CC BY
31
HayKOBHH BicHHK .HbBiBCbKoro Ha^OHaibHoro ymBepcurery BeTepHHapHoi' MegnuUHH Ta 6i0TexH0H0riH iMeHi C.3. f^H^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies
doi: 10.15421/nvlvet8018
ISSN 2519-268X print ISSN 2518-1327 online
http://nvlvet.com.ua/
УДК 579.222:637.3
Скришнг технолоНчних властивостей природних штамiв молочнокислих бактерiй
О.Й. Цiсарик, 1.М. Сливка, Л.Я. Мусiй [email protected], [email protected], [email protected]
Львiвський нацюнальний унiверситет ветеринарной медицини та бютехнологт iменi С.З. Гжицького,
вул. Пекарська, 50, Львiв, 79010, Украша
У статт1 висвгтлет результати дослгджень технологгчних властивостей молочнокислих бактерш (МКБ). Проведено скришнг 106 культур МКБ видтених Iз традицшно! бринзи виготовленоI у непромислових умовах гз овечого молока у Кар-патському регют Украти. При дослгдженг технологгчних властивостей МКБ враховували ферментативну г кислотоутво-рювальну активтсть штамгв на 3,6,9 та 24 год. культивування, розраховували кглькгсть молочноI кислоти, визначали здаттсть до росту мжрооргашзмгв за ргзних температурних режимгв +10 °С, + 15 °С,+45 °С та стшюсть культур мгкро-оргашзмгв доргзних концентрацш МаС1 - 2,4 г 6,5%. Врезультатг проведених дослгджень встановлено, щоргст за темпе-ратури +10 °С г +15 °С та концентрацп МаС1 2 г 4% був властивий для быьшостг лактобактерш. Вгдзначено активний ргст г розвиток штамгв ЕПвгосоесиз/аеамт за температури +45 °С г концентрацп МаС1 6,5%.
Щодо кислотоутворювальноI здатностг, встановлено, що найактившшим був вид Lactococcus ¡асИ,? ,,р. ¡асМз з енерг1-ею кислотоутворення 80-100 °Т. Найменш вираженою здаттсть до утворення молочноI кислоти характеризувались штами виду Lactococcus garvieae та Enterococcus/аеЫит 60-80 °Т.
Ключовi слова: молочнокислг бактери, мжробюлоггчш показники, технологгчт властивостг, кислотоутворювальна активтсть, солестшюсть, молочна кислота, ферментативна активтсть.
Скрининг технологических свойств природных штаммов молочнокислых бактерий
О. Цисарык, И. Сливка, Л. Мусий [email protected], [email protected], [email protected]
Львовский национальный университет ветеринарной медицины и биотехнологий имени С.З. Гжицкого,
ул. Пекарская, 50, г. Львов, 79010, Украина
В статье представлены результаты исследований технологических свойств молочнокислых бактерий (МКБ). Проведен скрининг 106 культур МКБ выделенных из традиционной брынзы изготовленной в непромышленных условиях с овечьего молока в Карпатском регионе Украины. При исследовании технологических свойств МКБ учитывали ферментативную и кислотопродуцирующую активность штаммов на 3,6,9 и 24 час культивирования, рассчитывали количество молочной кислоты, определяли способность к росту микроорганизмов при различных температурных режимах +10 °С, +15 °С, +45 °С и устойчивость культур микроорганизмов к различным концентрациям МаС1 - 2,4 и 6,5%. В результате проведенных исследований установлено, что рост при температуре +10 °С и +15°С и концентрации МаС1 2 и 4% был характерен для большинства лактобактерий. Отмечено активный рост и развитие штаммов Enterococcus /аеЫит при температуре +45 °С и концентрации МаС16,5%.
Установлено, относительно способности к образованию молочной кислоты, что наиболее активным был вид Lactococcus ¡а^., ,,р. ¡а^, с энергией кислотообразования 80-100 °Т. Наименее выраженной способностью к образованию молочной кислоты характеризовались штаммы вида Lactococcus garvieae и Enterococcus faecium 60-80 °Т.
Citation:
Tsisaryk, O., Slyvka, I., Musiy, L. (2017). Screening of technological properties of natural strains of lactic acid bacteria. Scientific Messenger LNUVMB, 19(80), 88-92.
Ключевые слова: молочнокислые бактерии, микробиологические показатели, технологические свойства, кислотопро-дуцирующая активность, солеустойчивость, молочная кислота, ферментативная активность.
Screening of technological properties of natural strains of lactic acid bacteria
O. Tsisaryk, I. Slyvka, L. Musiy [email protected], [email protected], [email protected]
Stepan Gzhytskyi National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies Lviv, Pekarska Str., 50, Lviv, 79010, Ukraine
The article presents the results of research the technological properties of lactic acid bacteria (LAB). Conducted a screening 106 cultures of lactic acid bacteria (LAB) isolated from traditional cheese made in non-industrial conditions with ewe's milk in the Carpathian region of Ukraine. During the study of the technological properties of the IBC, enzymatic activity of the strains and activity to form lactic acid at 3,6,9 and 24 hours of cultivation were taken into account. The calculation method has determined the amount of lactic acid, which forms microorganisms. The ability of microorganisms to grow at different temperature regimes + 10 °С, + 15 °С, +45 °С and the resistance of microorganisms to different concentrations of NaCl - 2.4 and 6.5% were determined. As a result of the research, it was found that for most lactobacilli the growth was characteristic at temperatures of + 10°C and +15 °C and concentration NaCl 2 and 4%. The established active growth and development of Enterococcus faecium strains at temperature +45 °С and concentration of NaCl 6.5%.
Regarding acid-forming ability, it was found that the most active was the appearance of Lactococcus lactis ssp. lactis with an energy of acid formation of80-100 °T. The lowest ability to form lactic acid characterized strains of Lactococcus garvieae species and Enterococcus faecium 60-80 °T.
The Further, strains of LAB, which characterized the best technological properties can be used to construct a bacterial preparation for production of cheese in industrial conditions.
Key words: lactic acid bacteria, microbiological parameters, technological properties, acid forming activity, salt stability, lactic acid, enzyme activity.
Вступ
Для ефективного використання молочнокислих продукпв надзвичайно важливим е вщтворення природного видового i штамового рiзноманiття бактерш традицшних нацюнальних кисломолочних продукпв i сирiв у баш^альних препаратах для промислового застосування. Це е передумовою не тшьки контрольо-ваного здшснення технолопчних процеав i отриман-ня продукпв з бажаними властивостями, але й збере-ження природних мiкробiоценозiв. Вони формувалися в екошшах упровдовж столпъ природним добором i пристосоваш як до ктматичних умов, так i до технолопчних особливостей виробництва традицшних продукпв. Важливо, що мшрофлора таких джерел може бути надшена важливими технолопчними i спещальними функцюнальними властивостями, насамперед пробютичними, вивчення яких мае важ-ливе теоретичне i прикладне значения (Kihel', 2003; Didukh and Chaharovs'kyy, 2006; Didukh et al., 2008; Merzlov and Snizhko, 2013; Musiy et al., 2017).
Потенцшним джерелом пошуку нових шташв молочнокислих бактерш (МКБ) перспективних для використання в складi бактерiальних i пробютичних препарапв е вичизняш кисломолочш продукта та сири, мжрофлора яких в Укрш'ш не вивчена (Chagarovskij and Zholkevskaja, 2003). Дослщження мшрофлори традицшних нацюнальних молочних продукпв може слугувати не тшьки збереженню природних бiоценозiв, яш формувалися упродовж столггь в конкретних умовах, але й створенню бактерiальних препарапв для промислового використання.
Бринза, як традицшний урканський продукт, е абсолютно невивченим мжробюлопчним об'ектом, а в останш роки до традицшних нацюнальних продукпв
прикута особлива увага науковщв. Створення «perio-нальних» заквасок на oснoвi штамiв, яш видiляють Í3 природних eкoнiш е перспективним, адже «мюцевЬ> штами краще пpистoсoванi до eкoлoгo-гeoгpафiчних умов конкретно! ктматично! зони.
Важливим етапом у створенш бактepiальнoгo препарату е пiдбip бактepiальних культур за симбютич-ними та тeхнoлoгiчними властивостями, характерни-ми для певного кисломолочного продукту чи сиру (Chagarovskij and Zholkevskaja, 2003; Cocolin et al., 2004).
При вiдбopi шташв МКБ для сиpiв за технолопчними властивостями важливо враховувати стушнь i швидшсть кислотоутворення та солестшшсть бактерь альних мiкpoopганiзмiв, так як це безпосередньо впливае на смак, фiзичнi якосп, швидкiсть отримання готового продукту та його збер^аиня (Vasylyuk et al., 2014).
Завданням нашо! роботи було пpoаналiзувати тех-нoлoгiчнi властивoстi домшуючих видiв МКБ, видь лених iз тpадицiйнoi карпатсько! бринзи, iдeнтифiкo-ваних за молекулярно-генетичними ознаками, та в подальшому сконструювати на !х oснoвi бактepiаль-ний препарат для виробництва бринзи у промислових умовах.
Матерiал i методи дослiджень
У наукових дослвдженнях використано культури МКБ видшеш iз бринзи, що виготовляеться iз овечого молока у непромислових умовах Карпатського perio-ну Украши.
Культури бактepiй iдeнтифiкoванo iз використан-ням класичних мiкpoбioлoгiчних i сучасних молеку-
лярно-генетичних методiв (RAPD-PCR, RFLP-PCR, секвенування гену 16S рРНК).
За основш критерп оцiнки придатностi культур МКБ як складових майбутнього бактерiального препарату було взято необхвдш технолопчш параметри, якi включали здатнiсть ферментувати молоко, кисло-тоутворювальну активнiсть, стшкють до високих концентрацiй NaCl та температурш оптимуми куль-тивування штамiв бактерiй.
Ферментативну активтсть культур ощнювали, використовуючи стерильне знежирене молоко. В пробiрки, що мiстили молоко, вносили рiвну к1льк1сть рщко! культури бактерш i ввдзначали час, протягом якого культура сквашувала молоко.
Кислотоутворювальну активнгсть ощнювали за зниженням рН молока, сквашеного вiдповiдним бак-терiальним штамом. Бактерп iнкубували в стерильному знежиреному молоцi без внесення додаткових компоненпв у термостатi при оптимальнш для кожного штаму температурi шкубацп протягом 3, 6, 9, 24 год. Вимiрювання рН проводили за допомогою електронного рН-метра «Muttler Toledo MP220». Тит-ровану кислотшсть молока визначали за ГОСТ 362492 «Молоко i молочнi продукта. Титрометричш мето-ди визначення кислотносп».
Розрахунковим методом визначено кiлькiсть молочно! кислоти в залежностi ввд титровано! кислотно-стi, виходячи з того, що 1 °Т вщповщае 0,009% моло-чно! кислоти. Опираючись на значення титровано! кислотностi молока, розраховано приблизну кiлькiсть молочно! кислоти, яка утворюеться в процес фермен-тацi!. Розрахунок кiлькостi молочно! кислоти проведено для шташв МКБ, яш були активними килотоут-ворювачами. Розрахунки проведено на 3, 6, 9 i 24 годину ферментацп знежиреного молока дослвджу-ваними МКБ.
Ргст МКБ за pi-зних температур. 0,5 мл ¡нокульо-ваного бактерiями бульйону MRS вносили в пробiрки ¡з 5 мл спещально приготовленого бульйону для визначення здатносп бактерiй рости за рiзних температур. Пiсля шокулящ! культурально! рвдини, пробiрки iнкубували протягом 7 дшв за рiзних температурних режимiв +10 °С, +15 °С +45 °С. Рiст клiтин за кожною з цих температур визначався за змшою забарвлення бульйону - вщ фiолетового до жовтого.
Ргст за pi-зних концентрацш NaCl. 0,5 мл ¡ноку-льованого бактерiями бульйону MRS вносили в про-
бiрки ¡з 5 мл спецiально приготовленого бульйону. Рют бактерiй визначали за концентрацш NaCl 2%, 4% i 6,5%. 1нкубування здiйснювали за температури +30 °С протягом 7 дшв. Змша забарвлення бульйону в пробiрцi вiд фiолетового до жовтого вказувала на здатнють бактерiй розвиватись при певних концен-трацiях NаQ.
Культивування мiкроорганiзмiв проводили протягом 24 год на спещальних живильних середовищах (MRS та М17) Культивували кожну культуру окремо протягом 24 год за температури 30 °С. Пiсля закш-чення процесу вирощування культуральну родину нейтралiзували до рН (6,5-6,6) та ввдокремлювали бiомасу шляхом центрифугування на суперцентрифузi при 15000 об/хв фiрми Thermo Scientific, шсля чого змiшували ¡з захисним середовищем.
Результати та Тх обговорення
Проведено скринiнг 106 культур МКБ, видшених ¡з традицiйно! бринзи, що виготовлена у непромисло-вих умовах ¡з овечого молока у Карпатському регiонi Укра!ни. Дослiджуванi культури МКБ ввдносилися до таких видiв: рiд Lactococcus (26 культур),з них вид Lactococcus Lactococcus lactis ssp. lactis (13 культур) та вид Lactococcus garvieae (13 культур ), рщ Lactobacillus вид Lactobacillus plantarum (31 культура), рщ Enterococcus вид Enterococcus faecium (25 культур), рщ Leuconostoc вид Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides (24 культури).
Аналiз основних фiзiолого-бiохiмiчних властивос-тей 106 дослвджуваних штамiв МКБ виявив !х гетеро-геннiсть.
Встановлено, що близько 90 i 93% штамiв Lactobacillus plantarum росли за температури +10 °С та +15 °С, тодi як за температури +45 °С рiст не ввд-значався. Аналогiчний рiст спостерiгали у Lactoccoccus lactis ssp. lactis - 83 i 87% за температури +10 °С i +15 °С вщповвдно; у Lactococcus garvieae - 81 i 89% та у Leuconostoc mesenteroides 85 i 92%. Слщ зазначити, що найактившше проявлявся рют штамiв Enterococcus faecium, ввдзначено рiст 87 i 90% за температури +10 °С i +15 °С, а також 90% проявляли рют за температури 45 °С. Результати дослщження наведенi у таблищ 1.
Таблиця 1
Порiвняння ростових характеристик дослщжуваних штамiв в залежносл вiд температури
Вид МКБ Рют за температури Рют за концентраци NaCl
+10 °С +15 °С +45 °С 2 % 4 % 6,5 %
Lactobacillus plantarum (n = 31) 90% 93% - 98% 87% 59%
Lactococcus lactis ssp. lactis (n = 13) 83% 87% - 95% 83% -
Lactococcus garvieae (n = 13) 81% 89% - 96% 84% -
Enterococcus faecium (n = 25) 87% 90% 98% 100% 98% 93%
Leuconostoc mesenteroides (n = 24) 85% 92% - 97% 89% 43%
Дослiджуванi штами по рiзному проявляли рiст за концентраци NaCl в1д 2 до 6,5% у середовищг Вiд-значено, що 2 i 4% NaCl здебшьшого не впливали на життедiяльнiсть дослвджуваних лактобактерiй.
При дослiдженнi технологiчних властивостей важ-ливо враховувати ступiнь i швидк1сть кислотоутво-рення бактерiальних мiкроорганiзмiв, так як це безпо-середньо впливае на смак продукту, його фiзичнi
якост1, швидкють отримання готового продукту, иого збереження i взаемодш з шшими компонентами бак-тер1ального препарату (Fortina et al., 2007).
Активна кислотшсть кисломолочного продукту (рН), особливо сиру прямо пов'язана з вмютом у ньому i формою кальцш. Пов№шше утворення кислоти знижуе швидкiсть переходу однieï форми ка-зешу, що знаходиться в комплекс з двома iонами кальцiю, в шшу форму, що утворюе комплекс з одним юном кальцш (dicalcium para-casein в monocalcium para-casein), що призводить до зниження тягучосп кшцевого продукту. Якщо рН молочного згустку продовжуе падати до значень 5,1-5,3, то втрачаеться бiльше кальцш, згусток стае менш щiльним
(Siegumfeldt et al., 2000). Активна кислотшсть (рН) для св1жого молока становить 6,47-6,67. Така кислотшсть сприятлива для спйкоеп колоïдноï системи молока i розвитку молочноï мiкрофлори. Кислото-утворювальна здатнiсть слугуе критерiем ввдбору штамiв для використання у виробництвi ферментова-них молочних продуктiв та сирiв.
Кислотоутворювальну активнiсть штамiв щодо зброджування молока вимiрювали кiлькiсно. Резуль-тати динашки змiн титрованоï i активноï кислотностi молока (°Т i рН) при культивуванш в ньому культур МКБ та результати шлькосп молочноï кислоти пред-ставленi в таблиц 2.
Таблиця 2
Кислотнiсть та швидккть утворення згустку в молощ дослвджуваними шт амами МКБ
Вид МКБ Швидюсть утворення згустку, год К-сть шта-мiв, % Титрована кислотшсть, °Т Активна кислотшсть, рН К-сть шта- мш, % % молочно1 кислоти
Lactobacillus plantarum (n = 31) 3 ± 1 5 < 60-80 5,5 4 < 54-72
6 ± 1 30 < 80-90 5,3 36 <72-81
9 ± 1 42 <90-100 5,0 41 <81-89
>24 23 <100-120 4,8 19 < 90-99
Lactococcus lactis ssp. lactis (n = 13) 3 ± 1 14 < 60-80 5,5 9 < 54-72
6 ± 1 29 < 80-90 5,3 31 <72-81
9 ± 1 55 <90-100 5,0 49 <81-89
> 24 2 <100-120 4,8 19 < 90-99
Lactococcus garvieae (n = 13) 3 ± 1 - < 60-80 5,5 35 < 54-72
6 ± 1 3 < 80-90 5,3 39 <72-81
9 ± 1 21 <90-100 5,0 20 <81-89
>24 76 <100-120 4,8 6 < 90-99
Enterococcus faecium (n = 25) 3 ± 1 - < 60-80 5,5 39 < 54-72
6 ± 1 19 < 80-90 5,3 35 <72-81
9 ± 1 27 <90-100 5,0 19 <81-89
>24 54 <100-120 4,8 7 < 90-99
Leuconostoc mesenteroides (n = 24) 3 ± 1 - < 60-80 5,5 49 < 54-72
6 ± 1 12 < 80-90 5,3 27 <72-81
9 ± 1 40 <90-100 5,0 14 <81-89
> 24 48 <100-120 4,8 10 < 90-99
Дослiджуванi штами МКБ сквашували молоко протягом 12-48 годин, титрована кислотшсть згустку коливалася в дiапазонi вщ 60 °Т до 120 °Т. Бiльшiсть шташв виду Lactococcus lactis ssp. lactis сквашували молоко за 3-9 годин, тодi як Lactococcus garvieae та Enterococcus faecium - понад 24 години.
Висновки
Температура культивування та концентращя NaCl у середовищi по рiзному впливали на рiст шташв МКБ. Встановлено, що рют за температури +10 °С i +15 °С та концентрацiï NaCl 2 i 4% був властивий для бшьшосп лактобактерш. Вгдзначено активний рют i розвиток шташв Enterococcus faecium за температури +45 °С i концентрацп NaCl 6,5%.
Щодо кислотоутворювальноï здатносп, встановлено, що найактившшим був вид Lactococcus lactis ssp. lactis з енерпею кислотоутворення 80-100°Т. Найменш вираженою здатнiсть до утворення молочно!' кислоти характеризувались штами виду Lactococ-cus garvieae та Enterococcus faecium 60-80 °Т.
В подальшому, штами МКБ, яш характеризувались найкращими технолопчними властивостями, можуть бути використаш для конструювання бактерь ального препарату для виробництва бринзи у промис-лових умовах.
Перспективи подальших досл1джень. Подальш1 дослщження будуть скероваш на вивчення антибюти-корезистентносл шташв МКБ та Гх патогенностг
Публ1кац1я мютить результати дослщжень, прове-дених за грантом Президента УкраГни за конкурсним проектом (Ф-70/122-2017) Державного фонду фунда-ментальних дослгджень.
Бiблiографiчнi посилання
Didukh, N.A. Chaharovs'kyy, O.P., Lysohor, T.A. (2008). Zakvashuval'ni kompozytsiyi dlya vyrobnytstva molochnykh produktiv funktsional'noho pryznachennya.. Odesa: Polihraf (in Ukrainian). Didukh, N.A., Chaharovs'kyy, O.P. (2006). Nanotekhnolohiyi produktiv funktsional'noho pryznachennya na molochniy osnovi. Materialy I Mezhdunarodnoj nauchno-prakticheskoj konferencii
HayKOBHH BicHHK ^HyBME iMeHi C.3. IW^KOTO, 2017, T 19, № 80
«Nauka i tehnologii: shag v budushhe». Sel'skoe hazjajstvo. Belgorod: Rusnauchkniga. 1, 33-36 (in Ukrainian).
Kihel', N.F. (2003). Tekhnolohiyi bakterial'nykh preparativ dlya funktsional'nykh produktiv i biolohichno aktyvnykh dobavok. Avtoreferat dysertatsiyi na zdobuttya naukovoho stupenya doktora tekhnichnykh nauk, Kyyiv (in Ukrainian).
Merzlov, S.V., Snizhko, O.O. (2013). Pidbir optymal'noyi zakvasky za biotekhnolohiyi novoho kyslomolochnoho napoyu - yohurtu. Naukovyy visnyk Bilotserkivs'koho natsional'noho universytetu. 10(105), 76-80 (in Ukrainian).
Musiy, L., Tsisaryk, O., Slyvka, I., Mykhaylytska, O., Gutyj, B. (2017). Research into probiotic properties of cultured butter during storing. Eastern-European Journal of Enterprise Technologies. 3, 11(87), 31-36.
Musiy, L., Tsisaryk, O., Slyvka, I., Mykhaylytska, O., Gutyj, B. (2017). Study of keeping probiotic properties of sour-cream butter at storage. EUREKA: Life Sciences. 2, 27-33.
Chagarovskij, V.P., Zholkevskaja, I.G. (2003). Biotehnologija poluchenija biojogurtov i biokefira, izuchenie ih vlijanija na zdorov'e cheloveka. Mikrobiologichnij zhurnal. 65(6), 67-73 (in Russian).
Cocolin, L., Rantsiou, K., Iacumin, L., Urso, R., Cantoni, C., Soti, G. (2004). Study of ecology of fresh sausages end characterization of populations of lactic acid bacteria by molecular methods. Appl. Environ. Microbiol. 70(3), 1883-1894.
Vasylyuk, O.M., Kovalenko, N.K., Harmasheva, I.L., Oleshchenko, L.T. (2014). Vydilennya ta identyfikatsiya bakteriy rodu Lactobacillus z fermen-tovanykh produktiv riznykh rehioniv Ukrayiny. Mikrobiolohichnyy zhurnal. 76(2), 2-9 (in Ukrainian).
Fortina, M.G., Ricci, G., Foschino, R., Pacozzi, C. (2007). Phenotypic typing, technological properties and safe-tynaspects of Lactococcus garvieae strains from dairy environments. J. of Applied Microbiology. 103, 445453.
Siegumfeldt, H., Recliinger, K.B., Jakobsen, M. (2000). Dynamic changes of intracellular pH in individual lactic acid bacterium cells in response to a rapid drop in extracellular pH. Appl. Environ. Microbiol. 66(6), 2330-2335.
Received 20.09.2017 Received in revised form 23.10.2017 Accepted 27.10.2017
