CC BY
33
HayKOBHH BicHHK .HbBiBCbKoro Ha^oHa№Horo ymBepcurery BeTepHHapHoi' mcahuuhh Ta 6ioTexHonorm iMeHi C.3. I^H^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z. Gzhytskyj
doi: 10.15421/nvlvet7011
ISSN 2413-5550 print ISSN 2518-1327 online
http://nvlvet.com.ua/
УДК 637.065:637.075
Видовий склад бактерш роду ЕМвгососст молока сирого та сиру кисломолочного «домашнього» виробництва, 1х чутливкть до антибактерiальних препаратiв
Ю.В. Горюк1, М.Д. Кухтин1, Ю.Б. Перкiй1, ВВ. Горюк2, В.1.Семанюк3
goruky@mail.ru
'Тернотльська до^дна станщя 1нституту ветеринарног медицини НААН, вул. Тролейбусна, '2, м. Тернотль, 46027, Украгна; 2Подшьський державний аграрно-технiчний утверситет, вул. Шевченка, '3, м. Кам'янець-Подшьський, Хмельницька область, 3230', Украгна; 3Львiвський нацюнальний утверситет ветеринарног медицини та бiотехнологiй iменi С.З. Гжицького,
вул. Пекарська, 50, м. Львiв, 79010, Украна
Проведено дослгдження молока сирого та сиру кисломолочного щодо видового складу бактерш роду Enterococcus та визначення гх чутливостг до антибактергальних препаратгв. Встановлено, що з молока сирого та сиру кисломолочного видыялося в основному три види ентерокоюв: Е./аесаНз, Е. /аесшт та Е. durans. При цьому основну частину ентерокоюв молока сирого та сиру кисломолочного складав вид Е. faecalis 53,4 ± 4,22 та 73,4 ± 6,7'% вгдповгдно. Кглькгсть Е. /австт видыених з молока сирого складала 34,7±2,'5% , що в 2,86раза раза быьше вгдповгдно вмгсту гху сирг кисломолочному, а вид Е. durans складав вгд 5,3 ± 0,47 до 9,3 ± 0,74%. Чутливгсть до антибактергальних препаратгв у Е. faecalis видыеного з кисломолочного сиру була значно нижча, поргвняно з штамами Е. faecalis гзольованих гз молока сирого. Так, таю протимгк-робш препарати, якг були майже в '00 % активними до Е. faecalis видыеного з молока, як ванкомщин, фурамаг, амоксици-лт, проявляли нижчу ефективтсть до Е. faecalis з кисломолочного сиру, чутливгсть складала вгд 97,2 до 82,6%. Чутливгсть Е. faecalis з кисломолочного сиру до тших антибактергальних препаратгв, якг були взятг у дослгд складала в ',3 -37,0 раза (р < 0,05) меншою, поргвняно з Е. faecalis з молока сирого.
Ключовi слова: ентерококи, молоко сире, сир кисломолочний, антибготикостшюсть, агропродовольчий ринок.
Идентификация бактерий рода ЕМвгососсш выделенных из молока сырого и творога «домашнего» производства и их чувствительность к антибактериальным препаратам
Ю.В. Горюк1, Н.Д. Кухтин1, Ю.Б. Перкш1, ВВ. Горюк2, В.И. Семанюк3
goruky@mail.ru
'Тернопольская опытная станция Института ветеринарной медицины НААН, ул. Троллейбусная, '2, г. Тернополь, 46027, Украина; 2Подольский государственный аграрно-технический университет, ул. Шевченко, '3, г. Каменец-Подольский, Хмельницкая область, 3230', Украина; 3 Львовский национальный университет ветеринарной медицины и биотехнологий имени С.З. Гжицкого,
ул. Пекарская, 50, г. Львов, 790'0, Украина
Citation:
Horyuk, Yu.V., Kukhtyn, M.D., Perkiy, Yu.B., Horyuk, V.V., Semenyuk, V.I. (2016). Identification of Enterococcus isolated from raw milk and cottage cheese «home» production and study of their sensitivity to antibiotics. Scientific Messenger LNUVMBT named after S.Z. Gzhytskyj, 18, 3(70), 44-48.
Проведено исследование молока сырого и творога стосовно видового состава бактерий рода Enterococcus и определения их чувствительности к антибактериальным препаратам. Установлено, что из молока сырого и творога выделялось в основном три вида энтерококков: E. faecalis, E. faecium и E. durans. При этом основную часть энтерококков молока сырого и творога составлял вид E. faecalis 53,4 ± 4,22 и 73,4 ± 6,71% соответственно. Количество E. faecium выделенных из молока сырого составляла 34,7 ± 2,15 %, что в 2,86раза раза больше содержания их в твороге, а вид E. durans составлял от 5,3 ± 0,47 до 9,3 ± 0,74%. Чувствительность к антибактериальным препаратам в E. faecalis выделенного из творога была значительно ниже, по сравнению со штаммами E. faecalis изолированных из молока сырого. Противомикробные препараты, которые были почти в 100% активными до E. faecalis выделенного из молока, (ванкомицин, фурамаг, амоксициллин) проявляли низкую эффективность по отношению к E. faecalis выделеного с творога, чувствительность составляла от 97,2 до 82,6%. Чувствительность E. faecalis выделенного с творога по отношению к другим антибактериальным препаратам, которые были взяты в опыт была в 1,3 - 37,0раза (р < 0,05) меньше по сравнению с E. faecalis с молока сырого.
Ключевые слова: энтерококки, молоко сырое, творог, антибиотикоустойчивость, агропродовольственный рынок.
Identification of Enterococcus isolated from raw milk and cottage cheese «home» production and study of their sensitivity to antibiotics
Yu.V. Horyuk1, M.D. Kukhtyn1, Yu.B. Perkiy1, V.V. Horyuk2, V.I. Semenyuk3
goruky@mail.ru
1Ternopil research station of the Institute of veterinary medicine NAAS, Trolley Str., 12, Ternopil, 46027, Ukraine 2Podolski State Agricultural and Technical University, Shevchenko Str., 13, Kamenets-Khmelnytsky region, 32301, Ukraine 3Lviv national university of veterinary medicine and biotechnologies named after S. Gzhytskyj,
Pekarska Str., 50, Lviv, 79010, Ukraine
The investigation of the unpasteurized milk and lactic cheese as for the species of the Enterococcus bacteria genus has been made as well as the determination of their sensitivity to anti-infective drugs. It has been established that mainly three types of enter-ococci have escaped of the unpasteurized milk and lactic cheese: E. faecalis, E. faecium and E. durans. Thus the main part of entero-cocci of the unpasteurized milk and lactic cheese has composed a kind of E. faecalis 53.4 ± 4.22 and 73.4 ± 6.71% respectively. The quantity of E. faecium escaped of the unpasteurized milk has been 34.7 ± 2.15%, that is 2.86 times more in accordance with their content in the lactic cheese, and the genus E. durans ranged from 5.3 ± 0.47 to 9.3 ± 0.74%. The sensitivity to anti-infective drugs in E. faecalis escaped of the lactic cheese has been significantly lower compared to E. faecalis strains escaped of the unpasteurized milk. Yes, such anti-infective drugs that have been almost 100% active to E. faecalis escaped of milk as vancomycin, furamag, amoxicillin have shown lower efficiency to E. faecalis of the lactic cheese, the sensitivity ranged from 97,2 to 82,6%. The sensitivity of E. faecalis of the lactic cheese to other anti-infective drugs that have been taken into the experiment has been 1,3 - 37,0 times (p < 0,05) lower compared to E. faecalis of the unpasteurized milk.
Keywords: enterococci, raw milk, cheese, antibiotic resistance, the agri-food market.
Вступ
Важливу i значну групу MiKpoopraHi3MiB сирого молока i молочних продукпв складають бактери роду Enterococcus. Ц мжрооргашзми завжди присутш в молощ i складають так звану первинну мшрофлору (Garg and Mital 1991; Franz et al., 2003; Garmasheva and Kovalenko, 2011; Gashhuk, 2013;). Проте погляди на наявшсть ентерокошв у харчових продуктах неоднозначно Деяка частина вчених вважае 1х представниками нормально! мжрофлори осшльки вони проявляють пробютичш властивосп (Zaharenko, 2011; Karnauh and Bazaleeva, 2013). 1нша частина науковщв схиляеться до думки, що цей вид ввдноситься до умовно-патогенних бактерш i може спричиняти рiзнi запальш захворювання, хaрчовi отруення у людей i тварин (Garg and Mital 1991).
Останшм часом дослщження вказують про зв'язок мгж стшшстю бактерш до протимжробних препара-пв, як видшеш з продукпв харчування, та наявш у мiкрбiоценозi людини. При цьому вважаеться, що продукта харчування е одним iз шляхiв передaчi ан-тибютикорезистентносп даних бактерш, яш здатш спричиняти захворювання у людей (Franz et al., 2003;
Garmasheva and Kovalenko, 2011; Peretjatko, 2012; Gashhuk, 2013).
Мета роботи - вивчити видовий склад ентерокошв молока сирого та кисломолочного сиру i порiвняти 1х стшшсть до aнтибaктерiaльних препарапв.
MaTepia™ i методи дослвджень
Проведено дослщження 65 проб молока сирого та 61 проби кисломолочного сиру «домашнього» вироб-ництва, яш реaлiзовувaлися на агропродовольчих ринках мюта Тернопшь. Ввдбирання та доставляння проб у лабораторш проводили зпдно з ДСТУ 7357:2013 (DSTU 7357:2013). Видшення ентерокошв проводили на середовищi ентерококагар. До роду Enterococcus вщносили коковi форми бактерш, грам-позитивш, каталазонегативш, яш вщповвдали вимогам теспв Шермана: - росли у поживному бульйош за температури + 45 °С, в середовищi з вмiстом 6,5% натрию хлориду, за рН 9,6 од., з вмятом 40% жовчi, витримували температуру 60 °С упродовж 30 хв. По-дальшу видову iдентифiкaцiю проводили за допомо-гою тест-системи ЕН-КОККУС-тест («ERBA-Lachema Diagnostika^», Чехiя).
Визначення чутливосп видшених шташв ентеро-kokíb до антимжробних препарапв проводили диско-дифузшним методом Bauer-Kirbi з використанням стандартних комерцшних дисшв з антибактер1альни-ми препаратами: амшцил1ну (10,0 мкг), амоксицил1ну (10,0 мкг), цефтр1аксону (30,0 мкг), цефтазид1му (30,0 мкг), гентамщину (10,0 мкг), стрептомщину (10,0 мкг), канамщину (30,0 мкг), лшкомщину (15,0 мкг), тетрациклшу (10,0 мкг), норфлоксацину (10,0 мкг), офлоксацину (5,0 мкг), левофлоксацину (5,0 мкг), фурамагу (300,0 мкг) на середовищ1 Мюл-лер-Хштон (HiMedia, India). Приготування м1кробних суспензш проводили ввдповвдно до оптичного стандарту каламутностi 1,0 одиниць за шкалою McFarland з використанням приладу Dеnsi-LaMeter (PLIVA-Lachema Diagnostika, Чехiя) (Nakaz MOZ Ukrai'ny № 167 vid 05.04.2007).
Результати та ix обговорення
Для того щоб дати повну ветеринарно-санiтарну оцшку кисломолочному сиру «домашнього» вироб-ництва, який реалiзуeться на агропродовольчих ринках, щодо контамшацп бактерiями роду Enterococcus, нами було проведено ix видову iдентифiкацiю та ви-значено чутлив1сть до антибактер1альних препарапв.
Результати вдентиф1кацп бактерш роду Enterococcus видшених з молока сирого, яке було придбане на агропродовольчих ринках наведено на рис. 1.
Рис. 1. Видовий склад бактерш роду ЕШетосос-сж видшених з молока сирого, яке реа^зовуеться на агропродовольчих ринках
Як видно з даних рис. 1, що з сирого молока нами було видшено та вдентифшовано три види бактерш роду ЕМегососсш". Е. /аесаИ^', Е. /аесшш та Е. ёыгат. Основна частина видшених ентерокошв молока сирого представлена видом Е. /аесаИ^' - 53,4± 4,22%, част-ка Е. /аесшш в 1,5 раза менша (р < 0,05) i складала 34,7 ± 2,15%, а кшьшсть Е. ёыгат не перевищувала 10% ввд уах iдентифiкованих ентерокок1в. Енетеро-коки, яш проявляють спорiдненi властивостi i слабо диференцiюються складали 2,6 ± 0,17%.
На рис. 2 наведено даш шентифжаци бактерiй роду Е^егососсш' видшених з кисломолочного сиру «домашнього» виробництва, який був виготовлений з молока сирого.
Даш рис. 2 вказують на домывания у видовому складi кисломолочного сиру мiкроорганiзмiв Е. /ае-
calis, який складае 73,4 ± 6,71%, що в 1,37 раза (р < 0,05) бшьше, пор1вняно з молоком сирим.
Рис. 2. Видовий склад бактерiй роду ЕШегососсж видшених з сиру кисломолочного «домашнього» виробництва, який реа^зовувався на агропродо-вольчих ринках
Кшьшсть бактерш Е. /аесшш у сирi кисломолочному складала 12,1 ± 1,08 %, що в 2,86 раза (р < 0,01) менше шж 1х вмiст у молощ сирому, а вид Е. ёыгат складав 5,3 ± 0,47%. Також вiдмiчали збiльшення в 3,5 раза (р < 0,01) частки не вдентифжованих видiв ентерококiв у кисломолочному сирi до 9,2 ± 0,82%, порiвняно з молоком.
Отже, проведеш дослiдження вказують, що з по-мiж видового складу ентерокошв молока сирого i кисломолочного сиру «домашнього» виробництва домiнуe вид Е. /аесаИ^', який складае 53,4 ± 4,22% та 73,4 ± 6,71% ввдповвдно, i на нашу думку мае фекаль-не походження. Данi дослвдження вказують на те, що в звязку з переважанням фекального ентерококу у кисломолочному сирi необхвдно регламувати 1х кiлькiсне значення при розробщ санiтарно-гiгiенiчних критерив для оцiнки безпечносп кисломолочного сиру «домашнього» виробництва. Адже надмiрне зростання цього виду е не пльки показником порушення саштарно-ппешчних вимог виробництва, але й може бути причиною шф^вання людей даним продуктом.
Наступною частиною нашого дослiдження було визначити та порiвняти чутливiсть бактерш Е. /аесаИ^', як основного представника роду Е^егососсш', видшеного з молока сирого та сиру кисломолочного «домашнього» виробництва, що реалiзовуються на агропродовольчих ринках до анти-баш^альних препаратiв. На рис. 3 наведено результати дослвджень чутливостi до антибактерiальних препаратiв бактерiй Е. /аесаИ^' видшеного з сирого молока, яке реалiзовувався на агропродовольчих ринках.
Як видно з даних рис. 3, що мшрооргашзми Е. /ае-саИ^' видшеш з молока сирого в 100% випадшв були чутливими до глшопептидного антибютика -ванкомiцину, який традицшно використовують для лiкування рiзних септичних захворювань спричине-них ентерококами у людей, коли iншi антибiотики не допомагають. Практично, в 100% був активний фура-маг до бактерш Е. /аесаИ^', чутливють його складала 95,6 ± 2,2%.
Ванкомщин Фурамаг Левофлоксацин Офлоксацин Норфлоксацин Тетрациклш Лшкомщин Канамiцин Стрептомщин Гeнтамiцин Цeфтазидiм Цeфтрiаксон Амоксицилiн Амшцилш
Рис. 3. Чутливiсть до aHra6aKTepiaibH^ мремарамв бактерiй E. faecalis, видiлених з сирого молока, яке
ре^зовуеться на агропродовольчих ринках
1з трьох препаралв фторхшолонового ряду най-бшьш ефективним щодо E. faecalis був офлоксацин, який пригшчував рют у 64,3 ± 4,3% штам1в культур, а чутливють лево- i норфлоксацину складала 50,5 ± 3,1 та 44,1 ± 2,7% вшповвдно.
Слабку протиентерококову активнють проявляли препарати тетрациклш, лшкомщин, канамщин, ген-тамщин, р1вень чутливосп до даних антибютишв складав ввд 7,1 до 33,5%. Цефалоспорини третього поколшня цефтазд1м i цефтр1аксон проявляли серед-ню ефектившсть щодо пригшчення росту E. faecalis вш 43,2 ± 3,3 до 64,7 ± 4,5%.
E. faecalis проявляв значну чутливють до бета-лактамних антибютишв амоксицилшу та ампщшну. При цьому чутливють до ампщшну складала 74,2 ± 4,6%, а до амоксицил1ну з клавулановою кислотою -була у 100%. Очевидно клавуланова кислота посилюе протиентерококову даю у амоксицил1ну.
На рис. 4 наведено результати дослвджень чутливосп E. faecalis видшеного з кисломолочного сиру «домашнього» виробництва до антибактер1альних препарапв. Як видно з даних рис. 4, що чутливють у E. faecalis видшеного з кисломолочного сиру значно нижча, пор1вняно з штамами E. faecalis 1зольованих 1з молока сирого. Так, протимжробш препарати (ванкомщин, фурамаг, амоксицилш), як1 були майже в 100 % активними до E. faecalis видшеного з молока, проявляли нижчу ефектившсть до E. faecalis видшених з кисломолочного сиру, чутливють складала вщ 97,2 до 82,6%.
Чутливють E. faecalis видшеного з кисломолочного сиру до шших антибактер1альних препарапв, яш були взяп у дослщ була в 1,3 - 37,0 раза (р < 0,05) менша, пор1вняно з E. faecalis видшених з молока сирого.
Отже, шдсумовуючи проведеш дослщження мож-на ввдзначити, що ентерококи, яш вид1ляються з кисломолочного сиру домашнього виробництва, що реа-л1зуеться на агропродовольчих ринках проявляють шдвищену стшкють до протимжробних препарапв, пор1вняно з ентерококами видшених з молока сирого. Очевидно, це пов'язане з тим, що технолопя виготов-лення кисломолочного сиру в домашшх умовах пе-редбачае використання кислого молока з високою титрованою кислотнютю та з наступною довготрива-лою температурною обробкою. Висока кислотнють i температура, як надзвичайний фактор, стимулюе у клггинах E. faecalis стрес протеши в результат чого виробляеться шдвищена стшкють до дп чинник1в навколишнього середовища. У даному випадку ми можемо вщмггити формування стшкосп до антибак-тер1альних препарапв.
Таким чином, дослщження вказують на можли-вють селекцюнування у кисломолочному сир1 «домашнього» виробництва бактерш виду E. faecalis з стш-кими властивостями до антибютишв. Це в свою чергу може формувати стшш штами даних бактерш у шлу-нково-кишковому тракп людей - споживач1в кисломолочного сиру.
Ванкомщин Фурамаг Левофлоксацин Офлоксацин Норфлоксацин Тетрациклш Лшкомщин Канамщин Стрептомщин Гентамщин Це фтазид1м Це фтр1аксон Амоксицилш Ампщилш
( 2,8±0,27
^ 3,7±0,37 1,4±0,12 Щ4,3±0,30
26,1±2,08
12,3±0,98
92,4±2,4.
82,6±7,43
85,7±7,71
Рис. 4. Чутливкть до антибактерiальних препарапв E. faecalis, видшеного з сиру кисломолочного «до-машнього» виробництва, який реалiзовувався на агропродовольчих ринках
Висновки
1. З помгж видового складу ентерокок1в молока сирого i кисломолочного сиру «домашнього» виробництва домшуе вид E. faecalis, який складае 53,4 ± 4,22% та 73,4 ± 6,71% ввдповвдно, i на нашу думку мае фекальне походження. Збшьшення, в середньому в 1,4 раза кшь-косп бактeрiй E. faecalis в кисломолочному сир^ очевидно пов'язане з додатковим забрудненням його шд час технологй' виготовлення, зберйання та рeалiзацiï, або цей вид е бшьш стiйкий, порiвняно з iншими видами до температури, яку використовують пвд час виготовлення сиру в домашшх умовах.
2. Ентерококи, як1 видiляються з кисломолочного сиру «домашнього» виробництва, що рeалiзуеться на агропродовольчих ринках, проявляють шдвищену стшкють до протимiкробних препарапв, порiвняно з ентерококами видiлeних з молока сирого.
Подалыш дослщження будуть спрямованi на ви-вчення морфолопчних, бiохiмiчних та патогенних властивостей ентерокоюв видшених iз проб сиру кисломолочного «домашнього» виробництва, який реаль зуеться на агропродовольчих ринках.
Бiблiографiчнi посилання
Garmasheva, I.L., Kovalenko, N.K. (2011). Biologicheskaja aktivnost' i bezopasnost' jenterokokkov. Mikrobiologichnij zhurnal. 73, 4, 7784 (in Russian). Gashhuk, Je.C. (2013). Identyfikacija bakterij rodu Enterococcus vydilenyh z doi'l'nogo ustatkuvannja ta
moloka syrogo. Naukovyj visnyk L'vivs'kogo nacional'nogo universytetu veterynarnoi' medycyny ta biotehnologij im. G'zhyc'kogo. 15, 1 (1), 281-285 (in Ukrainian).
Zaharenko, S.M. (2011). Jenterokokkovye probiotiki v predstavlenii sovremennogo vracha.
Gastrojenterologija Sankt-Peterburga. 4, 13-17 (in Russian).
Karnauh, Je.V., Bazaleeva, A.N. (2013). Probiotiki v korrekcii kishechnogo mikrobiocenoza. Problemi ekologichnoi' ta medichnoi' genetiki i klinichnoi' imunologii'. 1, 204-215 (in Ukrainian).
Peretjatko, O.G. (2012). Mikrobiologichnyj monitoryng antybiotykorezystentnosti mikroorganizmiv rodu Enterococcus. Visnyk problem biologii' i medycyny. 2(1), 120-123 (in Ukrainian).
Garg, S.K., Mital B.K. (1991). Enterococci in Milk and Milk-Products. Critical Reviews in Microbiology, 18(1), 15-45.
Giraffa, G. (2002) Enterococci from foods. Fems Microbiology Reviews. 26(2), 163-171.
John, E.C., Yvonne, J., Nicholas, J.S. and Mary, F.H. (2001). A survey of the prevalence of Escherichia coli O157 in raw meats, raw cow's milk and raw-milk cheeses in south-east Scotland. International Journal of Food Microbiology, 66, 63-69.
Franz, C., Stiles, M.E., Schleifer, K.H. & Holzapfel W.H. (2003). Enterococci in foods - a conundrum for food safety. International Journal of Food Microbiology. 88(2-3), 105-122.
Cmammn nadiümna do peda^ii 3.10.2016
