CC BY
32C beta and delta isoenzymes mediate cholesterol accumulation in PMA-activated macrophages. Biochem Bi-ophys Res Commun. 2006; 349(1): 214-220
32. Soltoff S.P. Rottlerin is a mitochondrial un-coupler that decreases cellular ATP levels and indirectly blocks protein kinase Cdelta tyrosine phosphorylation. J. Biol. Chem. 2001; 276: 37986-37992
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ КОММЕРЧЕСКИХ БИОПРЕПАРАТОВ «БАЙКАЛ ЭМ-1» И «БИЭМ», СПОСОБНЫХ ЭЛИМИНИРОВАТЬ ЛИПИДНЫЕ, БЕЛКОВЫЕ И УГЛЕВОДСОДЕРЖАЩИЕ КОМПОНЕНТЫ
СТОЧНЫХ ВОД
Захаров Е.В.
асп.
Гомбоева С.В.
к.б.н., доц. Цыренов В.Ж.
д.б.н., проф.
Восточно - Сибирский государственный университет технологий и управления. каф. «Биотехнология»,
г. Улан-Удэ Россия
IDENTIFICATION AND STUDY OF MICROORGANISMS ISOLATED FROM COMMERCIAL BIOLOGICAL PRODUCTS "BAIKAL EM -1" AND "BIEM", CAPABLE OF ELIMINATING LIPID, PROTEIN AND CARBOHYDRATE-CONTAINING COMPONENTS OF WASTEWATER
Zakharov E.
post-graduate student Gomboeva S.
Candidate of Biological Sciences, Assoc.,
Tsyrenov V.
Dr. of Biol. Sc., prof.
East-Siberian State University of Technology and Management., Department "Biotechnology", Ulan-Ude,
Russia
АННОТАЦИЯ
В ходе работы было отобрано 4 штамма микроорганизмов, выделенных из препарата «БиЭМ» S. aureus 1А, A. oryzae 2В, S. cerevisiae 5Е, Lactobacillus sp. 7G и 5 штаммов из препарата «Байкал ЭМ» L. lactis 3C, E. coli 4D, B. subtilis 6F, B. thuringiensis 6.1F. Для идентификации изолятов исследовали их морфологические, тинкториальные, биохимические признаки. Проверена способность выделенных изолированных штаммов микроорганизмов усваивать основные углеводы, так все выделенные чистые культуры использовали предложенные субстраты, но, S. aureus не усвоил лактозу и крахмал, L. lactis не усвоил сорбит и крахмал, штаммы S. cerevisiae и Lactobacillus sp. не усвоили сорбит, B. Thuringiensis в свою очередь не усвоил мальтозу и сорбит. Среди выделенных микроорганизмов наиболее перспективными для элиминирования липидных, белковых и углеводсодержащих компонентов сточных вод оказались штаммы Saccharomyces cerevisiae 5E и Bacillus thuringiensis 6.1F.
ABSTRACT
In the course of the work, 4 strains of microorganisms isolated from the "BiEM" preparation of S. aureus 1A, A. oryzae 2B, S. cerevisiae 5E, Lactobacillus sp. 7G and 5 strains from the preparation "Baikal EM" L. lactis 3C, E. coli 4D, B. subtilis 6F, B. thuringiensis 6.1F. To identify the isolates, their morphological, tinctorial, biochemical features were examined. The ability of isolated strains of microorganisms to assimilate basic carbohydrates was tested, so all the isolated pure cultures used the proposed substrates, but S. aureus did not assimilate lactose and starch, L. lactis did not assimilate sorbitol and starch, strains of S. cerevisiae and Lactobacillus sp. not mastered sorbitol, B. thuringiensis, in turn, did not assimilate maltose and sorbitol. Among the isolated microorganisms, strains of Saccharomyces cerevisiae 5E and Bacillus thuringiensis 6.1F were the most promising for the elimination of dairy and fatty components of wastewater.
Ключевые слова: микроорганизмы, жировые компоненты, сточные воды, биологическая очистка, органические загрязнения.
Keywords: microorganisms, fat components, sewage, biological treatment, organic pollution.
Высокая концентрация сточных вод молочных производств, а также неравномерность их поступления приводят к перегрузке некоторых городских очистных сооружений и их неудовлетворительной
работе. Загрязненность данных стоков значительно превышает требования, предъявляемые к приему сточных вод в системы канализации населенных пунктов. Общая масса загрязнений сточных вод
предприятий молочной и мясной промышленно-стей Российской Федерации оценивается в 400 тыс. тонн ежегодно, из них по Республике Бурятия, 9,3 тыс. тонны, что непосредственно влияет на экологию региона и озера Байкал [1].
Имеется потребность по очистки сточных вод и оборудования от молочных и жировых компонентов. Существует несколько способов очистки это физический, химический и биологический. Из них наиболее безопасным и эффективным способом очистки является биологический способ, который применяется для биотрансформации молочных и жировых компонентов с помощью микроорганизмов-деструкторов.
В настоящее время на практике применяются коммерческие биопрепараты «Доктор Робик» (ООО «ВИПЭКО», г. Москва), «ВОН» (ООО «ЭМ-Кооперация» г. Москва), «Байкал ЭМ-1» и «БиЭм» (ООО «НПО ЭМ-центр», Улан-Удэ) и т.п., содержащие различные микроорганизмы, которые способны биотрансформировать различные компоненты сточных вод, но не оценена их способность элиминировать молочные и жировые компоненты сточных вод, а также симбиотическая и антагонистическая взаимосвязь данных микроорганизмов.
Целью работы было, выделение микроорганизмов из различных источников и изучение их способности к элиминированию липидных, белковых и углеводсодержащих компонентов сточных вод.
Задачами являлись:
1) выделить микроорганизмы из коммерческих биологических препаратов («Байкал ЭМ-1» и «БиЭМ») в качестве биотестов;
2) идентифицировать изоляты по морфологическим, тинкториальным и биохимическим признакам;
3) изучить способность данных изолятов элиминировать липидные, белковые и углеводсодер-жащие компоненты сточных вод
Материалы и методы исследования.
В данной работе рассмотрены результаты выделения из коммерческих биопрепаратов микроорганизмов-деструкторов органических веществ и их идентификация. В модельных опытах, с использованием соответствующих субстратов (жиров и молочных продуктов) изучены ферментативные активности (липаз, амилаз, протеиназ) необходимых для элиминирования молочных и жировых компонентов сточных вод.
Выделение штаммов микроорганизмов и введение их в чистые культуры осуществляли методом Коха. Для их идентификации использовали общеизвестные микробиологические методы, руководствуясь их перечнем для идентификации бактерий [2].
Использовались основные среды для выделения и идентификации микроорганизмов [3]. В качестве основных источников липидных, белковых и углеводсодержащих компонентов сточных вод использовали продукты растительного и животного происхождения, широко представленные на потребительском рынке. Потенциальную способность к
элиминированию липидных, белковых и углевод-содержащих компонентов сточных вод, выделенных штаммов микроорганизмов из биопрепаратов оценивали по наличию протеолитической, амило-литической, липолитической, лактазной активностей.
Амилолитическую активность определяли по изменению окрашивания среды, содержащей крахмал. Чем больше размер светлой зоны, тем выше амилолитическая активность [4].
Определение липолитической активности проводили на Бульоне Штерна. Исследуемые микроорганизмы культивировали в термостате, при 24-37 °С и отмечали изменение цвета среды, рН (лакмусовой бумагой), помутнение, наличие образования хлопьевидного осадка [5].
Активность липазы определяли по модифицированному методу Ота-Ямада [4]. В колбу с нейтральным субстратом, вносили фосфатный буфер (рН=7,0) и интенсивно встряхивали. Затем добавляли 1 мл культуральной жидкости микроорганизмов, встряхивали в течение 2-3 мин на качалке. Гидролиз проводили в течение 2 ч при 24-37°С, после чего приливали этанол для прекращения реакции. Продукты гидролиза оттитровывали 0,05 М раствором NaOH в присутствии 1% раствора ти-молфталеина. Специфическая активность липазы была выражена в микромолях олеиновой кислоты, освобождающейся за 1 час при гидролизе субстрата с помощью 1 мл культуральной жидкости.
Окислительную активность исследуемых микроорганизмов определяли по выделению углекислого газа. Культивирование микроорганизмов проводили в колбах, встряхивая на качалках в течении 3 суток. В качестве питательной среды использовалась минеральная среда (250 мл) с добавлением источника углерода 1% и 5 мл суточной культуры микроорганизмов. Количество образованного углекислого газа определяли титрованием 0,1н. HCl. В качестве поглотителя используется 0,1 н. NaOH. [2,
3].
Определение протеолитической активности проводили различными методами: разжижение желатина, створаживание и протеолиз казеина на агаре Эйкмана. Активность ферментов определяли по характеру роста и учету изменений желатина. Под действием фермента желатиназы происходит расщепление белков желатина, отмечается визуальное разжижение питательной среды. Степень створаживания молока различной жирности в течение 3 суток указывает на ферментативную активность протеазы [5].
Протеолиз казеина на молочном агаре Эйк-мана проводили по измерению зон просветления среды вокруг колоний микроорганизмов. Чем больше диаметр светлой зоны, тем выше казеино-литическая активность микроорганизмов [5].
Тесты на наличие каталазы производили путём посева в пробирки на скошенный мясо-пептонный агар. После инкубации приливали 1 мл 3%-ной перекиси водорода. Образование пузырьков означает положительную реакцию и параллельно добавляли
несколько капель 3%-ной перекиси водорода и к колониям на чашке или к зонам обильного роста, который может наблюдаться на поверхности полужидкой среды [8].
Результаты и их обсуждение
В ходе работы было отобрано 4 штамма микроорганизмов, выделенных из препарата «БиЭМ» 1А, 2В, 5Е, 7G и 5 штаммов из препарата «Байкал ЭМ» 3C, 4D, 6F, 6.1F, 8H. Для идентификации изо-лятов исследовали их морфологические, тинктори-альные, биохимические признаки.
На принадлежность культуры 1А к семейству микрококков указала положительная проба на ката-лазу, так как другие кокки (в частности стрептококки), каталазу не образуют. Для установления принадлежности культуры к роду Staphylococcus использованы два основных метода - культураль-ный и биохимический. С помощью культурального метода было выяснено, что на агаризованной плотной среде выросли стафилококки, т.к. именно колонии микроорганизмов этого рода способны к окрашиванию, в отличие от стрептококков. На основании биохимического метода можно сказать, что выделенные микроорганизмы принадлежат к роду Staphylococcus, т.к. стафилококки являются факультативными анаэробами, микрококки - облигат-ными аэробами, и последние не способны к ферментации глюкозы в анаэробных условиях. Видовая идентификация стафилококков проведена с помощью методов по определению наличия ферментов: плазмокоагулазы, лецитиназы и ДНК-азы, все тесты на данные ферменты были положительными, поэтому микроорганизмы рода Staphylococcus предположительно относятся к виду S. aureus [11].
Для выращивания плесневых грибов (культура 2В) использовали селективные среды Сабуро, с последующим пересевом на естественную среду, содержащую пшеничную муку, крахмал и источники фосфора (KH2PO4). Выросшие плесневые грибы на средах Сабуро и пшенице, по форме и цвету колоний и мицелия, по литературным данным соответствовали грибам рода Aspergillus, вида A. oryzae [5].
С целью выделения лактококков пробирки с исследуемым молоком оставляли для самозаквашивания при 26 °С в стационарных условиях. Затем проводили отбор пробирок, в которых плотный молочный сгусток формировался после ряда пассажей
Таблица 1.
Способность выделенных изолятов, из коммерческих биопрепаратов «БиЭм» и «Байкал ЭМ», использовать углеводы в качестве субстратов.
за 10-12 ч, что характерно для гомоферментатив-ных лактококков. Затем проводили высевы на агаровую среду из гидролизованного молока с добавлением панкреатина. Выделенный штамм молочнокислых бактерий 3С предположительно соответствовал по всем морфо-биологическим признакам роду Lactococcus, виду L. lactis.
Бактерии культуры кишечной палочки (к которым была отнесена культура 4D) очень неприхотливы и хорошо растут на обычных элективных питательных средах при pH 7,2-7,4. На плотных питательных средах был замечен рост гладких, плосковыпуклых, круглых, мутноватых колоний зеленоватого цвета. На среде Эндо колонии кишечной палочки окрашены в красно-фиолетовый цвет с металлическим блеском. При росте на жидких средах культура кишечной палочки дает помутнение и осадок. Таким образом, изолят 4D был предположительно отнесен к роду Escherichia sp. виду E. coli.
Физиолого-биохимические характеристики культуры дрожжей 5E исследовали на питательной среде с пептоном, индикатором «бромтимоловый синий», растворами сахаров в концентрации 10 % -галактоза, лактоза, мальтоза, раффиноза, сахароза, ксилоза, арабиноза, глюкоза, пентоза, крахмал. Изменение цвета индикатора указывало на образование кислых или щелочных (вследствие разложения пептона) продуктов метаболизма. Результаты наблюдений сравнивали с показателями роста в контрольной среде, не содержащей испытуемого источника углерода. Таким образом, выделенный штамм 5E по морфо-биохимическим показателям предположительно соответствовал роду Saccharomyces, виду S. cerevisiae.
Культуры 6F и 6.1F - это грамположительные тонкие палочки, располагаются одиночно, в виде нитей или цепочек. Они содержат овальные споры, не превышающие в поперечнике ширины микробной клетки. Капсулу не образуют. Для дальнейших исследований отбирали штаммы, которые на плотной питательной среде образовывали колонии мучного цвета, мелко складчатые, на мясо-пептоном бульоне растущие в виде морщинистой пленки. Изучение биохимических свойств выделенных бактерий, а также результаты проведения дополнительных тестов позволили предположительно отнести их к видам B. subtilis и B. thuringiensis.
Культура микроорганизмов Глюкоза Сахароза Ман-нит Мальтоза Сорбит Лактоза Крахмал
S. aureus 1A + + + + + - -
A. oryzae 2B + + + + + + +
L. lactis 3C + + + + - + -
E. coli 4D + + + + + + +
S. cerevisiae 5E + + + + - + +
B. subtilis 6F + + + + + + +
Lactobacillus sp. 7G + + + + - + -
B. thuringiensis 6.1F + + + - - + +
Практически все выделенные изоляты использовали предложенные углеводы. S. aureus 1А не усваивал лактозу и крахмал, L. lactis 3С не усвоил сорбит и крахмал, штаммы S. cerevisiae 5Е и Lactobacillus sp. 7G не использовали сорбит, B.
thuringiensis 6.1F - мальтозу и сорбит.
Наибольшей активностью обладали культуры микроорганизмов S. aureus, S. cerevisiae 5E и B. subtilis 6F.
Таблица 2.
Результаты идентификации штаммов микроорганизмов, выделенных из биопрепаратов «Байкал ЭМ-1» и
«БиЭМ»
Штаммы, выделенные из биопрепарата «БиЭМ» Штаммы, выделенные из биопрепарата «Байкал ЭМ»
Staphylococcus aureus 1А Lactococcus lactis 3C
Aspergillus oryzae 2B Escherichia coli 4D
Saccharomyces cerevisiae 5E Bacillus subtilis 6F
Lactobacillus sp. 7G Bacillus thuringiensis 6.1F
Таблица 3.
Определение амилолитической активности выделенных штаммов микроорганизмов.
Культура микроорганизмов Зоны гидролиза d, см
S. aureus 1A 1,6-2,8
A. oryzae 2B 1,4-2,0
L. lactis 3C -
E. coli 4D -
S. cerevisiae 5E 3,2
B. subtilis 6F 4,3
Lactobacillus sp. 7G 4,9-5,2
B. thuringiensis 6.1F -
Наибольшая амилолитическая активность отмечена у изолятов Lactobacillus sp. 7G - 4,9-5,2 d, см. У остальных культур активность амилазы не превышала 3,2-4,3 d, см. Наименее активными были культуры микроорганизмов L. lactis 3C, E. coli 4D, B. thuringiensis 6.1F.
Выяснено, что культуры микроорганизмов Staphylococcus aureus, Saccharomyces cerevisiae и Bacillus subtilis способны проявлять липолитиче-скую активность по отношению к липидным, белковым и углеводсодержащим компонентам сточных вод.
Изучена окислительная способность выделенных культур микроорганизмов по отношению к жирам животного (свиной и говяжий жиры) происхождения.
Наибольшую активность показала культура Lactobacillus sp. 7G - 162,67 мг СО2/г субстрата. На основании экспериментов по определению протео-литической активности микроорганизмов можно сделать вывод, что наибольшей активностью обладают культуры штаммы микроорганизмов S. cerevisiae и B. thuringiensis.
На основании экспериментов по определению протеолитической активности микроорганизмов можно сделать вывод, что наибольшей активностью по отношению желатины и молоко обладают культуры микроорганизмов S. cerevisiae 5E и B. thuringiensis 6.1F. При образовании светлых зон на агаре Эйкмана активность проявили культуры A. oryzae 2B и B. thuringiensis 6.1F
Выделенные из коммерческих биологических препаратов («Байкал ЭМ-1» и «БиЭМ») микроорганизмы-деструкторы органических веществ, которые на основании исследования морфологических, тинкториальных, биохимических свойств идентифицированы как S. aureus 1A, A. oryzae 2B, L. lactis 3C, E. coli 4D, S. cerevisiae 5E, B. subtilis 6F, Lactobacillus sp. 7G, B. thuringiensis 6.1F.
В модельных опытах изучена способность выделенных микроорганизмов элиминировать молочные и жировые компоненты сточных вод. На основании результатов исследования у культур микроорганизмов Staphylococcus aureus 1A, Escherichia coli 4D и Bacillus thuringiensis 6.1F выявлена активность липолитических ферментов по отношению к оливковому и подсолнечному маслам. S. aureus 1A проявляет наибольшую активность в отношении к соевому маслу. Культура микроорганизмов Saccharomyces cerevisiae способна в лучшей степени элиминировать льняное масло.
Культура микроорганизмов A. oryzae 2B наивысшую липолитическую активность она проявляет к сладкосливочному маслу выше, чем остальные выделенные микроорганизмы. Относительно культуры B. thuringiensis 6.1F имеет наилучший показатель активности к шоколадному маргарину.
По результатам окислительной способности культура микроорганизмов B. thuringiensis 6.1F показали лучшие значения элиминирования липид-ных, белковых и углеводсодержащих компонентов
сточных вод, по сравнению с остальными микроорганизмами. Так же следует отметить, что жиры животного происхождения окислялись исследуемыми культурами микроорганизмов сложнее, что вероятно связано с наличием в их составе до 50 мас.% насыщенных жирных кислот.
Эксперименты по определению протеолитиче-ской активности микроорганизмов, показывают, что наибольший результат показали культуры микроорганизмов S. cerevisiae 5E и B. thuringiensis 6.1F.
На основании результатов по определению амилолитической активности микроорганизмов, можно сделать вывод, что наибольшая активностью проявлена у культур микроорганизмов S. aureus 1A, S. cerevisiae 5E и B. subtilis 6F.
В литературных источниках описывается широкий круг микроорганизмов-деструкторов различных органических веществ, к примеру, в статье [12] обсуждаются методы по изучению липолитических свойств выделенных микроорганизмов из сточных вод после эмульсионного обезжиривания меховой овчины. В источнике [13] описываются данные использованию изолированных штаммов из препарата «Восток» в микробных топливных элементах, показана перспективность использования ЭМ-препарата «Восток», а также изолированных из него микроорганизмов для получения электрической энергии в микробных топливных элементах. Консорциумы микроорганизмов, входящие в состав ЭМ-препарата «Восток», как и изолированные, из него индивидуальные штаммы, способны элиминировать различные компоненты сточных вод. На базе ИРНИТУ города Иркутск, рассматриваются консорциумы, которые могли бы использоваться для элиминирования различных компонентов сточных вод в частности жировых и молочных.
Вывод:
На основании проведённых исследований можно сделать вывод, что выделенные и идентифицированные микроорганизмы-деструкторы органических веществ могут быть использованы для элиминирования основных липидных, белковых и уг-леводсодержащих компонентов сточных вод на предприятиях молочной промышленности для устранения загрязнений. По итогам исследований ферментативной активности, можно подчеркнуть, что среди всех выделенных микроорганизмов наиболее эффективно элиминируют элиминировать липидные, белковые и углеводсодержащие компоненты сточных вод, такие культуры как: S. cerevisiae 5E и B. subtilis 6F.
Статья написана при финансовой поддержке гранта РФФИ «Изучение взаимодействия отдельных штаммов и микробных ассоциаций, обладаю-
щих электрогенной активностью в МТЭ, с загрязнителями хозяйственно-бытовых сточных вод и разработка рекомендаций по интенсификации их очистки», проект № 18-48-030019.
Литература
1. Государственный доклад "О состоянии и охране окружающей среды Республики Бурятия" -Министерство природных ресурсов Республики Бурятия. - 2018 -190 с. интернет источник: http ://www. minpriroda-
rb. ru/activity/index.php?section_id=921 &element_id= 52670 (дата обращения: 14.06.18 г.)
2. Губонина З.И. Владимиров С.Н. Промышленная экология. Проблемы питьевой воды: учебн. пособ. - М.: Изд. МГОУ, 2010. -101 с.
3. Блинов, Л.Н. Санитарная микробиология: Учебное пособие КПТ / Л.Н. Блинов, М.С. Гутенев, И.Л. Перфилова и др. - СПб.: Лань КПТ, 2016.-240c.
4. Камышева, К.С.: Микробиология, основы эпидемиологии и методы микробиологических исследований. - Ростов н/д: Феникс, 2010. - 236 с.
5. Джей, Д.М. Современная пищевая микробиология / Д.М. Джей, М.Д. Лесснер; Пер. с англ. Е.А. Баранова. - М.: БИНОМ. ЛЗ, 2012. - 886 с.
6. Емцев В.Т., Мишустин Е.Н. Микробиология// Москва, 2017. № 8. -. 245с.
7. Дэвид Бун, Джордж Гаррити, Ричард Ка-стенхольц и др. Определитель бактерий Берджи. Перевод с английского под ред. акад. РАН Г. А. За-варзина. - М.: Изд. "Мир", 2001. Том 1., с. 722.
8. Госманов, Р.Г. Микробиология / Р.Г. Госма-нов и др. - СПб.: Лань, 2011. - 496 с.
9. Дэвид Бун, Джордж Гаррити, Ричард Ка-стенхольц и др. Определитель бактерий Берджи. Перевод с английского под ред. акад. РАН Г. А. За-варзина. - М.: Изд. "Мир" 2009. Том. 2., с. 1106.
10. Дэвид Бун, Джордж Гаррити, Ричард Ка-стенхольц и др. Определитель бактерий Берджи. Перевод с английского под ред. акад. РАН Г. А. За-варзина. - М.: Изд. "Мир" 2012. Том. 3., 1450 с.
11. Петров В.Г., Шумилова М.А., Столов В.В. Разложение водно-жировых эмульсий в сточных водах молочного производства с использованием коагулянтов // Вестник Удмуртского университета, 2013, Вып. 4. - . 27-32 с.
12. Шалбуев Дм. В. Изучение липолитических свойств микроорганизмов, выделенных из сточных вод после эмульсионного обезжиривания // Кожа и мех в XXI веке: технология, качество, экология, образование.: ВСГУТУ - У.У.: 2016. - 6 с.
13 Стом Д.И., Коновалова Е.Ю. и др. Использование в микробных топливных элементах штаммов, изолированных из препарата «ВОСТОК».: Известия Самарского научного центра. Самара. 2013 -1153-1156 с.
