Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт. 400131, Волгоград, ул. Голубинская, д. 7. Тел.: (844-2) 37-33-65. E-mail: vari2@sprint-v.com.ru
Поступила 10.07.08.
