CC BY
61
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2010 Биология Вып. 1 (1)
УДК 612.018:612.017.1:611.018.53
ХОРИОНИЧЕСКИЙ ГОНАДОТРОПИН КАК РЕГУЛЯТОР ФЕНОТИПИЧЕСКОГО СОЗРЕВАНИЯ ИНТАКТНЫХ И ИНТЕРЛЕЙКИН-2-АКТИВИРОВАННЫХ NK- И NKT-КЛЕТОК
С. А. Заморинаа, О. Л. Горбуноваа, С. В. Ширшевa,b
а Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13, e-mail: [email protected]
b Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15, e-mail: [email protected]
Изучены эффекты хорионического гонадотропина (ХГ) на фенотипическое созревание натуральных киллеров (NK-клетки) и Т-клеток с функциями натуральных киллеров (NKT-клетки) в системе in vitro. Показано, что ХГ в дозах, характерных для беременности, выступает индуктором фенотипического созревания интактных CD3-CD16+56+NK- и CD3+CD16+CD56+NKT-клеток. Присутствие интерлейкина-2 (ИЛ-2) не изменяет направленность стимулирующего эффекта ХГ в отношении NKT-клеток, а в случае низкой дозы ХГ усиливает его эффект. В то же время, ХГ в высокой дозе отменяет NK-активирующее действие ИЛ-2.
Ключевые слова: репродуктивная иммунология, регуляция иммунитета, хорионический гонадотропин, NK- и NKT- клетки, фенотипическое созревание, цитотоксичность, цитокины
Объяснение причин толерантности иммунной системы матери к генетически чужеродному плоду является актуальной проблемой репродуктивной иммунологии, в рамках которой важнейшим направлением является анализ роли гормонов в регуляции иммунитета. Хорионический гонадотропин (ХГ) является ключевым гормоном с позиций сохранения и нормального развития беременности, одновременно обладая выраженным иммуномодулирующим действием (Ширшев, 2002).
В последнее время большое внимание уделяется исследованию функций клеток врожденного иммунитета, среди которых важную роль играют NK- и NKT- клетки.
NK-клетки - это клетки врожденной защиты, которые без предварительной иммунизации или активации могут распознавать и убивать аббе-рантные клетки-мишени и быстро продуцировать хемокины и цитокины, оказывающие защитные эффекты. Все NK-клетки крови делятся на две субпопуляции по уровням экспрессии молекул CD56 и CD16. Приблизительно 90% NK-клеток периферической крови экспрессируют низкие уровни CD56 (dim) и одновременно являются позитивными для CD16 (CD56dlmCD16+). CD16, в свою очередь, представляет собой низкоаффинный рецептор для Fc-фрагмента IgG1 и IgG3 (Fcy RIII) и участвует в обеспечении реакции антителозависимой клеточной цитотоксичности. Оставшиеся 10% NK-клеток экспрессируют высокие уровни
CD56 (bright) и не экспрессируют CD16 (CD56brigthCD16-) (Trundley, Moffet, 2004). Эти субпопуляции различаются функционально: так,
CD56dim NK-клетки обладают выраженной цитотоксичностью и имеют много цитолитических гранул, а CD56brlgth-клетки представляют собой раннюю стадию дифференцировки CD56dim и являются основными цитокинпродуцирующими NK-клетками (Cooper et al., 2001). Кроме того, именно NK-клетки принимают активное участие в деструкции неоплазм и аллотрансплантантов. Во время беременности и сразу после родов активность NK-клеток периферической крови существенно снижена (Baley, Schacter, 1985).
Натуральные киллерные Т-клетки (NKT) являются отдельной субпопуляцией Т-лимофцитов. Реализуя функции, свойственные NK-клеткам, они одновременно являются мощными продуцентами цитокинов (Collucci et al., 2003). При распознавании антигена молекулами TCR NKT-клетки продуцируют большое количество цитокинов, особенно интерлейкин-4 (ИЛ-4) и гамма-интерферон (IFN-y). Благодаря этим свойствам NKT-клетки принимают участие в отторжении опухоли, предупреждении аутоиммунных реакций, защите от паразитарных или бактериальных инфекций, а также в изменении профилей цитокинов Т-клеток в ответ на растворимые белковые антигены (Ширшев, 2009). NKT клетки способны распознавать антигены в комплексе с CD1d или молекулой главного
© С. А. Заморина, О. Л. Горбунова, С. В. Ширшев, 2010
77
комплекса гистосовместимости класса G (HLA-G), представленными на клетках плаценты, что может привести к аборту, а при повышении процента CD3+CD16+ клеток в I триместре беременности увеличивается риск развития гестоза (Борзова и др., 2005). Очевидно поэтому во время физиологически протекающей беременности функции NK/NKT клеток периферического пула супресси-рованы (Mahmoud et al., 2004; Clark et al., 2008).
В то же время, интерлейкин-2 (ИЛ-2) относится к ключевым цитокинам, инициирующим развитие специфического иммунного ответа. Хорошо известно, что ИЛ-2 усиливает цитотоксичность Т- и NK-клеток в отношении NK-чувствительных и NK-резистентных линий клеток-мишеней, и также опухолей и инфицированных вирусом клеток (Ширшев, 2009). Стимулированные ИЛ-2 NK-клетки трансформируются в лимфокинактивиро-ванные клетки (ЛАК-клетки), цитотоксические в отношении трофобластов (King, Loke, 1990). Известно, что в период беременности синцитиотро-фобласт, экспрессирующий ген ИЛ-2, секретирует данный цитокин в маточно-плацентарный компар-тмент (Boehm et al., 1989). Таким образом, в гемо-хориальной области клетки одновременно контактируют с ХГ и ИЛ-2, направленность эффектов которых может быть прямо противоположна.
Учитывая важную роль NK- и NKT-клеток при беременности как эффекторов неспецифической резистентности организма, целью работы являлась оценка фенотипического созревания этих клеток под воздействием ХГ, а также в условиях стимуляции клеток ИЛ-2.
Материалы и методы
В работе использовали суспензию мононукле-арных лейкоцитов периферической крови здоровых небеременных женщин в фолликулярной фазе менструального цикла. Мононуклеарные клетки получали центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/см3) (Petrof et al., 1980). Полученную суспензию (1х106 мл) после двойной отмывки раствором Хэнкса инкубировали в полной питательной среде (среда 199 с добавлением 10 mM HEPES; 2 mM Z-глутамина; 100 мкг/мл гентамицина и 10% ЭТС) с гормоном в течение суток при 370С в условиях 5% СО2.
ХГ в культуры вносили в дозах, соответствующим I и III триместру беременности (100 МЕ/мл и 10 МЕ/мл, соответственно). Рекомбинантный ИЛ-2 (“Sigma”, США) использовали в физиологической дозе 100 МЕ/мл, соответствующей его уровню при формировании иммунного ответа (Kurosaka et al., 2003).
После инкубации с гормоном супернатанты собирали, а клетки отмывали фосфатно-солевым буфером (0.01 М фосфат натрия, 0.145 М хлорид натрия, рН 7.2) и оценивали фенотип лимфоцитов методом проточной цитометрии. Жизнеспособность
клеток после суточной инкубации с гормоном, определяемая в тесте с эозином, составляла 95-98%.
Клетки окрашивали моноклональными антителами к соответствующим поверхностным антигенам согласно методике производителя (Beckman, Coulter, США). Оценивали экспрессию пар мембранных молекул с использованием двухпараметрических реагентов, меченных контрастными по цвету флуорохромами: флюоресцеинизотиоциона-том (FITC) и фикоэритрином (PE). Результаты учитывались на проточном цитофлюориметре EPICS XL (Beckman Coulter, США). Лимфоцитарное окно (гейт) выставляли на основе комбинации прямого и бокового светорассеивания и размера клеток. При учете результатов подсчитывали не менее 10000 клеток. Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного по флюоресценции лимфоцитарного окна использовали соответствующие изотипические контроли.
Определяли содержание NK-клеток с фенотипом CD3-CD16+CD56+ (CD3-FITC/CD 16,56-PE) и NKT-клеток с фенотипом CD3+CD16+CD56+ (CD3-FITC/CD16,56-PE), согласно стандартным процедурам окрашивания поверхностных маркеров. Статистическая обработка данных проводилась с помощью парного /-критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Установлено, что ХГ в дозах, соответствующих I и III триместру беременности, повышает количество CD3-CD16+56+Nк-клеток (табл. 1). Как было сказано выше, субпопуляция NK-клеток периферической крови представлена CD16+CD56+ (CD16+CD56dim) и CD16-CD56+ (CD16-CD56bnght) NK-клетками, причем NK-клетки с фенотипом CD16+56+ обладают наибольшей цитолитической активностью (Mittag et al., 2005). Таким образом, эффекты гормона направлены на изменение экспрессии молекулы CD16 на CD56+ NK-клетках, что ассоциировано с регуляцией их цитотоксиче-ского потенциала.
Установлено, что ИЛ-2 оказывал достоверный стимулирующий эффект на количество NK-клеток, более чем в два раза повышая их количество. Известно, что стимулированные ИЛ-2 NK-клетки трансформируются в ЛАК-клетки, цитотоксиче-ские в отношении трофобластов (King, Loke, 1990). Гормон при совместном внесении с ИЛ-2 сохранял свое стимулирующее действие в отношении NK-клеток. Однако, стимулирующий эффект высокой дозы ХГ совместно с ИЛ-2 был ниже, чем самостоятельный эффект ИЛ-2 (табл. 1).
Таким образом, ХГ оказывает стимулирующий эффект на фенотипическое созревание NK-клеток, но в высокой дозе отменяет ЛАК-трансформирую-щее действие ИЛ-2. Важно отметить, что снижение уровня ЛАК-клеток способствует успешному развитию беременности и, по-видимому, является еще одним механизмом, при помощи которого ХГ реа-
Хорионический гонадотропин как регулятор фенотипического созревания ... клеток 79
лизует свои множественные регуляторные и фетопротекторные эффекты. В то же время, повышение содержания NK-клеток под действием ХГ, вероятно, связано как с необходимостью увеличения пула CD16+CD56+ NK-клеток периферической крови в связи с последующей их миграцией в децидуальную оболочку, так и направлено на защиту матери и эмбриона от микробной атаки и малигнизации клеток трофобласта.
Таблица 1
Влияние ХГ и ХГ совместно с ИЛ-2 на уровень NK-клеток CD3"CD16+CD56+
Исследуемый показатель n NK-клетки CD3-CD16+CD56+
Контроль 5 7.86 ± 1.G4
ХГ (1G МЕ/мл) 5 13.24 ± 1.29 p=G.GGG5*
ХГ (1GG МЕ/мл) 5 13.11 ± 1.26 p=G.GG55*
ИЛ-2 (1GG МЕ/мл) 5 18.3G ± 2.91 p=G.GG5*
ХГ (1G МЕ/мл) + ИЛ-2 (1GG МЕ/мл) 5 16.45 ± 1.57 p=G.GGG6*
ХГ (1GG МЕ/мл) + ИЛ-2 (1GG МЕ/мл) 5 11.85 ± 1.69 p=G.G1* р=0.012л
Здесь и в табл. 2 *достоверные (p<0,05) отличия по t-критерию Стьюдента с контролем; лв сравнение с ИЛ-2; #в сравнении с ХГ.
Показано, что ХГ независимо от дозы увеличивает процент CD16+CD56+NKT-клеток. ИЛ-2 не оказывал самостоятельного эффекта в отношении этих клеток. Гормон при совместном внесении с ИЛ-2 сохранял свое стимулирующее действие в отношении NKT-клеток (табл. 2).
Таблица 1
Влияние ХГ и ХГ совместно с ИЛ-2 на уровень NKT-клеток CD3+CD16+CD56+
Исследуемый показатель n NKr-клетки CD3+CD16+CD56+
Контроль 5 1.38 ± G.27
ХГ (1G МЕ/мл) 5 3.33 ± G.786 p=G.GG3*
ХГ (1GG МЕ/мл) 5 4.18 ± G.73 p=G.GG7*
ИЛ-2 (1GG МЕ/мл) 5 1.73 ± G.27
ХГ (1G МЕ/мл) + ИЛ-2 (1GG МЕ/мл) 5 5.59 ± G.616 p=G.GG1* p=0.0005л p=G.GG5#
ХГ (1GG МЕ/мл) + ИЛ-2 (1GG МЕ/мл) 5 5.61 ± 1.52 p=0.002* р=0.009л
Важно отметить, что в случае совместного стимулирующего эффекта низкой дозы ХГ (10 МЕ/мл) и ИЛ-2, эти агенты выступают как костимуляторы. Таким образом, присутствие ИЛ-2 не изменяет на-
правленность стимулирующего эффекта ХГ, а в случае низкой дозы ХГ усиливает его эффект.
Известно, что формирование фенотипа CD16+CD56+NKT-клеток является терминальной стадией активации NKT-клеток и связано с максимальной цитотоксической активностью (Ou et al., 2002). Таким образом, гормон выступает индуктором фенотипического созревания NKT-клеток. Кроме того, NKT-клетки составляют субпопуляцию регуляторных Т-лимфоцитов, которые наряду с дендритными клетками играют ведущую роль в Th1/Th2 девиации и формировании периферической толерантности (Boyson et al., 2002). Известно, что NKT-клетки периферической крови имеют большое значение в период имплантации, индуцируя цитокиновое окружение Th2-rarn (Boyson et al., 2002). Таким образом, выявленные эффекты ХГ в отношении CD16+CD56+ NKT-клеток являются одним из возможных механизмов участия гормона в поддержании баланса цитокинов и периферической толерантности при беременности.
В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что ХГ способствует фенотипическому созреванию NK- и NKT-клеток, ассоциированному с усилением их цитотоксической активности. В условиях активации NKT-клеток ИЛ-2 стимулирующий эффект ХГ сохранялся. В то же время, ХГ, оказывая стимулирующий эффект на фенотипическое созревание NK-клеток, в высокой дозе отменяет NK-активирующее действие ИЛ-2.
Работа поддержана программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и молодежным научным грантом Уральского отделения РАН.
Библиографический список
Пат. 2265221 Российская Федерация. Способ прогнозирования гестоза легкой степени тяжести с ранних сроков беременности / Борзова Н.Ю., Панова И.А., Скрипкина И.Ю., Сотникова Н.Ю., Кудряшова А.В. Приоритет изобретения
05.01.2004. Зарег. в Госреестре изобр.
10.06.2005.
Ширшев, С.В. Механизмы иммуноэндокринного контроля процессов репродукции / С.В. Ширшев. Екатеринбург: УрО РАН, 2002. Т. 2. 557 с Ширшев, С.В. Иммунология материнско-фетальных взаимодействий / С.В. Ширшев. Екатеринбург: УрО РАН, 2009. 582 с.
Baley, J.E. Mechanisms of diminished natyral killer cell activity in pregnant women and neonates / J.E. Baley, B.Z. Schacter // J. Immunol. 1985. Vol. 134. P. 3042-3048.
Boehm, K.D. The interleukin 2 gene is expressed in the syncytiotrophoblast of the human placenta / K.D. Boehm, M.F. Kelley, J. Ilan // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1989. Vol. 86, № 2. P. 656-660.
Boyson, J.E. CD1d and invariant NKT cells at the human maternal-fetal interface / J.E. Boyson, B.
Rybalov, L.A. Koopman [et al.] // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99. P. 13741-13746.
Clark, D.A. CD200-dependent and nonCD200-dependant pathways of NK cell suppression by human IViG / D.A. Clark, K. Wong, D. Banwatt [et al.] // J. Assist. Reprod. Genet. 2008. Vol. 25.
P. 67-72.
Collucci, F. What does it take to make a natural killer?
/ F. Collucci, M.A. Caligiuri, J.P. Di Santo // Nature Rev. Immunol. 2003. Vol. 3. P. 413-425.
Cooper, M.A. Human natural killer cells: a unique innate immunoregulatory role for the CD56brigth subset / M.A. Cooper, T.A. Fehinger, S.C. Turner [et al.] // Blood. 2001. Vol. 97. P. 46-51.
King, A. Human trophoblast and JEG choriocarcinoma cells are sensitive to lysis by IL-2 stimulated decidual NK-cells / A. King, Y.W. Loke // Cell. Immi-nol. 1990. Vol. 129. P. 435^48.
Kurosaka, K. Silent cleanup of very early apoptotic cells by macrophages / K. Kurosaka, M. Takaha-shi, N. Watanabe, Y. Kobayashi // J. Immunol.
2003. Vol. 171. P. 4672-4679.
Mahmoud, F. Effect of IgG therapy on lymphocyte subpopulations in the peripheral blood of Kuwaiti
Human chorionic gonadotropin as a regulator of phenotypic maturation of intact and interlcukin-2-activated NK-, and NKT-cells
S.A. Zamorina, candidate of biology, leading scientist
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str, Perm, Russia, 614081; [email protected]; (342)2446712
O.L. Gorbunova, candidate of biology, research scientist
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str, Perm, Russia, 614081; [email protected]
S.V. Shirshev, doctor of medicine, professor
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms, Ural Branch, Russian Academy of Sciences. 13, Golev str, Perm, Russia, 614081; [email protected]
Perm Siate University. 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; [email protected]
Effects of human chorionic gonadotropin (hCG) on phenotypic maturation of natural killers (NK-cells) and T-cells with the functions of natural killers (NKT-cells) were studied in vitro. It was shown that hCG in doses typical of those in pregnancy acted as the inducer of maturation of intact СЭЗС016+56^ЫК-, and С03+С016тС056^КТ-се1Ь. Under cell activation by interleukin-2 (IL-2) the hormone effects were reproduced at the NKT-cell level. However, hCG in high dose was found to abolish NK-promoting effect of IL-2.
Key words: reproductive immunology; immune regulation; chorionic gonadotropin; NK- and NKT-cells; phenotypic maturation; cytotoxicity; cytokines.
Заморина Светлана Анатольевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
Горбунова Ольга Леонидовна, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник ГУ РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
Ширшев Сергей Викторович, доктор медицинский наук, профессор, зав. лабораторией ГУ РАН «Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН»
ГОУВПО «Пермский государственный университет»
women experiencing recurrent pregnancy loss / F. Mahmoud, M. Diejomaoh, A. Omu [et al.] // Gynecol. Obstet. Invest. 2004. Vol. 58, № 2. P. 77-83.
Mittag, A. Polychromatic (eight-color) slide-based cytometry for the phenotyping of leukocyte, NK, and NKT subsets / A. Mittag, D. Lenz, A.O. Gerstner [et al.] // Cytometry. 2005. Vol. 65. P. 103-115.
Ou, D. Beta-cell antigen-specific CD56(+) NKT cells from type 1 diabetic patients: autoaggressive effector T cells damage human CD56(+) beta cells by HLA-restricted and non-HLA-restricted pathways / D. Ou, D.L. Metzger, X. Wang [et al.] // Hum. Immunol. 2002. Vol. 63. P. 256-270.
Pertof, H. Separation of human monocytes on density gradients of Percoll / H. Pertof, A. Johnsson, B. Warmegard, R. Seljelid // J. Imminol. Methods. 1980. Vol. 33. P.221-229.
Trundley, A. Human uterine leukocytes and pregnancy / A. Trundley, A. Moffet // Tissue antigens. 2004. Vol.63. P. 1-12.
Wide, L. An immunological method for the assay of human chorionic gonadotrophin / L. Wide // Acta Endocrinol. (Kbh). 1962. Vol. 41, Suppl. 70. P. 1100.
Поступила в редакцию 28.03.2010
