CC BY
72
УДК 57.081.22
Н.Е. Павловская, доктор биол огических наук А.Ю. Гагарина, аспирант ФГОУ ВПО Орел ГАУ
ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ФАКТОРОВ АПОПТОЗА В РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ
Показано, что идентификация фактора апоптоза клеточного сока растений при помощи хроматографического анализа позволят предполагать природ действующего вещества, входящего в состав исследуемых индукторов запрограммированной клеточной гибели.
Ключевые слова: хроматографический анализ, апоптоз,
вэжх.
Исследования апоптоза, или запрограммированной клеточной гибели (ЗГК) у животных организмов вызывает большой интерес, связанный с продлением жизни человека (геронтология), формированием и отмиранием тканей и органов в процессе эмбрионального развития у животных, возникновением онко огических забо еваний, формированием проводящей системы (ксилемы) у растений т.д. Индукторами, вызывающими апоптоз, называют фитогормоны, ферменты (каспазы, эндонуклеазы, те омеразу и др.). Апоптоз яв яется не то ько генетически запрограммированным яв ением, но может быть вызван внешними факторами (радиацией, пато огией и другими био огическими и абиотическими факторами) [2,8]. Поэтому изучение механизмов
яв ения ЗГК, выяв ение индукторов, разработка приемов, регу ирующих смерть к етки, яв яется не то ько важной фундамента ьной проб емой, но и открывающимися возможностями создания
терапевтических средств д я ечения онко огических забо еваний, прод ения жизни че овека, по учение принципиа ьно новых биопестицидов, тест-систем д я прогнозирования и биомониторинга эко огических нарушений природы.
Нашими исследованиями установлено [3, 4], что к еточный сок, выде енный из ко еопти ей пшеницы и ячменя, а также формирующихся истьев монстеры, вызывает деструкцию ДНК по типу « есенки», свойственной то ько апоптозу, резко снижает активность антиоксидантных ферментов
(супероксиддисмутазы, пероксидазы, ката азы) и синтез низкомолекулярных витаминов А, С и глутатиона, защищающих к етки от агрессивных радика ов. С едующим этапом в работе яв яется необходимость поиска фактора апоптоза, установ ение его природы и возможности снижения пато огического в ияния.
Внедрения в практику исс едований по физикохимической био огии методов хроматографии открывает новые ана итические возможности д я опреде ения веществ в многокомпонентных смесях, д я анализа по технологическому контролю за чистотой препарата при медико-био огических и биотехно огических операциях и в фармако огических производствах [5].
Основными параметрами, измеряемыми в адсорбционной спектрофотомерии, яв яются д ина волны (9), соответствующая максимуму поглощения (9пш:), ширина полосы поглощения и удельный
Identification of a factor of apoptosis of the cell sap of plants by chromatographic analysis suggests that the nature of the active substance included in the composition of the inducers of programmed cell death.
Key words: chromatographic analysis, apoptosis, HPLC.
коэффициент экстинкции (8), причем чаще рассматривается так называемая полуширина полосы, т.е. ширина полосы на уровне половины высоты пика поглощения. Величины 9 и 8 претерпевают заметные изменения под влиянием pH среды, полярности растворителя, соседних молекул и ориентации соседних хроматофоров [1, 7].
Хроматограмма - графический результат хроматографического процесса. Это зависимость прохождения элюента через ячейку детектора. Ряд пиков при по ном разде ении соответствует одному компоненту анализируемой пробы. Площадь или высота пика должна быть пропорциональна концентрации компонента в элюенте [6].
Важной характеристикой для идентификации исс едуемой смеси яв яется время удерживания вещества в хроматографе (tR). Время удерживания опреде яют от момента ввода пробы вещества в хроматограф от момента регистрации максимума детектора. Каждое вещество при одних и тех же хроматографических условиях имеет свое время удерживания. Как отмечает С.Н. Сычев (2000 г.), это по ожение яв яется основой идентификации (качественного анализа) компонентов разделяемой смеси при жестком соб юдении постоянства ус овий эксперимента, состава э юента, расхода э юента (объемная скорость подачи элюента), использование одной и ой же колонки, минимальных колебаниях температуры окружающей среды, сравнимых ко ичеств вещества в хроматографическом пике ана изируемой смеси и стандарта.
Целью наших исследований является идентификация фактора апоптоза к еток растений методом ВЭЖХ.
Материалы и методика исследований
В работе использован ВЭЖХ Милихром -5, с обращено-фазной колонкой КФХ 6-80-4, сорбент-сепарон С18, элюент ацетонитрил и вода(35:65). Смесь в количестве 100 мкл наносил ась в элюенте. Удерживаемый объем колонки 80х2 1000-1300 мкл. Количество элюента, необходимого для проведения всего ана иза, обычно в1,3 раза бо ьше оптимального, т.е. 1700 мкл. Время анализа 17 минут.
Анализировался клеточный сок колеоптилей пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта "Московская 39", ячменя (Hordeum sativum L.) сорта «Скарлет» и молодых листьев монстеры (Monstera deliciosa L.).
Для подготовки проб колеоптилей, семена пшеницы и ячменя этиолировали в кювете на влажной фильтровальной бумаге, при температуре 25°С в течение 4 дней в программируемой климатокамере. Колеоптили отделяли от прочих органов проростка, и дальнейший эксперимент вели с навеской колеоптилей равной 2 грамма. Из ко еопти ей бра и вытяжку к еточного сока, равную 1 мл, и центрифугировали в течении 15 минут при 15000 об./мин.
Для подготовки проб монстеры, из молодых истьев растения бра и пробы в местах предполагаемой перфорации лопастей листа, и дальнейший эксперимент вели с измельченной навеской, равной 2 грамма. Измельченный лист
монстеры растирали в ступке с 1 мл воды, затем центрифугировали в течение 15 минут при 15000 об/мин.
Результаты и их обсуждение
Известно, что белковые препараты поглощают в УФ-области 230-300 нм с пиком около 280 нм, причем интегра ьное пог ощение спектра ьного контура определяется в подавляющем количестве вк адом остатков ароматических аминокис от фенилаланина, тирозина и триптофана. Вклад серосодержащих аминокис от цистеина, цистина и метионина в до ю общего УФ- спектра пренебрежимо ма .
Предварительные данные показали, что максимум поглощения анализируемых клеточных соков находится в области 280 нм. В связи с этим качественный ана из проводи и путем детектирования при длине волны 220, 240, 260 и 280 нм. Использование спектрофотометрического детектора вместе с компьютером позволяют получить
хроматограмму на нескольких длинах волн
одновременно и рассчитать дополнительный
параметр для идентификации - спектральное
отношение. Спектральным отношением называется отношение высот хроматографического пика на разных д инах во н.
А Б
Рисунок 1 - Хроматограмма клеточного сока при д лине волны 220 нм: А - колеопти ль пшеницы, Б- колеопти ль ячменя
На хроматограмме (рис.1А) у пшеницы путем детектирования при д ине во ны 220 нм обнаружены 4 пика. Пики 1 и 2 - с площадью под пиками 483 мм2 и 160 мм2 соответственно. Время удерживания на колонке составляет 2,2 мин и 4,0 мин. Маленькие
пики 3 и 4 имеют п ощади 76,5 и 46 мм2 соответственно, с временем удерживания 4 и 7,8 мин.
На хроматограмме (рис.1Б) у ячменя обнаружен один преобладающий пик (?1) с площадью под пиком 355 мм2 и временем удерживания на колонке 2 мин. Пики 2,3,4,5 не существенны.
А Б В
Рисунок 2 - Хроматограмма клеточного сока при д лине волны 240 нм: А - колеопти ль пшеницы, Б- колеопти ль ячменя, В- лист монстеры
При детектировании при 240 нм (рис.2А) у пшеницы наблюдаются 5 пиков, из которых 1-ый с площадью под пиком 516 мм2 и временем удерживания 2 мин соответствует максима ьному пику при 220 нм. 2-ой и 5-ый пики имеют
соответственно п ощади под пиками 15 и 56 мм2 , с временем удерживания 2 и 6 мин., а два других ничтожно ма ы.
У ячменя в тех же условиях детектирование при 240 нм. (рис.2Б) первый пик имеет площадь под пиком 54,6 мм2 с временем удерживания 2 мин. 3-им и 4-ым пиками можно пренебречь.
У монстеры (рис. 2В) детектирование при 240 нм. выявило аналогичный для всех культур пик №1 с п ощадью под пиком 67,2 мм2 и временем удерживания 2 мин. 2-ой пик имеет площадь 18,1 мм2 и время удерживания 3 мин.
А Б В
Рисунок 3 - Хроматограмма клеточного сока при д лине волны 260 нм: А - колеопти ль пшеницы, Б- колеопти ль ячменя, В- ист монстеры
Выявленный детектированием пик №1 при 220 и 240 нм у пшеницы, ячменя и монстеры при д ине волны 260 нм. (рис.3) имеют площади под пиками соответственно 335 мм2 ; 164,8 мм2 и64,5 мм2 и временем удерживания 2 мин. 2-ой пик оказа ся
существенным только у пшеницы (53,5 мм2), время удерживания 3,8 мин.
А Б В
Рисунок 4 - Хроматограмма клеточного сока при д лине волны 280 нм: А - колеопти ль пшеницы, Б - колеопти ль ячменя, В- лист монстеры
Детектирование при длине волны 280 нм выявило, что у пшеницы (рис.4А) пик №1 имеет площадь 363,5 мм2, время удерживания 2мин., а 4-ый 32 мм2 ,время удерживания 6 мин. Для ячменя существенным оказался 1-й пик (рис.4Б) с площадью 99,2 мм2, а у монстеры (рис. 4В) 1-й пик имеет площадь 28,5 мм2 с временем удерживания 1,5 мин. Полученные результаты сведены в таблицу.
Таб лица 1 - Детекция пиков клеточного сока растений
с объект Длинна волны, нм Время удержания. мин П лощадь пиков. мм2 Соотношение площадей
1 Колеоптиль пшеницы 220 2,2 483 3,02
4,0 160
2 Колеоптиль ячменя 2,0 355 -
3 Лист монстерії Не обнаружено
4 Колеоптиль пшеницьы 240 2,0 516 9,21
6.0 56
5 Колеоптиль ячменя 2.0 54,6 -
6 Лист монстерьы 2,0 67,2 3,71
3,0 18,1
7 Колеоптиль пшеницьы 260 2,0 335 6,26
3.8 53,5
8 Колеоптиль ячменя 2,0 164,8 -
9 Лист монстерії 2,0 54,5 -
10 Колеоптиль пшеницьы 280 2,0 363,5 11,36
6,0 32,0
11 Колеоптиль ячменя 2,0 99,2 -
12 Лист монстерії 1,5 28,5 -
детектируются при длине волны 240 нм. Незначительно меньше (483) - при 220нм. 335 и 363 мм2 - при 260 - 280 нм. Время удерживания второго пика от 4,0 до 6,0 мин выявляет пик с максимальной площадью 160 мм2 при 220 и затухает по мере увеличения длины волны.
У колеоптиля ячменя максимальная площадь под пиком (355 мм2) детектируется при времени удерживания на хроматограмме 2 мин при 220 нм и 164,8 мм2 при260нм. Остальными пиками можно пренебречь.
В формирующихся листьях монстеры максимальная площадь под пиком (64,5 мм2) со временем удержания 2 мин. Обнаружена при детектировании 260нм.
Таким образом, на основании данных хроматографического анализа можно предполагать, что индуктор апоптоза, входящий в состав клеточного сока, выделенного из колеоптилей пшеницы, ячменя и формирующихся истьев монстеры, яв яется веществом белковой природы.
Литература
1.Бурштейн Э.А. Собственная люминесценция белка/ Биофизика. М.,1977, т.7, 187с.
2.Ванюшин, Б. Ф. Апоптоз у растений / Б. Ф. Ванюшин // Успехи биологической химии - 2001. -Т. 41. - С. 3-38.
3. Павловская Н.Е., Гагарина А.Ю. Индуцирование апоптоза в проростках гороха./ Вестник Орел ГАУ -2011-?6 с.128-131.
4.Павловская Н.Е., Гринблат А.И. Активные формы кислорода и апоптоз у пшеницы и гороха /Сельскохозяйственная биология, 2010,? 1, с.51-55.
5.Сааков В.С., Данилов А.Ф., Монтьев В.Г.
Спектрофотометрический ана из ароматических аминокислот, белков и биологически активных веществ методом второй производной./
Спектрофотометрические методы исследования в физиологии и биохимии. Сб. Научных трудов. Ленинград: «Наука», 1987, С. 76-96.
6. Сычев С.Н. Методы совершенствования хроматографических систем и механизмы удерживания в ВЖЭХ. Орел .-2000 -212с.
7. Фрайфельдер Д. Физическая биохимия. М. Мир. 1980, 582с.
8. Levine B. Eating oneself and uninvited guests: autophagyrelated pathways in cellular defense. Cell.2005. 120 : 159-162.
Из данных таблицы следует, что в клеточном соке колеоптилей злаков и формирующегося листа монстеры в области 220-280 нм обнаружен идентичный для всех объектов пик с временем удерживания 2,0 мин. Максимальная площадь под пиком у колеоптилей пшеницы равна 516 мм2 и
Вестник ОрелГ Ay
июнь
№3(30)
2011
Теоретический и научно-практический журнал. Основан в 2005 году
Учредитель и издатель: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Орловский государственный аграрный Университет»____________________________________________
Редакционный совет: Парахин Н.В. (председател ь) Амелин А.В. (зам. председателя) Астахов С.М.
Белкин Б.Л.
Блажнов А.А.
Буяров В.С.
Гуляева Т.И.
Гурин А.Г.
Дегтярев М.Г.
Зотиков В.И.
Иващук О.А.
Козлов А.С.
Кузнецов Ю.А.
Лобков В.Т.
Лысенко Н.Н.
Ляшук Р.Н.
Мама%в А.В.
Масалов В.Н.
Новикова Н.Е.
Павловская Н.Е.
Попова О.В.
Прока Н.И.
Савкин В.И.
Степанова Л.П.
Плыгун С.А. (ответств. секретарь) Ермакова Н.Л. (редактор)
Адрес редакции: 302019, г. Орел, ул. Генерала Родина, 69. Тел.: +7 (4862) 45-40-37 Факс: +7 (4862) 45-40-64 E-mail: nichоgau@yandex.ru Сайт журнала: http://ej.orelsau.ru Свидетельство о регистрации ПИ ?ФС77-21514 от 11.07. 2005 г.
Технический редактор Мосина А.И. Сдано в набор 14.05.2011 Подписано в печать 28.06.2011 Формат 60x84/8. Бумага офсетная. Гарнитура Таймс.
Объём 14,8 усл. печ. л. Тираж 300 экз.
Издател ьство Орел ГАУ, 302028, г. Орел, бульвар Победы, 19. Лицензия ЛР?021325 от 23.02.1999 г.
Журнал рекомендован ВАК Минобрнауки России д я публикаций научных работ, отражающих основное научное содержание кандидатских и докторских диссертаций
Содержание номера
Научное обеспечение развития селекции Амелин A.B., Кузнецов И.И., Чекалин Е.И. Особенности фотосинтеза в онтогенезе
различных по эколого-географическому происхождению сортов сои.................... 2
Зотиков В.И., Головина Е.В. Взаимосвязь интенсивности азотфиксации и фотосинтеза
у новых сортов сои северного экотипа............................................. 5
Фесенко А.Н., Бирюкова О.В., Фесенко И.Н., Шипулин O.A., Фесенко М.А.
Особенности динамики цветения растений мутантных морфотипов гречихи.............. 9
Новикова Н.Е., Фенин Д.М. Влияние морфотипа листа у гороха на показатели водного
обмена, определяющие устойчивость растений к засухе.............................. 13
Хатефов Э.Б., Кагермазов А.М., Кушхова P.C., Мадянова В.Н. Повышение
засухоустойчивости тетраплоидных популяций кукурузы.............................. 17
Резвякова C.B. Экологическое обоснование выбора режимов искусственного
промораживания плодово-ягодных культур в условиях ЦЧР............................ 26
Пикунова A.B. Использование молекулярных маркеров для оценки исходного
селекционного материала ягодных культур.......................................... 29
Сазонов Ф.Ф., Подгаецкий М.А. Потенциал продуктивности исходных форм и
гибридов смородины чёрной........................................................ 32
Ожерельева З.Е., Красова Н.Г., Галашева А.М. Потенциал устойчивости сортов яблони в зимний период......................................................... 35
Научное обеспечение развития растениеводства Лобков В.Т., Донская М.В., Васильчиков А.Г. Повышение эффективности
симбиотических систем нута (Cicer arietinum L.).................................. 39
Мельник А.Ф. Предшественник - основа повышения качества зерна озимой пшеницы... 43 Стебаков В.А., Лопачёв Н.А., Басов Ю.В., Наумкин В.Н. Эффективность
возделывания гречихи в условиях Центрально-Черноземного региона.................. 47
Титова Е.М., Внукова М.А. Применение водорастворимых комплексных удобрений на
посевах яровой пшеницы........................................................... 50
Половитсков В.А., Степанова Л.П., Коренькова Е.А. Влияние удобрительных форм и
сортовых особенностей на формирование корневой системы зернобобовых культур...... 51
Гурин А.Г., Кузяева O.C., Кожухов А.Д. Экономическая эффективность использования
фильтрата спиртовой барды в качестве нетрадиционного удобрения................... 56
Лысенко H.H., Прудникова Е.Г., Хилкова Н.Л., Чекалин Е.И. Влияние фунгицида
пропиконазол на растения яровых зерновых культур в условиях засухи и патогенеза.. 58
Догадина М.А. Агроэкологические аспекты снижения экотоксикологической нагрузки
поллютантов на окружающую среду.................................................. 64
Селезнев К.А., Плы1гун C.A. Прогноз продвижения стронциевой провинции в районе
водозаборов сельскохозяйственных предприятий Орловской области................... 69
Бессонова Е.А. Тенденции состояния сельскохозяйственных земель России............ 72
Методические вопросы развития сельскохозяйственной биотехнологии
Павловская Н.Е., Гагарина А.Ю. Хроматографический анализ факторов апоптоза в
растительных объектах............................................................ 75
Оскотская Э.Р., Басаргин H.H., Гаврин C.A. Определение Cd (II) в растительных объектах пос е предварите ьного концентрирования сорбентом по истиро -2-амино-
азо-2'-окси-5'-хлор-3'-сульфобензол.............................................. 78
Мищенко Е.В., Мищенко В.Я. Моделирование процесса экстракции пектиновых веществ из свекловичного жома с применением вибрационного воздействия.......... 80
Экономические аспекты развития аграрного сектора Савкин В.И. Эколого-экономическое управление аграрным производством - основа
устойчивого развития сельских территорий......................................... 82
Грищенков А.И. Генезис инноваций: основные теоретические аспекты................. 87
Мансуров Р.Е. Об экономической сущности понятия «конкурентоспособность
агропромышленного предприятия»................................................... 91
Гитинова Е.М. Совершенствование методов планирования и прогнозирования на
предприятиях АПК................................................................. 94
Сухочева H.A., Осипов А.Э. Новационная активность производства нетрадиционных
сельскохозяйственных культур - основа эффективной аграрной экономики............. 101
Каменева К.П. Система управления человеческим капиталом в аграрном секторе
экономики........................................................................ 106
Адук P.P. Управление инновационным развитием сельского хозяйства России.......... 111
© ФГОУ ВПО Орел ГАУ, 2011
